“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。
2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。
3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细
胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴
有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。
6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml
淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml 离心管中，去除红
细胞，此时可以取胸腺。(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，
取沉淀，弃上清，重复清洗2次。（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106个/ml备用。
1、淋巴细胞的来源： 人淋巴细胞的方便来源是外周血 分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。 根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。 分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 2、密度梯度离心法： 外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 3、实验方法： 1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2） 2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2） 3、20℃，1500r/min，离心30min 从上一次至下 稀释的血浆、血小板 PBMC Ficoll 红细胞、粒细胞 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。 5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心10min ，弃上清。 6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。 7.适量的培养基重悬细胞，计数。
分离单个核细胞纯度为95% 淋巴细胞约占90%～95% 4、淋巴细胞高纯度化 (一)红细胞的去除 一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 (二)血小板的去除 将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。 在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1．粘附去除法 原理：单核细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。 优点：简便易行，对细胞损伤极少。 缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。 该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。 2．羰基铁粉吞噬法 原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。 方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。 方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。 3．苯丙氨酸甲酯去除法 原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。 用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。 该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。
近年来白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一。早年曾用过的荧光显微镜或APAAP方法基本被废弃。国际上公认的通用的方法是流式细胞术（FCM）。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作分子探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 1．流式细胞仪诊断白血病的依据 ⑴FCM能快速，多参数，客观的定性又定量测定细胞膜、浆、核的抗原表达 ⑵至今尚未发现白血病的特异抗原。 ⑶能用正常血细胞的单抗来进行免疫分型是基于白血病形成的分化阻断学说。即白血病细胞基因异常，分化受阻于某阶段形成不同亚型的白血病。这群细胞充盈于骨髓。正常血细胞从多能干细胞分化、发育、成熟为功能细胞的过程中，细胞膜、细胞浆或胞核抗原的出现、表达增多与减少甚至消失与血细胞的分化发育阶段密切相关，而且表现出与细胞系列及其分化程度相关的特异性。因此，这些抗原的表达与否可作为鉴别和分类血细胞的基础。白血病是造血系统的恶性肿瘤，在形态上变化虽相当大，但仍能表达正常血细胞所具有的抗原，因而仍可依据其抗原的表达谱对白血病进行免疫分型。 2．流式细胞仪诊断白血病的意义 ⑴骨髓血细胞是形态学分型的基础，FCM白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对下列情况意义更大：①用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。②形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。⑤慢性淋巴细胞白血病。⑥微小残留白血病。 ⑵临床预测；可根据抗原的表达情况预测病情的预后：如白血病患者有CD7+与CD34+共表达，预后不好。 ⑶疾病监测：可监测病程的发展，疗效，可进行微小残留白血病的检测。 二、免疫分型常用的免疫标志及其意义 1．白血病系列分化抗原 T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。 髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。 红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。 巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。 2．白血病系列非特异性抗原 CD34、HLA－DR为早期细胞抗原，无系列特异性，可与CD38联合运用于免疫分型。一般而言，干/祖细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始细胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚细胞（如早幼粒细胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。 3．白血病分化阶段抗原 T细胞抗原CD4、CD8。 B细胞抗原：CD10、Cyμ（胞浆μ链）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞浆免疫球蛋白）、CD11C。 4．白细胞共同抗原 CD45为白细胞共同抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。用SSC/CD45 PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞。用两个系列或阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色，经FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五参数分析，可特异地分析原幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰。
实验目的：验证小鼠在接受抗原之后机体产生了特异性免疫反应，并观察小鼠各项生理指标以及免疫器官的反应状况，再观察T细胞和B细胞在此应答的反应状况。 实验假设：小鼠免疫灭活疫苗之后，机体会逐渐产生特异性免疫应答，一方面T 细胞在接受抗原刺激之后，经过阳性和阴性选择，T细胞从CD4，CD8双阳性选择为单阳性T细胞，并逐步转移，最终到达淋巴结等组织产生效应；另一方面，B细胞也会发育分化为浆细胞和记忆细胞，相应的浆细胞产生抗体以应对抗原。由于小鼠在接受抗原之后，免疫细胞在胸腺和脾脏内的数量和种类将发生变化，另外小鼠血清中也会产生相应的抗体。 因此假设，在排出其他偶然因素引起的误差的情况下，有以下结果： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。预期结果： 预计结果与假设一致，即： 1. 免疫后的小鼠胸腺大小比对照组更小，脾脏大小比对照组更大；另外免疫后小鼠的淋巴结比对照组更大。 2. 免疫后的小鼠胸腺免疫细胞数量小于对照组，脾脏免疫细胞数量大于对照组。 3. 免疫后小鼠胸腺中的单阳性淋巴细胞比对照组单阳性淋巴细胞更多，双阳性淋巴细胞比对照组更少；免疫后小鼠的脾脏中单阳性淋巴细胞数量多于对照组单阳性淋巴细胞数量。 4. 免疫后小鼠血清里面的抗体检测呈阳性，对照组小鼠血清抗体检测呈阴性。实验方法：
小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液说明书 【产品规格】200ml/Kit 【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下： 名称 产品编号 规格200ml 200ml 200ml 200ml 1份 A B C D E 小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液样本稀释液（赠品）清洗液（赠品）2010C11192010X1118F2013TBD F 液（赠品）说明书 【实验前准备】A ．适用仪器 最大离心力可达1200g 的水平转子离心机B ．耗材 产品名称产品货号339650339651339652339653 产地15ml 离心管散装美国NUNC 15ml 离心管架装美国NUNC 美国NUNC 美国NUNC 50ml 离心管散装50ml 离心管架装无菌胶头滴管或塑料滴管【检验方法】 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。1.首先制备组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。 2.取一支15ml 离心管，加入与组织单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于 3ml ）。 3.用吸管小心吸取组织单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g ，离心20-30min 。（注： 根据组织单细胞悬液量确定离心条件，组织单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。
4.离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色淋 巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。 5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入 10ml清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。 6.250g，离心10min。 7.弃上清。 8.用吸管以5ml清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。 9.250g，离心10min。 10.重复7、8、9，弃上清后以0.5ml后续实验所需相应液体重悬细胞。 【注意事项】 1.全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样2h内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h后分离效果更差甚至不能达到分离目的。 2.本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离 心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。 3.吸取过多的淋巴细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。 4.分离液用量大于组织单细胞悬液样本时，分离效果更佳。 5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系上海研谨生物以获得技术支持。 【储存条件及有效期】 18-25℃保存，有效期2年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 【参考值（参考范围）】 本实验淋巴细胞提取率及纯度大于80%。 下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。 红细胞白细胞血小板 （4.0-10.0）×109 含量（个/L）（4.0-5.5）×1012（1.0-3.0）×1011 中性粒细胞淋巴细胞单核细胞
人脐血及骨髓淋巴细胞免疫表型的比较及其意义 郭 荣,邹 萍,邹典斌1 (华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,武汉430022; 1郑州大学医学院第一附属医院血液科,郑州450052) 摘要 为比较脐血和骨髓淋巴细胞及祖细胞分化抗原,通过流式细胞术(FCM)双标法对38份脐血及10份骨髓免疫细胞表型进行了分析研究。研究发现:①脐血及骨髓淋巴细胞中均测到幼稚淋巴细胞(CD3-CD4+),且前者中含量较多,但脐血细胞毒T细胞含量(CTL,CD3+CD16+56+)低于骨髓;②脐血中N K细胞(CD3-CD16+56+)比例高于骨髓;③脐血有核细胞中CD34+细胞的比值接近于骨髓,但脐血CD34+细胞中髓系祖细胞(CD34+ CD13+,CD34+HLA2DR+)及淋巴系祖细胞(CD34+CD19+)含量均低于骨髓。结论:①脐血免疫细胞具有不成熟性,这估计是脐血移植后GVHD程度轻的主要原因;②脐血淋巴细胞中N K细胞含量较高,推测脐血移植后移植物抗白血病效应(GVL)并不会降低;③脐血CD34+细胞中髓系祖细胞及淋巴系祖细胞比例均低于骨髓,可能是脐血移植后造血及免疫重建速度较慢的原因之一。 关键词 脐血;骨髓;淋巴细胞;免疫表型 中图分类号 R33111;R331.2 A Comparison bet w een Immunophenotypes of Lymphoid Cells from H uman Umbilical Cord Blood and Bone Marrow and Its Signif icance GUO Rong,ZOU Ping,ZOU Dian2Bin1 (Instit ute of Hematology,The A f f iliated U nion Hospital,Tongji Medical College,Huaz hong Science and Technology U niversity, W uhan430022,Chi na;1Depart ment of Hematology,The Fi rst A f f iliated Hospital of Medical College of Zhenz hou U niversity, Zhenz hou450052,Chi na) Abstract To compare the expression of CD antigens on immune cells from umbilical cord blood(UCB)and bone marrow(BM)and analyze its clinical significance,the phenotypes of lymphoid cells and nucleated cells from38UCB and 10BM samples were investigated by flow cytometry with double labeling monoclonal antibodies.The results showed that the immature lymphocytes(CD3-CD4+)were detedcted in UCB and higher than those in BM;cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD16+CD56+)in UCB were significantly lower than those in BM.N K cells(CD3-CD16+CD56+)in UCB were higher than those in BM.The ratio of CD34+cells in nucleated cells of UCB was similar to that of BM,however,both the contents of myeloid(CD34+CD13+and CD34+HLA2DR+)and lymphoid(CD34+CD19+)progenitor cells in UCB were lower than those in BM.It is concluded that the immune cells in UCBpossess immaturity,which might lead to mild GVHD after UCB trans plantation.It is infered from the higher ratio of N K cells in UCB,GVL will not decrease after UCB transplantation.The lower contents of myeloid and lymphoid progenitor cells in UCB probably accounted for the slow hematopoiesis and immune reconstitution following UCB transplantation. K ey w ords umbilical cord blood;bone marrow;lymphoid cell;immunophenotype 脐血具有经济、来源广、采集方便、无采集并发症,移植后移植物抗宿主病(graft versus host dis2 ease,GV HD)程度轻,移植物抗白血病(graft versus leukemia,GVL)效应不降低等优点。但是脐血也存在造血重建速度慢,易合并感染的问题。本研究应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对脐血和骨髓免疫细胞分化抗原进行检测,比较二者在淋系祖细胞、髓系祖细胞、幼稚淋巴细胞及N K细胞含量方面有无差别,旨在分析二者免疫表型差异,探讨其在扩大脐血应用范围中的作用和意义。 材料与方法 标本采集 无菌条件下采集正常足月分娩新生儿脐血38份。母亲年龄24-35岁,平均(29.3±3.3)岁。新生儿娩出后,立即(不超过30秒)用止血钳在距脐轮2-3cm处夹住脐带,在两钳间剪断脐带,用含少许肝素的注射器抽取脐血,加入离心管中混匀。骨髓 通讯作者:郭荣 电话:(027)85730575.E2mail:gh7311@yahoo. https://www.doczj.com/doc/628388477.html, ? 9 1 5 ? 中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(6):519-522
2013版WHO软组织肿瘤免疫表型大全2014-11-06艾迪康病理诊断 主要根据2013年“WHO肿瘤分类——软组织和骨肿瘤”翻译而来 第1章脂肪细胞肿瘤（adipocytictumours） 良性 1、脂肪瘤（lipoma） 免疫表型：成熟脂肪细胞表达S-100、leptin和HMGA2阳性。 2、脂肪瘤病（lipomatosis） 免疫表型：和正常脂肪相似。 3、神经脂肪瘤病（lipomatosisof nerve）
免疫表型：因为病变的所有成分均存在于正常神经内，故免疫组化对诊断没有帮助。 4、脂肪母细胞瘤（lipoblastoma）/脂肪母细胞瘤病（lipoblastomatosis）免疫表型：脂肪细胞表达S-100和CD34，原始间叶细胞常表达desmin。 5、血管脂肪瘤（angiolipoma） 免疫表型：血管内皮成分CD31等内皮标记阳性，细胞性血管脂肪瘤增生的梭形细胞CD31阳性，证明为血管内皮。 6、软组织平滑肌脂肪瘤（myolipomaof soft tissue） 免疫表型：梭形细胞SMA和desmin染色弥漫强阳性，证明为平滑肌分化；ER 和PR阳性也有报道；HMB-45阴性。 7、软骨样脂肪瘤（chondroidlipoma） 免疫表型：成熟脂肪细胞S-100强阳性，脂肪母细胞S-100弱阳性，随脂肪细胞逐渐成熟S-100染色逐渐增强。无脂肪母细胞分化特征的细胞S-100阴性。少数病例角蛋白阳性，但EMA一致阴性。 8、梭形细胞脂肪瘤/多形性脂肪瘤（spindlecell lipoma/pleomorphic lipoma） 免疫表型：梭形细胞脂肪瘤和多形性脂肪瘤中的梭形细胞均为CD34强阳性， S-100罕见阳性，偶见desmin阳性。
免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取 一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。 二、实验原理 脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。一般来讲，脾脏有三大功能： 首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量； 其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉； 此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。 我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。 小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。 三、实验器材 KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械 四、实验步骤 1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS 冲洗，制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。
中国人血液淋巴细胞免疫表型参考值调查 来源:https://www.doczj.com/doc/628388477.html,时间:2007-10-06 字体:[大中小] 收藏我要投稿 文章出处：朱敏转载请注明出处 【摘要】目的建立健康中国成人血液淋巴细胞免疫表型分析参考值。方法用Simultest IMK-Lymphocyte试剂盒的荧光抗体对102例健康中国成人血液进行染色，以FACSort流式细胞仪进行分析，Simulset程序获取数据并分析结果，SPSS软件进行统计。结果18～65岁健康中国成人淋巴细胞参考值范围CD+3细胞是50%～84%（955～2 860/μl），CD-3CD+19细胞为5%～18%(90～560/μl)，CD+3CD+4细胞为27%～51%(550～1 440/μl)，CD+3CD+8细胞为15%～44%(320～1 250/μl)，CD-3、CD+16和/或CD+56细胞为7%～40%(150～1 100/μl)，CD+3CD+4/CD+3CD+8比值为0.71～2.87。随着年龄增长CD+3CD+4细胞略有升高，CD+3CD+8细胞略有降低。NK细胞在大年龄组女性低于男性，且有统计学差异(P＜0.05)。与高加索人和美国人相比，中国人的CD+3CD+8细胞和NK细胞(CD-3，CD+16和/或CD+56)的相对值(百分率)与绝对值均高，CD-3CD+19细胞和CD+3CD+4细胞仅相对值较低，但绝对值不少。CD+3CD+4/CD+3CD+8比值向低值漂移。结论种族、性别、年龄和环境因素可影响健康人淋巴细胞表型分布。 Reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adult Zhu Lihua, Wang Jianzhong, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing,100034 【Abstruct】Objective To establish the reference values on blood lymphocyte immunophenotype in healthy Chinese adults.Method Staining whole blood with fluorescein-conjugated monoclonal antibodies supplied by simultest TM IMK lymphocyte kit, we analyzed 102 healthy Chinese residents (age range 18～65 years) by FACSort flow cytometer, acquired results by Simultest programme, and performed statistical analysis by SPSS software.Results The 95% reference ranges in absolute counts per microliter of whole blood (percentage of lymphocytes) for CD+3, CD+3CD+4, CD+3CD+8, CD-3CD+19, CD-3/CD+16 and/or CD+56 cells were 955 to 2 860 (50% to 84%), 550 to 1 440 (27% to 51%), 320 to 1250 (15% to 44%), 90 to 560 (5% to 18%), 150 to 1 100 (7% to 40%) respectively. The CD+3CD+4/CD+3CD+8 ratio was 0.71 to 2.87. CD+3CD+4 cells increased and CD+3CD+8 cells decreased slightly with age. Women were compared to men in old age group, NK cells (CD-3/CD+16 and/or CD+56) were lower (P＜0.05). Compared with Caucasians and Americans, Chinese had higher percentage and absolute numbers of CD+3CD+8 and NK cells, but had lower percentage of CD-3CD+19 and CD+3CD+4 cells without absolute number change. So CD+3CD+4/CD+3CD+8ratio skew to the lower values.Conclusion The race, age and environment could influence the reference value of lymphocyte immunophenotype. 【Key words】Lymphocyte immunophenotype Reference value Flow cytometry 淋巴细胞免疫表型分析在原发或获得性免疫缺陷病、自身免疫性疾病的辅助诊断和移植免疫的监测中具有重要作用。随着流式细胞仪的广泛应用，采用流式细胞术进行淋巴细胞免疫表型分析已逐渐成为临床检验的常规工作之一。各国的流式细胞术实验室均建立了自己的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨。目前我国还没有用流式细胞术、采用双染色分析淋巴细胞免疫表型参考值的报告。为此我们对102例健康成人进行了淋巴细胞免疫表型分析，现报告如下。材料和方法 一、研究对象 102例标本均取自于无免疫性疾病、无现症、不吸烟、体检健康、血细胞计数及肝、肾功能检查正常的成人。年龄18～65岁，其中男性54人，女性48人。首先按男女性别分为两大组，每组中又以40岁为界，≤40岁者为小年龄组（男24人，女19人），＞40岁者为大年龄组（男30人，女29人）。
小鼠免疫 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一。即用目的抗原免疫小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。 一、血清效价的影响因素 小鼠免疫效价的高低直接影响单抗的制备。单抗免疫程序不同，包括免疫用的动物，抗原的性质、抗原量、免疫途径、免疫间隔时间、是否应用佐剂均会影响免疫效果。 二、免疫材料 1．免疫用的动物 抗原与免疫动物种属差异越远越好，小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：1）小鼠易操作；2）多个纯系株易得到且价格合理；3）有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；4）小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答；5）小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合。 2．免疫原（抗原） 颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、?细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。 可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，?应先制备成人工免疫原，再加佐剂。 免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱，因此选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途，并应该根据其用途决定何种方法筛选抗体
更合适。一般认为，影响免疫血清中lg亚类谱的因素主要包括免疫原、接种途径、佐剂和动物遗传背景等。且主要由初次基础免疫所决定，加强免疫的作用主要是提高特异性抗体的滴度。 3．佐剂 目的：1）增强抗原对机体的免疫原性；2）增强抗体的产生能力；3）为制备出高效价的免疫血清；4）增强可溶性抗原的免疫原性；5）在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；6）延长抗原在免疫动物的时间；7）改变抗原的分布；8）增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。 种类：氢氧化铝佐剂、明矾佐剂（常用于肌肉、皮下注射）、弗氏佐剂。 弗氏佐剂是最主要的免疫佐剂，热处理杀死的分歧杆菌可以引起炎症反应，募集淋巴细胞到抗原沉积部位，但若重复刺激可导致肉芽肿的形成，故不能重复使用。 三、免疫策略 1．免疫途径 途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性。有静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、脾内注射、皮下注射、淋巴结注射等。 脾内免疫会产生IgM 类抗体，分泌该类抗体的杂交瘤细胞株相对IgG 类较不稳定，且IgM 类抗体的一些性质测定会有困难，一般不建议使用。脾内免疫操作困难，实验动物极易死亡，所以也不常用此种方法。 一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 2．免疫方案 典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。
急性淋巴细胞白血病免疫表型特点及其 临床意义 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的为探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫表型特征及与治疗的关系。方法采用流式细胞仪对77例ALL患者进行免疫表型分析。结果① 77例ALL中L1型44.16%，L2型50.65%，L3型 5.19%;B淋巴细胞性ALL(B-ALL)80.52%，T淋巴细胞性ALL(T-ALL)15.58%。② 77例ALL中髓系抗原(My)阳性率为57.14%;其中表达CD13的阳性率最高，为84.09%，其次为CD33和CD15;My+ B-ALL占B-ALL的58.06%，My+ T-ALL占T-ALL的50%，两组比较差别无统计学意义(P0.05);My+ ALL组CR率为81.82%，略低于My-ALL 组(88.24%)，但差异无统计学意义(P0.05)。③ CD34表达阳性率为49.35%，B-ALL中为56.45%，明显高于T-ALL的25%(P0.05);My+ ALL 中CD34表达阳性率为71.05%，高于My-ALL的33.33%(P0.05);CD+34 ALL组CR率为76.47%，低于CD-34ALL组的90.91%，但差异无统计学意义(P0.05)。结论 ALL免疫分型与FAB分型变化无相关性;My+ ALL 患者中CD34表达阳性率高于My-ALL患者;CD34和髓系抗原的表达与CR率无相关性。
【关键词】急性淋巴细胞白血病;免疫表型 急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的免疫分型对其诊断、治疗及预后判断有重要意义，而ALL不同的恶性克隆来源存在着显著不同的生物学特征及预后因素。为进一步探讨ALL各亚型免疫表型的特点及其与预后的关系，我们对本院77例ALL患者资料进行了研究，现报告如下。 1 资料和方法 1.1 病例资料 宁夏医科大学附属医院血液科及儿科2002-2008年间的住院初治ALL患者77例。男54例，女23例，年龄2.2～72岁，其中14岁儿童患者42例，中位年龄5.6岁，≥14岁患者35例，中位年龄23岁。所有病例均根据临床表现、骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫分型而确诊。细胞形态学诊断根据FAB分型标准[1]，对于免疫分型诊断ALL又同时存在髓系抗原表达阳性，但又不够急性混合细胞白血病诊断标准，视为伴髓系抗原表达的ALL(My+ ALL)[2]。 1.2 免疫表型分析 受检者抽取骨髓或外周血经肝素抗凝，采用活细胞三色免疫荧光法标记，流式细胞仪检测，通过二维点图分析抗原表达情况。流式细胞仪型号为FACS Calibur，美国Becton-Dickinson公司生产，所用单克隆抗体亦均为美国BD公司产品。B淋巴细胞系单抗：CD10、CD19、CD20、CD22;T淋巴细胞系单抗：CD3、CD5、CD7;髓系单抗：CD13、CD14、CD15、CD33、CD117;造血干/祖细胞单抗：CD34。结果判定用
1材料与方法 1. 1. 2 主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640 培养 液( 含L-谷氨酰胺，)、Hanks 液( HyClone)、MTT 试剂、 PBS 缓冲溶液( pH 值7. 2 ～ 7. 4，HyClone)、丝裂霉素C、SA 缓冲液，绵羊红细胞，补体( 豚鼠血清)、都氏试剂、LDH 基质液、 P815 细胞( 购于协和医科大学基础医学细胞中心)、YAC-1 细 胞、FITC-Anti-CD3、PE-Anti-CD4、PerCP-Anti-CD8 荧光抗体)。 1. 2 动物与分组 Balb /C 小鼠90 只，雌性，6 ～ 8 周龄，体重18 ～ 22g。颗粒饲料，室温(22 ± 2)℃，湿度60% ～ 80% 。 动物在实验室条件下检疫1 周后，实验分为3 项处理进 行，(1) 处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数;(2) 处理二: 测定NK 细胞活性，细胞毒性T 细胞活性;(3) 处理三:测定血 清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1 组和 CTX-2 组。 1. 3 实验方法和测定指标 1. 3. 1 剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX 的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1 组的 CTX 剂量，即60 mg / kg 环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给予。CTX-2 组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg 环磷酰胺［2，3］( 用蒸馏水配制)。另设空白对照组，蒸馏水代替受试物，每日经口给予。动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4 周 后测定各项免疫指标。 1. 3. 2 血液中T、B 淋巴细胞分类计数［4］动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3 支流式试管进行 测定，每管加入50μl 抗凝血。分别在3 管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加 入2ml FACS 红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r / min 离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min 离心5min，弃去上清液。加入0. 5ml PBS 混匀后上流式细胞仪进行检测。 1. 3. 3 细胞毒性T 淋巴细胞活性试验［5，6］ 1. 3. 3. 1 脾细胞悬液的制备( 效应细胞) 无菌取脾，用4 层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank＇s 液洗2 次，每次离 心10min(1000r /min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml 灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank’s 液，混匀后1000r / min，10min 离心，用1ml 含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 × 107 个/ml;加0. 5ml 此细胞悬 液于24 孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。 1. 3. 3. 2 制备刺激细胞1000r /min，10min 离心处于对数生 长期的P815 细胞，用5ml DMEM 培养液悬浮P815 细胞于 15ml 离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50μg / (2 ～ 5) × 107 个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37℃水浴 30min。用Hank’s 液洗P815 细胞3 次，之后Hank’s 液悬浮
淋巴细胞提取 一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取 二实验对象：B／C 小鼠 三实验器材： 1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基 2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台 四实验步骤： 1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。 2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。注意无菌操作。 3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果） 4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。 5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示
6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。 五、注意事项： ①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。覆盖层不必太厚，2Μl足矣。 ②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。如果加早了，两层液体会相互扩散，造成最终离心后的淋巴细胞层下移。 ③推荐使用尼龙网替代不锈钢网筛，以为尼龙网更柔软些 ④使用注射器活塞代替镊子研磨脾脏，由于镊子夹住脾脏的力度不好控制，易造成细胞死亡。
第二章免疫器官和组织 免疫系统（immune system）是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统。免疫系统由免疫器官和组织、免疫细胞（如造血干细胞、抗原提呈细胞、淋巴细胞、NK细胞、粒细胞、肥大细胞、红细胞等）及免疫分子（如免疫球蛋白、补体、各种细胞因子和膜分子等）组成。本章重点介绍免疫器官和组织的结构与功能，免疫细胞和免疫分子将在后续相关章节介绍。 免疫组织（immune tissue）又称为淋巴组织（lymphoid tissue）。淋巴组织在人体内分布广泛，其中胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜下含有大量非包膜化的弥散淋巴组织（diffuse lymphoid tissue）和淋巴小结（lymphoid nodule），在黏膜局部抗感染免疫中发挥主要作用。淋巴组织是胸腺、脾、淋巴结等包膜化淋巴器官（lymphoid organ）的主要组分。淋巴器官因具有免疫功能，又被称为免疫器官（immune organ）。 免疫器官按其发生和功能不同，可分为中枢免疫器官和外周免疫器官（图2-1），二者通过血液循环及淋巴循环互相联系。中枢免疫器官发生较早，由骨髓和胸腺组成，多能造血干细胞在中枢免疫器官发育为成熟免疫细胞，并通过血液循环输送至外周免疫器官。外周免疫器官发生相对较晚，由淋巴结、脾及黏膜相关淋巴组织等组成，成熟免疫细胞在这些部位定居，并在接受抗原刺激后产生免疫应答。 淋巴细胞和单核细胞经血液循环和淋巴循环进出外周免疫器官和组织，构成免疫系统的完整网络，既能及时动员免疫细胞，使之聚集于皮肤及内脏各处病原体等抗原存在部位，又能使这些部位的抗原经抗原提呈细胞摄取并携带至相应外周免疫器官或组织，进而活化T细胞或B细胞，从而发挥适应性免疫应答及效应作用。 第一节中枢免疫器官和组织 中枢免疫器官（central immune organ）或称初级淋巴器官（primary lymphoid organ），是免疫细胞发生、分化、发育和成熟的场所。人或其他哺乳类动物的中枢免疫器官包括骨髓和胸腺。鸟类的腔上囊（法氏囊）是B细胞分化发育的场所。 一、骨髓 骨髓（bone marrow）是各类血细胞和免疫细胞发生及成熟的场所，是机体重要的中枢免疫器官。 （一）骨髓的结构与造血微环境 骨髓位于骨髓腔中，分为红骨髓和黄骨髓。红骨髓具有活跃的造血功能，由造血组织和
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察 【实验原理】 免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。 【试剂和器材】 小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛 【操作方法】 1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。 2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。 3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。 【结果观察】 小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察 【注意事项】 1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。 2.脾脏分离完整，清研轻柔。 3.染色时间不宜过长或过短。. 【讨论】 脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。 1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～
2.4 %。虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。免疫因子包括 tufstin 因子、备解素即P因子、纤维结合蛋白免疫核糖核酸环磷酸鸟苷内源性细胞毒因子、调理素和补体等。而脾切除后,脾脏所产生的免疫因子及免疫细胞消失,血浆中免疫球蛋白IgM、IgG下降,巨噬细胞活性下降,补体旁路活性下降及自身抗体活性增强, 使免疫系统失衡,导致机体易感性增加,甚发生OPSI 。 2.关于tufstin是主要由脾脏产生的促吞噬激素, N ajjar 于 1970 年首先发现。是IgG分子Fc段的一种四肽(T hrLy s -P ro -A rg), 通过激活中性粒细胞发挥吞噬功能。需要在白细胞激肽酶及内羧基肽酶的共同作用下释放。脾切除、镰状红细胞贫血、特发性血小板减少性紫癜、A IDS 及一些腹部疾病可使其水平下降, 脾移植后可使 tufstin 的水平升高。虽然已发现其在免疫系统中的重要作用, 但具体机制仍不十分明了。理论上讲上述情况 tufstin 活性减低的原因包括低γ球蛋白血症、脾脏内中性粒细胞释放减少、白细胞激肽酶活性改变及 tufstin 分子异常。 3.脾脏的抗肿瘤功能机体发生肿瘤的主要原因为免疫系统监控失调, 而脾脏作为人体免疫系统的重要组成部分, 无疑与肿瘤的发生密切相关。临床观察发现, 脾脏不仅自身很少发生原发恶性肿瘤且少有转移瘤出现, 这也表明脾脏具有抗肿瘤的作用。目前大家较公认的观点为脾脏在肿瘤免疫中具有双向性、时向性的特点。表现为在肿瘤早期脾脏具有抗肿瘤作用, 而在晚期则表现为免疫抑制, 促进肿瘤生长。其抗肿瘤作用主要表现在:①可增强巨噬细胞的吞噬功能。②可增强巨噬细胞溶解瘤细胞及其过氧化酶作用。③通过增强 NK 细胞活性发挥抗肿瘤作用。④Chu 认为, tufstin 的抗肿瘤机制不仅通过增加巨噬细胞的肿瘤趋向性、吞噬能力和分泌能力, 更重要的是增加巨噬细胞产生氧自由基—超氧阴离子的能力, 对杀伤肿瘤细胞具有重要意义。关于脾脏边缘带淋巴瘤的研究表明, 肿瘤的发生也与脾脏免疫功能的下降有关。