谷氨酸摇瓶补料发酵
班级：生物工程091班
姓名：XXX
学号：XXXXXXXXXXXXX
指导老师：XX
谷氨酸摇瓶补料发酵
摘要：本实验以天津短杆菌为菌种，在不同培养基条件下研究摇瓶补料发酵生产谷氨酸。试验中以OD值检测天津短杆菌的生长状况，以残糖量和谷氨酸生成量控制补料情况。实验结果表明：在相同培养条件（培养温度32℃，培养箱转速240rpm）下，蛋白胨培养基最高产酸为19g/L，玉米浆70%梯度培养基的最高产酸量为12g/L，根据以上结果可以看出，蛋白胨培养基的产酸量高于梯度培养基。
关键词：谷氨酸补料发酵 OD值残糖量生物素
前言：1866年德国H.ittthausen用硫酸水解小麦面粉，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材将它命名为谷氨酸。1872年Hasiwitz 和Habermaan用酪蛋白水解也制得谷氨酸。1908年日本池田菊苗在探讨海带汁鲜味时，提取了谷氨酸，开始制造“味之素”。1901年日本味之素公司用水解面筋法生产谷氨酸。1936年美国从甜菜废液（斯蒂芬废液）中提取谷氨酸。1954年多田、中山两人报告了采用微生物直接发酵谷氨酸的研究。
直到1956年日本协和发酵公司的木下祝郎分离选育出一种新的细菌——谷氨酸棒状杆菌，能同化利用100g葡萄糖，可直接发酵并积累40g以上的谷氨酸。随后进行了工业化研究，自1957年起发酵法制取味精，正式商业化生产。20世纪60年代后，世界各国也兴起发酵法生产味精，以甘蔗或甜菜、糖蜜、淀粉、醋酸、乙醇为原料，由于石油价格上涨和石油制品的安全性，相继改用糖蜜、淀粉原料为
主的发酵法生产味精。
谷氨酸发酵机制：谷氨酸的生物合成途径主要包括：EMP途径、HMP 途径、TCA循环、乙醛酸循环、CO2固定反应。总反应途径为：糖经过EMP途径和HMP生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入TCA 循环，由三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。
谷氨酸发酵注意事项：在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：①氧，谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。其中谷
氨酸棒状杆菌在溶氧不足时产生的是乳酸或琥珀酸。②温度。菌种生长的最适温度为30～32 ℃。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34～37 ℃。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0～8.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。其中谷氨酸棒状杆菌在pH呈酸性时生成乙酰谷胺酰胺。④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。
1.材料和方法
1.1材料和仪器
菌种
谷氨酸短杆菌TG866，广西工学院生物与化学工程学院微生物实验室提供
1.1.2 材料
葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、尿素、NaCl、K2HPO4、MgSO4、K2HPO4、HCl、NaOH
1.1.3 培养基
（1）活化斜面培养基（5支）
葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，NaCl2.5g/L，琼脂15~20g/L，PH7.0~7.2，共配50mL，分装10mL/支；灭菌：115℃，25min。摆斜面。
（2）种子培养基兼发酵培养基（2瓶）
葡萄糖100g/L，蛋白胨3g/L，MgSO40.8g/L，K2HPO43.5g/L，KH2PO41g/L，20%尿素1.2mL/瓶（接种前在无菌室加入），共配60mL，分装30mL/500mL三角瓶，灭菌：115℃，25min。在无菌室加入1.2mL 尿素后，调节7.2~7.5。
（3）发酵培养基（2瓶）
葡萄糖70g/L，玉米浆3g/L，MgSO40.8g/L，K2HPO43.5g/L，KH2PO41g/L，20%尿素1.2mL/瓶（接种前在无菌室加入），共配60mL，分装30mL/500mL三角瓶，灭菌：115℃，25min。在无菌室加入1.2mL 尿素后，调节7.2~7.5。所有培养基均调PH7.0~7.2，在115℃高温下灭菌15分钟
1.1.4 相关试剂
0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl溶解于蒸馏水并定容至100ml。
50%葡萄糖：称取40葡萄糖溶解于蒸馏水并定容至80ml，用于补料。20%尿素：称取22g尿素溶于蒸馏水并定溶至100ml，过滤除菌。
3mol/L HCL：取12mol/L浓HCL令HCL：H2O为1:3（体积比）配制100ml。
2mol/L NaOH：称取8gNaOH固体溶解于蒸馏水并定容至100ml。
1.1.5 实验仪器与设备
超净台，生物传感分析仪，摇床，722光栅分光光度计，移液枪，灭菌锅，光波炉
3.2 试验方法
1.2.1活化菌种
转接活化斜面，将天津短杆菌转接到活化斜面培养基，30℃培养20h.
1.2.2种子培养
（1）向已经灭菌的种子培养基（蛋白胨3g/L）加入1.2mL尿素，用2mol/L的NaOH或2mol/L的HCL调至PH7.2，按1mL生理盐水/1支大斜面的用量，将活化斜面的菌种洗下，混匀。按3%的接种量（1mL）接入种子培养基，9层纱布封口，240rpm,32℃摇瓶培养7~8h使菌种长至对数生长中后期。这两瓶种子培养基扩陪7~8h后直接用于摇瓶补料发酵30h。
（2）测定OD值：0h测定一次，7h测定一次，若OD值净增0.5以上，即可用于接种发酵培养基。
1.2.3摇瓶补料发酵
（1）向已经灭菌的发酵培养基（葡萄糖70g/L）加入1.2mL尿素，用2mol/L的NaOH或2mol/L的HCL调至PH7.2，将种子培养基按10%的接种量（3mL）将种子培养液接入发酵培养基中，混匀。9层纱布封口，240rpm,32℃摇瓶培养约30h。
（2）测定OD值、OH、残糖量及谷氨酸量：在无菌台取样0.5mL至离心管中，残夜测定PH，酌情加入尿素0.2~0.6mL补料，使PH维持在7.2~7.5，酌情加入50%葡萄糖补料，使残糖维持在20~30g/L，测定OD值、OH、残糖量及谷氨酸量，0h测定一次，大约每3h测定一次。
1.2.4测定方法
（1）菌种生长情况
吸取0.5mL发酵液于1.5mL离心管中，8000r/min离心3min。上清液用于测量残糖好人谷氨酸产量，沉淀稀释100倍，用紫外可见分光光度计在620nm波长下测其OD值，菌种的OD值可以反应菌体的浓度，通过菌体浓度可知菌体生长情况。
（2）残糖量和谷氨酸量的测定
上1中的上清液稀释100倍，即用0.1mL稀释到10mL比色管中定溶，摇匀，用生物传感分析仪测定残糖和谷氨酸量。
（3）PH的测定
用PH6.4~8.0的pH精密试纸测定pH值。
2.实验结果和分析
2.1 实验结果
根据发酵培养基的配方不同，含有蛋白胨的培养基简称为蛋白胨1和蛋白胨2；不含蛋白胨，但含有玉米浆的培养基简称为梯度1和梯度2。
实验数据如下表：
表1 蛋白胨1的发酵记录
表2 梯度1的发酵记录
表3 蛋白胨2的发酵记录
时间 PH 值 残糖/(g/L) 谷氨酸/(g/L) OD 值 补加尿素/mL 补加葡萄糖/mL 0 7.2 51 1 0.61 0.2 0 4.5 7 54 1 0.681 0.4 0 8 7.7 47 5 0.779 0 0 11 7.7 40 6.5 0.747 0 0 13 7.2 37 7.5 0.852 0.2 4 24 5.4 77 10 0.898 0 0 27
5.4
88
10
0.898
时间 PH 值 残糖/(g/L) 谷氨酸/(g/L) OD 值 补加尿素/mL 补加葡萄糖/mL 0 7.2 --- --- --- 0 0 4.5 >8 51 1 0.174 0 0 8 8 41 2 0.368 0 0 11 8 45 2 0.500 0 0 13 7.5 42 3 0.558 0 0 24 5.4 34 6 0.776 0 0 27
<5.4
36
7
0.828
时间 PH 值 残糖/(g/L) 谷氨酸/(g/L) OD 值 补加尿素/mL 补加葡萄糖/mL 0 7.2 48 3 0.587 0.2 0 4.5 7.7 50 6 0.698 0 0 8 5.4 43 9 0.711 1.5 0 11 8 34 11 0.698 0 0 13 8 31 14 0.727 0 5 24 6.4 83 18 0.793 0 0 27
5.8
94
19
0.844
表4 梯度2的发酵记录
注：表中---表示未测定 对所测数据作图，如下：
时间 PH 值 残糖/(g/L) 谷氨酸/(g/L) OD 值 补加尿素/mL 补加葡萄糖/mL 0 7.2 --- --- --- 0 0 4.5 >8 43 1 0.226 0 0 8 8 54 3 0.458 0 0 11 8 48 5 0.444 0 0 13 7.2 41 7 0.602 0.2 0 24 5.4 38 13 0.832 0 0 27
<5.4
36
12
0.863
2.2讨论与分析
谷氨酸发酵中，糖代谢除受到生物素控制外，也受到NH4+的影响。
使用生物素缺乏菌，在NH4+存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。
当NH4+不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是α-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。
同时也受到氧、发酵温度等因素的影响。
对于生物素的要求：
1）菌体生长阶段
保证生物素充足，使菌体快速生长；
2）产酸阶段
控制生物素亚适量(5-10μg/L)，使谷氨酸大量积累。
本实验中，在相同的培养条件下，蛋白胨培养基的产酸量明显高于玉米浆梯度培养基，分析原因有以下几点：
1）生物素的影响
在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸能不断地排到细胞外面，就能大量积累谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。
而本实验中所用的玉米浆梯度培养基的产酸量较低，可能原因就是因为其生物素含量对菌体的影响不利于菌体产酸，而蛋白胨培养基中生物素含量较低，但并不影响菌体的前期的生长，所以产算量较高；
2）NH4+的影响
NH4+的浓度会直接影响到发酵液的pH，pH值过高或过低都会抑制菌体的生长，从而降低菌体产酸。
根据表2、3、4显示，玉米浆梯度培养基在发酵时间为8h和11h时pH 至明显偏高，此时菌体可能被抑制生长，导致最后产酸能力降低。
3）由于谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。而在发酵过程中，要定时测定发酵液的OD值、残糖量和产酸量，而且实验分组较多（10），且很多组不在同一时间测定，所以在操作过程中可能导致发酵液溶氧量不足和温度不稳定，从而导致菌体生长不充分，抑制菌体产酸。
3.结果与小结
总的来说，本次实验基本成功，两组培养基发酵液均产酸，不过产算量不是很高，造成这样结果的原因有很多，文中不能一一讨论。不过在本次试验中，我们亲自操作每个过程，并从中获益良多，对谷氨酸发酵过程中的一系列指标的变化有了一个具体的认识，更加深了对这部分理论知识的理解，对我们提高自己有很大帮助。
4.参考文献
[1]陈宁.氨基酸工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，2008年3月
[2]贺小贤.生物工艺原理[M].北京：化学工业出版社，2007年12月
[3] 卢宗梅，康传利，张伟国.L －谷氨酸补料分批发酵的研究[J].
生物加工过程,Vol． 9 No． 5,Sep. 2011
谷氨酸发酵过程控制 【摘要】谷氨酸是构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一。作为谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前体。谷氨酸的质量受到发酵的条件、菌种、温度、pH、接种量和种龄等因素的影响。如果控制不好这些因素整个发酵过程发酵液受污染、出现菌体的生长缓慢和代谢产物的积累很少、发酵周期延长甚至所得产品不是最终产品。本文通过综述发酵培养基、培养条件的控制及发酵过程温度、pH、接种量和种龄的控制，以及消泡等多方面因素，来提控制高谷氨酸发酵过程的参数来提高发酵的质量以些方法。 【关键词】谷氨酸、发酵、控制 1.谷氨酸概述 谷氨酸学名：2-氨基-5-羧基戊酸。构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一。作为谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前体。L-谷氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。D-谷氨酸参与多种细菌细胞壁和某些细菌杆菌肽的组成。符号：E。 1.1谷氨酸用途 1）下游产品开发 将有一定反应活性的双功能基试剂氯乙醇和L—谷氨酸直接酯化保护羧基，用三光气活化成其相应的N—羧酸酐，可直接得到侧链具有一定反应活性的聚L—氯乙基谷氨酸酯。谷氨酸可生产许多重要下游产品如L—谷氨酸钠、L—苏氨酸、聚谷氨酸等。 2）食品业 谷氨酸是在食品工业中应用较多的氨基酸。谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。用于食品内，能显着提高食品的风味和有增香作用。谷氨酸作为风味增强剂可用于增强饮料和食品的味道，不仅能增强食品风味，对动物性食品有保鲜作用。 3）日用化妆品等 谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种。如：N—酰基谷氨酸钠系列产品是由谷氨酸缩合而成的性能优良的阴离子表面活性剂，广泛用于化妆品、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等产品中。谷氨酸作为营养药物可用于皮肤和毛发。用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛乳头、毛母细胞有营养
年产2万吨谷氨酸发酵生产的初步设计
第一章总论 一、设计项目： （1）设计课题：年产2万吨谷氨酸发酵工厂的初步设计 （2）厂址：某市 （3）重点工段：糖化 （4）重点设备：糖化罐 二、设计范围： （1）厂址选择及全厂概况介绍（地貌、资源、建设规模、人员）；（2）产品的生产方案、生产方法、工艺流程及技术条件的制定；（3）重点车间详细工艺设计、工艺论证、设备选型及计算；（4）全厂的物料衡算； （5）全厂的水、电、热、冷、气的衡算； （6）车间的布置和说明； （7）重点设备的设计计算； （8）对锅炉、电站、空压站等提出要求及选型； （9）对生产和环境措施提出可行方案。 三、要完成的设计图纸： （1）全厂工艺流程图一张； （2）重点车间工艺流程图一张； （3）重点车间设备布置立面图一张；
（4）重点车间设备布置平面图一张； （5）重点设备装配图一张。 四、设计依据： （1）批准的设计任务书和附件可行性报告，以及可靠的设计基础资料。 （2）我国现行的有关设计和安装的设计规范和标准 （3）广东轻工职业技术学院食品系下达的毕业设计任务书 五、设计原则： （1）设计工作要围绕现代化建设这个中心，为这个中心服务。首先要有加速社会主义四个现代化早日实现的明确指导思想，做到精心设计，投资省，技术新，质量好，收效快，收回期短，使设计工作符合社会主义经济建设的总原则。 （2）要学会查阅文献，收集设计必要的技术基础资料，要善于从实际出发去分析研究问题，加强技术经济的分析工作。（3）要解放思想，积极采用技术，力求设计上具有现实性和先进性，在经济上具有合理性，尽可能做到能提高生产率，实现机械化和自动化，同时兼顾社会和环境的效益。 （4）设计必须结合实际，因地制宜，体现设计的通用性和独特性相结合，工厂生产规模、产品品种的确定，要适应国民经济的需求，要考虑资金的来源，建厂的地点、时间、三废综合
1）生物素营养缺陷型 ?作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与 了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏. ?控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵 初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换. 2）油酸营养缺陷型 ?作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少 到正常量的1/2左右. ?控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换. （3）添加表面活性剂 ?添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨 酸. ?机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细 胞膜. ?关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在 下进行分裂,形成产酸型细胞. （4）添加青霉素 ?机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作 用下受损,向外泄露谷氨酸. ?控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不 能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换. 谷氨酸发酵强制控制工艺 ?为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取 “强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法. ?控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料 中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。谷氨酸发酵 ? 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h. 措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短. ? 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧 下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h. 措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃ ? 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成. 措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃. ? 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低. 措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐. 发酵周期一般为30h. 二、谷氨酸发酵的生化过程
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需、 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路就是否畅通,所有阀门就是否良好,并关闭所有阀门、 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常、 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等就是否正常,确保空压机运行正常、 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水就是否正常、 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0、2-0、25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0、15-0、2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2、5小时、灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0、15-0、2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分与排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌、 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0、2-0、25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀与排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,就是压力稳定在0、11-0、15MPa,计时灭菌30-35分钟、灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0、11-0、15MPa,备用、
课程设计说明书不同分子量聚谷氨酸制备条件研究 学院（系） 年级专业： 学号： 学生姓名： 指导教师： 教师职称：
2013-2014 春季学期 生物工程专业课程设计 结题论文 不同分子量聚谷氨酸制备条件研究 学院（系）： 年级专业： 学号： 学生姓名： 指导教师： 教师职称：
摘要 . γ-PGA 是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通过微生物合成。在生产低聚谷氨酸工艺当中，利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景，但在利用微生物发酵法制备产物时，生产的聚谷氨酸具有较大的分子量，需要对其进行进一步的降解处理。本设计拟对微生物发酵生产的高分子量的聚谷氨酸进行降解，并优化其降解条件，从而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相凝胶色谱检测其降解后的分子量，从而确定最佳降解条件。本设计主要分为三个部分对不同分子量的γ-PGA 的制备情况进行了研究。第一部分是通过微生物发酵，提取得到 80-100 万分子量的大分子聚谷氨酸产物的设计；第二部分根据聚谷氨酸分子特性，设计筛选可降解大分子聚谷氨酸的方法，并优化降解条件，得到不同分子量的低聚谷氨酸分子，并找到合适的方法进行分离纯化；第三部分是在前两部分的基础上，通过建立琼脂糖凝胶电泳和液相凝胶色谱检测不同分子量低聚谷氨酸的方法，从而设计出最佳的制备条件。 关键词：生物发酵法、聚谷氨酸、降解条件、检测方法
目录 第一部分文献综述 (3) 1.1 γ-聚谷氨酸简介 (3) 1.2 聚谷氨酸结构 (4) 1.3 聚谷氨酸性质： (4) 1.3.1 吸水特性 (4) 1.3.2 生物可降解性 (4) 1.3.3 γ-PGA 的水解特性 (5) 2. γ-PGA 的应用前景 (5) 2.1 γ-PGA 的应用 (5) 2.1.1 聚γ-PGA 是一种微生物絮凝剂 (5) 2.1.2 γ-PGA作为一种新型的高分子吸水性材料 (5) 2.1.3 γ-PGA作为新型的药物载体 (6) 3. γ-PGA 合成方法 (7) 3.1 化学法合成 (7) 3.1.1 传统的肽合成法 (7) 3.1.2 二聚体缩聚法 (7) 3.2 提取法合成 (7) 3.3 微生物生物合成法 (7) 3.3.1 代谢途径 (7) 4. 研究进展 (8) 5. 总结——本设计的前景分析以及研究意义 (8) 5.1 前景分析 (8) 5.2 研究意义 (9) 第二部分课程设计部分 (10) 1.材料 (10)
工艺计算 生产方法：以工业淀粉为原料、双酶法糖化、流加糖发酵，低温浓缩、等电提取。主要技术指标： 淀粉液化工艺参数： 糖化工艺参数：
培养基配方： 灭菌各参数：
一、谷氨酸发酵车间的物料衡算 首先计算生产1000kg 纯度为100%的味精需耗用的原材料以及其他物料量。 （一）、发酵液量 设发酵液初糖和流加高浓糖最终发酵液总糖浓度为180kg/ ，则发酵液量为： )(0.8% 124%99%95%601801000 3 1m V =????= 式中 180——发酵培养基终糖浓度（kg/） 60%——糖酸转化率 95%——谷氨酸转化率 99%——除去倒罐率1%后的发酵成功率 124%——味精对谷氨酸的精制产率 （二）、发酵液配制需水解糖量，以纯糖计算： )(136017011kg V G =?= （三）、二级种液量： ) (4.0%53 12m V V == （四）、二级种子培养液所需水解糖量： )(164022kg V G == 式中 40——二级种液含糖量（kg/） （五）、生产1000kg 味精需水解糖总量： )(137616136021kg G G G =+=+= （六）、耗用淀粉原料量： 理论上，100kg 淀粉转化生成葡萄糖量为111kg ，故耗用淀粉量为： )(6.1572%)111%5.98%80(G kg G =??÷=淀粉 式中 80%—淀粉原料含纯淀粉量 98.5%—淀粉糖化转化率 （七）、液氨耗用量： 二级种液耗液氨量：2.4V 2=0.96（kg ） 发酵培养基耗液氨量：20V 1=160（kg ） 共耗液氨量：160+0.96=161.0（kg ） （八）、磷酸氢二钾耗量：
微生物发酵产聚谷氨酸工艺研究 摘要：谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。以枯草芽孢杆菌纳豆亚种为出发菌株，考察不同碳氮源及NaCl 浓度、谷氨酸、种龄、接种量对微生物发酵产γ- 聚谷氨酸的影响，以提高γ- 聚谷氨酸的产量。方法：该菌菌种活化后，接入种子培养基，于37℃、200 r/min 震荡培养18 h，然后按2 %接种量接入不同发酵培养基进行发酵培养。γ- 聚谷氨酸分离纯化后，根据其产量筛选最适发酵培养基组成及发酵条件，并对产物进行分析测定。 关键词：γ- 聚谷氨酸；纳豆菌；发酵；优化培养 一、材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto），系作者筛选，由本校微生物教研室罗兵教授鉴定确认，于实验室保存。 1.1.2 培养基斜面培养基：大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 7.5 g/L，琼脂20 g/L。种子培养基：大豆蛋白胨20 g/L，葡萄糖30 g/L，谷氨酸钠25 g/L，NaCl 5 g/L。液体发酵培养基：大豆蛋白胨30 g/L，葡萄糖40 g/L，谷氨酸钠30 g/L，NaCl15 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 4.0 g/L，Mg-SO4 0.5 g/L，CaCl2 0.25 g/L 及少量生物素[1]。以上培养基pH 均为7.0-7.2，在121℃下高压灭菌20 min。 1.1.3 试剂γ-PGA 标准品为Sigma 公司产品；系列葡聚糖标准品（Shodex P-82 standard 标准品，分子量（Mr）分别为5900，11800，22800，47300，112000，212000，404000，788000）为SHOWA DENKO 公司产品；叠氮钠、硫酸钠、蛋白胨、葡萄糖、谷氨酸等均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 发酵方法菌种活化：取菌种一环，接于斜面培养基，37℃培养20 h。 种子培养：取一至两环活化菌种接入种子培养基中，37℃、200 r/min 震荡培养18 h。 发酵培养：将上述种子液按2%接种量接入发酵培养基（装液量为40/250 mL），37 ℃、250 r/min 震荡培养48 h，测γ-PGA 的产量。 1.2.2 提取方法发酵液于4 ℃、10000 r/min 离心15 min 去除菌体，取上清液用6 mol/L HCl 将pH 调至2.0-3.0，加入3 倍体积冰无水乙醇搅拌出现絮状沉淀，低温放置4 h 离心得沉淀（粗品）。然后溶于蒸馏水，用透析袋透析脱盐（除去无机小分子和离子），再经阴离子交换层析进一步提纯，即将透析过的
谷氨酸发酵 目前工业上应用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌、噬氨短杆菌等。我国常用的菌种有北京棒状杆菌、纯齿棒状杆菌等。 谷氨酸除用于制造味精外，还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射液等。我国的谷氨酸发酵虽然在产量、质量等方面有了较大的提高，但与国外先进水平相比还存在一定差距。主要表现在：设备陈旧，规模小，自控水平、转化率和提取率低，易受噬菌体污染，废水污染问题尚未完全解决等。 一、菌种的选育 主要通过基因突变、基因工程、细胞工程得到优良的菌种。 可以从自然界中先分离出相应的菌种，再用物理或化学的方法使菌种产生突变，从突变个体中筛选出符合生产要求的优良菌种。 在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，以提高细胞膜对谷氨酸的通透性，如生物素缺陷型菌种的选育。 1.谷氨酸生产菌的生化特征 1. α-酮戊二酸氧化能力微弱: α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低. 2. 谷氨酸脱氢酶活性强. 3. 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱. 4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱. 5. 不利用谷氨酸. 6. 耐高糖耐高谷氨酸 . 7. CO2固定能力强. 8 .解除谷氨酸反馈抑制. 9. 具有向胞外分泌谷氨酸的能力. 2.谷氨酸产生菌 棒杆菌属：北京棒杆菌 钝齿棒杆菌 谷氨酸棒杆菌 短杆菌属：黄色短杆菌 产氨短杆菌 小杆菌属：嗜氨小杆菌 节杆菌属：球形节杆菌 3.共同点： 1. α-酮戊二酸氧化能力微弱: α-酮戊二酸脱氢酶丧失或活性低. 2. 谷氨酸脱氢酶活性强. 3. 还原性辅酶Ⅱ(NADPH+H+)进入呼吸链能力缺陷或微弱. 4. 异柠檬酸裂解酶活力微弱. 5. 不利用谷氨酸.
1味精的生产工艺流程简介 味精的生产一般分为制糖、谷氨酸发酵、中和提取及精制 等4个主要工序。 1．1液化和糖化 因为大米涨价，目前大多数味精厂都使用淀粉作为原材 料。淀粉先要经过液化阶段。然后在与B一淀粉酶作用进入糖 化阶段。首先利用一淀粉酶将淀粉浆液化，降低淀粉粘度并 将其水解成糊精和低聚糖，应为淀粉中蛋白质的含量低于原来 的大米，所以经过液化的混合液可直接加入糖化酶进入糖化阶 段，而不用像以大米为原材料那样液化后需经过板筐压滤机滤 去大量蛋白质沉淀。液化过程中除了加淀粉酶还要加氯化钙， 整个液化时间约30min。一定温度下液化后的糊精及低聚糖在 糖化罐内进一步水解为葡萄糖。淀粉浆液化后，通过冷却器降 温至60℃进入糖化罐，加入糖化酶进行糖化。糖化温度控制在60℃左右，PH值4．5，糖化时间18-32h。糖化结束后，将糖化罐加热至80 85℃，灭酶30min。过滤得葡萄糖液，经过压滤 机后进行油水分离(一冷分离，二冷分离)，再经过滤后连续消 毒后进入发酵罐。 1．2谷氨酸发酵发酵 谷氨酸发酵过程消毒后的谷氨酸培养液在流量监控下进入谷氨酸发酵罐，经过罐内冷却蛇管将温度冷却至32℃，置入 菌种，氯化钾、硫酸锰、消泡剂及维生素等，通入消毒空气，经一
段时间适应后，发酵过程即开始缓慢进行。谷氨酸发酵是一个 复杂的微生物生长过程，谷氨酸菌摄取原料的营养，并通过体 内特定的酶进行复杂的生化反应。培养液中的反应物透过细胞 壁和细胞膜进入细胞体内，将反应物转化为谷氨酸产物。整个 发酵过程一般要经历3个时期，即适应期、对数增长期和衰亡期。每个时期对培养液浓度、温度、PH值及供风量都有不同的 要求。因此，在发酵过程中，必须为菌体的生长代谢提供适宜的生长环境。经过大约34小时的培养，当产酸、残糖、光密度等指标均达到一定要求时即可放罐。 1．3 谷氨酸提取与谷氨酸钠生产工艺 该过程在提取罐中进行。利用氨基酸两性的性质，谷氨酸 的等电点在为pH3．0处，谷氨酸在此酸碱度时溶解度最低，可经长时间的沉淀得到谷氨酸。粗得的官司谷氨酸经过于燥后分 装成袋保存。 1．4谷氨酸钠的精制 谷氨酸钠溶液经过活性碳脱色及离子交换柱除去C a 、 Mg 、F e 离子，即可得到高纯度的谷氨酸钠溶液。将纯净的 谷氨酸钠溶液导入结晶罐，进行减压蒸发，当波美度达到295 时放入晶种，进入育晶阶段，根据结晶罐内溶液的饱和度和结 晶情况实时控制谷氨酸钠溶液输入量及进水量。经过十几小时 的蒸发结晶，当结晶形体达到一定要求、物料积累到80％高度时，将料液放至助晶槽，结晶长成后分离出味精，送去干燥和筛
聚谷氨酸 聚谷氨酸最早被发现存在于日本纳豆食品（经发酵过之小黄豆）所含具有高粘稠性的拉丝中，在国内简称为γ-PGA，是利用天然纳豆菌与谷氨酸经过液态发酵进行生物聚合，所产生可分解的高分子氨基酸聚合物。 聚谷氨酸在农业推广中的功能特性： 一、超强亲水性与保水能力 聚谷氨酸分子含有1000 个以上的超强亲水性基团（-COOH），能充分保持土壤中的水分，改进黏重土壤的膨松度及空隙度、改善砂质土壤的保肥与保水能力。用于漫淹土壤时，会在植株根毛表面形成一层薄膜保护根毛，是土壤中养分、水分与根毛亲密接触的最佳输送平台，有效提高肥料的溶解、储存、输送与吸收。尤其是在缺水、少水的干旱、半干旱地区或者应用滴灌和水肥一体化的地区使用聚谷氨酸，能极大的提高水肥的利用率，保持水分和养分有效的分布于根系周围，被植物更多的吸收利用，减少蒸发、渗漏等造成的水肥流失。 二、促进磷肥与中微量元素的吸收 聚谷氨酸具有多阴电性，能有效阻止硫酸根、磷酸根、草酸根、碳酸根等离子与钙离子、镁离子及微量元素的结合，避免产生低溶解性盐类与沉淀作用，因此更能促进中微量元素与磷肥等养分的吸收与利用。此外还能提高土壤中阳离子的交换能力，暂时储存吸附阳离子，例如钙离子、镁离子等中量元素及其他微量元素铁、锰、铜、锌等阳离子，再缓缓释放至土壤中来补充。 三、平衡土壤的酸碱值 对酸、碱具有极佳的缓冲能力，可有效平衡土壤酸碱值，避免因长期使用化学肥料所造成的酸性土质及土壤板块化。以胶东半岛为例，众多苹果果园存在土壤酸化的情况。在每亩施用聚谷氨酸发酵液约1升后，过段时间观察，聚谷氨酸可明显提高酸性土壤的pH值1-2个，改善因酸化造成的果树苦痘等病害，同时改善果实的品质。另外，对于海水倒灌造成的盐渍化和使用过量化学肥料造成的次生酸化也有很好的调节作用。 四、螯合土壤中有毒重金属 对于铅、铬、镉、铝、砷等重金属有极佳的螯合效果，可避免作物吸收过多土壤中有毒重金属，缓解土壤毒害。近些年来，某些地区土壤中重金属的污染逐步加剧，尤其是一些有色金属矿区，城市污水和工业污水集中排放区对于农田的污染主要表现为：重金属离子严重超标，被植物吸收之后，生产出的农产品也会含有过量的重金属离子，被人体吸收后造成严重的危害。而使用聚谷氨酸可以快速、高效的螯合，絮凝重金属离子，使其不被植物吸收，减少重金属毒害，进而提高作物品质，产生优质无害的农产品。 五、增强植物抗病及抗逆境能力 整合植物营养与土壤中的水活性成分，并增加抗盐、抗旱、抗逆、抗肥力流失的能力。聚谷氨酸本身对于植物根部有天然的促进作用，刺激根毛的新生和根系的生长，从而提升植物地下部分吸收养分的能力，在干旱、水涝和低温等逆境来临时，有效保证水分和养分的正常吸收，缓冲旱、涝、寒等逆境对植物根系造成的损伤。 六、减少肥料用量增加产量
谷氨酸的性质及基本介绍 147.12926 1.538 主要用途简介： （一）食品工业：谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。 （二）日用化妆品：谷氨酸作为营养药物可用于皮肤和毛发。 N—酰基谷氨酸钠系列产品是由谷氨酸缩合而成的性能优良的阴离子表面活性剂，广泛用于化妆品、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等产品中。 焦谷氨酸钠（味精脱水生成的产物）具有极强的吸湿性，能保持皮肤湿润，防止干燥，并增强皮肤和毛发的柔软和弹力。日本己有以谷氨酸钠（或谷氨酸）为原料生产的高级人造革、化妆品和洗涤剂等产品。 （三）医药行业：谷氨酸作有较高的营养价值，医学上主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。 （四）农业：谷氨酸与某些激素配合，可制成柑桔增甜剂；还可作为微肥的载体，在氮磷钾基本满足的条件下，作为叶面喷洒的微肥具有投入少、效益高等特点。 谷氨酸钠既是西红柿保护性杀菌剂，又是防治果树腐烂病的特效杀菌剂。 氨基酸铜是目前生产上良好的杀菌剂，有机铜比无机铜的应用效果好。 特殊说明： （一）谷氨酸晶体为白色结晶或结晶性粉末，味微酸。 （二）吸湿性温度50℃，其临界湿度在90%以上。
谷氨酸生产水平与市场分析 生产水平： 谷氨酸棒状杆菌-生物素敏感型高产菌株：采用生物素亚适量工艺，发酵32h，产酸达140g/L以上，糖酸转化率达62%以上，国内同类研究的领先水平。 谷氨酸棒状杆菌-谷氨酸温度敏感型突变株：在最佳发酵条件下，发酵24h，产酸达到160g/L，糖酸转化率达72%，国际同类研究的先进水平。 市场分析： 我国味精工业的产量稳居世界第一位，2007年全国味精产量达190万吨。味精工厂的味精平均销售价格为7,800元/吨，成本为7,000元/吨。按照上述产量计算，我国味精工业中纯味精的总产值约150亿元，加上相当于上述总值30%的副产品（主要是饲料蛋白、化肥、液态肥料）的产出，我国味精工业年生产总值约为200亿元人民币。 从市场需求来看，2007年国内谷氨酸年产量约190万吨，国内人均消费味精仅1kg，与日本、香港、台湾、东南亚等国家及地区的味精消费水平（1.5kg）相比，还是较低的。味精综合开发利用的效益显著，通过提高产酸率，吨味精成本可降低500元左右，其生产成本将低于日本的味精生产成本，具备了参与国际市场的竞争力，可以抓住机遇扩大味精出口量。同时在国内可降低味精销售价格，刺激国内市场消费。
味精的生产工艺说明 一、味精及其生理作用 1. 味精的种类 按谷氨酸的含量分类：99%、95%、90%、80%四种 按外观形状分类：结晶味精、粉末味精 2.味精的生理作用和安全性 （1）参与人体代谢活动：合成氨基酸 （2）作为能源 （3）解氨毒 味精的毒性试验表明是安全的。 二、味精的生产方法 味精的生产方法：水解法、发酵法、合成法和提取法。 1、水解 原理：蛋白质原料经酸水解生成谷氨酸，利用谷氨酸盐酸盐在盐酸中的溶解度最小的性质，将谷氨酸分离提取出来，再经 中和处理制成味精。 生产上常用的蛋白质原料——面筋、大豆及玉米等。 水解中和，提取 蛋白质原料——谷氨酸————味精 2、发酵法 原理： 淀粉质原料水解生成葡萄糖，或直接以糖蜜或醋酸为 原料，利用谷氨酸生产菌生物合成谷氨酸，然后中和、提取 制得味精。 淀粉质原料—→糖液—→谷氨酸发酵—→中和—→味精
3、合成法 原理：石油裂解气丙烯氧化氨化生成丙烯腈，通过羰化、 氰氨化、水解等反应生成消旋谷氨酸，再经分割制成L-谷氨酸， 然后制成味精。 丙烯→氧化、氨化→丙烯睛→谷氨酸→味精 4、提取法 原理：以废糖蜜为原料，先将废糖蜜中的蔗糖回收，再将废液用碱法水解浓缩，提取谷氨酸，然后制得味精。 水解、浓缩中和，提取 废糖蜜————→谷氨酸————→味精 二、味精的生产工艺图 三、原料来源
谷氨酸发酵以糖蜜和淀粉为主要原料。 糖蜜：是制糖工厂的副产物，分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两大类。 淀粉：来自薯类、玉米、小麦、大米等 1、淀粉的预处理 （1）淀粉的水解 原料→粉碎→加水→液化→糖化→淀粉水解糖 （2）淀粉的液化 在 -淀粉酶的作用将淀粉水解生成糊精和低聚糖。 （3）淀粉的糖化 在糖化酶（如曲霉菌糖化剂）的作用下将糊精和低聚糖水解成葡萄糖。 喷射液化器出口温度控制在100-105℃，层流罐温度维持在95-100 ℃，液化时间约1h,然后进行高温灭酶。淀粉浆液化后，通过冷却器降温至60 ℃进入糖化罐，加入糖化酶进行糖化。糖化温度控制在60 ℃左右，pH值4.0-4.4，糖化时间48h.糖化结束后，将糖化罐加热至80-85 ℃，灭酶30min.过滤得葡萄糖液。
目录 年产50吨L-谷氨酸的工艺设计 1文献评述 1.1产品概述 1.1.1名称 学名：L-谷氨酸-水化合物； 商品名：L-谷氨酸。因L-谷氨酸起源于小麦，故俗称麸酸。 英文名：Monosodium L-glutamate 其它名称：L-2-Aminoglutaric acid, H-Glu-OH, L-glutamic acid, L(+)-glutamic acid, H-L-Glu-OH, S-2-Aminopentanedioic acid 1.1.2 产品规格及标准 结构式： 分子式C 6H 14 N 4 O 2 .C 5 H 9 NO 4 分子量321.33 1.1.3理化性质 L-谷氨酸为白色鳞片状晶体。无臭，稍有特殊的滋味和酸味。呈微酸性。微溶于冷水，易溶于热水，几乎不溶于乙醚、丙酮和冷醋酸中，不溶于乙醇和甲醇。247-249℃分解，200℃升华，相对密度1.538（20/4℃），旋光度[α]＋30-＋33°。 1.1.4产品用途 （1）食品业 氨基酸作为人体生长的重要营养物质，不仅具有特殊的生理作用，而且在食品工业中具有独特的功能。 （2）日用化妆品等 谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种，作为营养药物可用于皮肤和毛发。
聚谷氨酸是一种出色的环保塑料，可用于食品包装、一次性餐具及其它工业用途，可在自然界迅速降解，不污染环境。随着科学的进步，研究的深入，谷氨酸新的应用领域将越来越广。 （3）医药行业 谷氨酸还可用于医药，因为谷氨酸是构成蛋白质的氨基酸之一，虽然它不是人体必须的氨基酸，但它可作为碳氮营养与机体代谢，有较高的营养价值。 2、工业生产方法的选择和论证 2.1L-谷氨酸生产方法的选择与确定 2.1.1传统工艺中L-谷氨酸的生产方法有两种：合成法和发酵法。 （1）合成法 丙烯腈与氢和一氧化碳在高温，高压和催化剂的作用下得到β-氰基丙醛（OHCCH2CH2CN），后者与氰化钾和氯化铵进行斯脱拉克（Straker）反应生成氨基腈。将氨基腈用氢氧化钠水解，得谷氨酸二钠，然后用硫酸中和，生成D，L-谷氨酸析出，将D，L-谷氨酸进行光学分离，即可分成L-谷氨酸和D- 谷氨酸，后者经消旋化再返回到中和工序。此法日本曾用之生产L-谷氨酸10年之久，于1973年停用。 （2）发酵法 此法是L-谷氨酸工业生产的主要方法。薯类，玉米，木薯等的淀粉水解糖或糖蜜，借助于微生物类，以铵盐，尿素等提供氮源，于大型发酵罐中，在通气搅拌下进行发酵30-50个小时，保持30-40度。PH值为7-8，发酵完毕。 表1.两种方法的比较 缺点优点 合成法需要高压，有易燃，有毒物质，设 备投资大，年产量小于5000吨L- 谷氨酸时不经济，生产工艺复杂 不用粮食，采用石油废气 发酵法需设置菌种实验室，生产过程需要 严格消毒灭菌原料来源广，设备腐蚀性小，劳动强度小，可自动化，连
一简述甜菜糖蜜添加吐温发酵的机理！！！ 吐温是一种表面活性剂，它是在菌体细胞不饱和脂肪酸合成的过程中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素具有拮抗作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，达到控制磷脂合成，导致磷脂合成不足。结果形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜，提高了谷氨酸向膜外漏出的渗透性。 二简述甘蔗糖蜜添加青霉素流加糖发酵的机理！！！ 添加青霉素可抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，主要抑制糖肽转肽酶，影响细胞壁肽聚糖的生物合成。因为青霉素的结构与革兰氏阳性的谷氨酸菌所特有的糖肽的D-Ala-D-Ala末端结构类似，因而它取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心结合，是五肽末端的丙氨酸不能被肽酶移去，谷氨酸桥一头无法与它前面的丙氨酸相接，因此交联不能形成，网状的结构连接不起来，糖肽的合成就不能完成，于是菌体内的尿二磷和N-乙酰胞壁酸便大量的积累，青霉素与转肽酶相结合，形成了青霉素的酶，结果形成不完全的细胞壁，导致形成不完全的细胞膜。由于青霉素合成细胞壁后期生物合成，是细胞膜处于无保护的状态，又由于膜内外的渗透压差，进而导致细胞膜的物理损伤，形成不完全的细胞膜，失去渗透障碍物，增大了谷氨酸向胞外分泌的渗透能力。 三简述温度敏感突变株发酵生产谷氨酸的机理！！！ 谷氨酸温度敏感突变株的突变位置是在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上，发生碱基的转换或者颠换，一个碱基被另一
个碱基所置换，这样为该基因所指导的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变，当控制培养温度为最适温度时，菌体正常的生长，当温度提高到一定的程度时，菌体便停止生长且大量的产酸。而它仅需通过控制物理的方式就可以完成谷氨酸生产菌由生长型细胞向产酸型细胞的转变。 四简述谷氨酸发酵培养基对发酵的影响及控制措施！！！ 影响因素及控制措施如下： 1.生物素 谷氨酸在发酵的过程中，前期：菌体的生殖期，一定量的生物素是菌体增殖期所必须的一般在5ug/L，而在产物合成期，要控制生物素的浓度,一般在0.5ug/g，以保证产物的正常合成。 2. 碳源 谷氨酸产生菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等；有些菌种能利用醋酸、乙醇、正烷烃等作碳源。淀粉水解糖的质量对发酵影响很大。一般还原性的糖的浓度控制在125—150g/L。 3 碳氮比 碳氮比对谷氨酸发酵影响很大，在发酵的不同阶段，控制碳氮比以促进以生长阶段向产酸阶段转化，在长菌阶段，如氨根离子过量会抑制菌体生长，在产酸阶段，如氨根离子不足，a-酮戊二酸不能还原并氨基化，而积累a-酮戊二酸，谷氨酸生成量少。 一般发酵工业碳氮比为100：(0.2～2.0)，谷氨酸的碳氮比为100：(15～30)，当碳氮比在100：11以上才开始累积谷氨酸。
生物素对谷氨酸发酵的影响及控制摘要： 阐述生物素对谷氨酸在发酵过程中的影响和控制生物素的用量来提高谷氨酸的产量，以及生物素测定方法的介绍。 关键词：生物素谷氨酸影响测定方法发酵 1生物素对谷氨酸生产的影响 1.1谷氨酸的生物合成途径 谷氨酸生物合成的主要途径：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和磷酸戊糖途径（HMP途径）生成丙酮酸，再被氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及NH4+的存在条件下，经还原氨基化反应生成谷氨酸。 1.2 生物素对谷氨酸生物合成途径的影响 生物素对谷氨酸生物合成途径有下列几方面的影响[1]： （1）生物素对糖酵解速度的影响 生物素在糖酵解过程中，主要影响糖酵解速度，而不是EMP途径与HMP途径的比率。在生物素充足条件下，糖降解速度远远超过丙酮酸的氧化速度，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸，引起了乳酸的溢出。只有在生物素限量的情况下，糖降解速度与丙酮酸氧化速度才趋于平衡。 （2）生物素对NAD及NADH2含量的影响 在生物素缺乏菌中，葡萄糖氧化能力降低，特别是醋酸、琥珀酸的氧化能力显著减弱。在生物素缺乏菌中，NAD及NADH2含量减少到l/2-1/4。 （3）生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，该酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，在生物素亚适量条件下，异柠檬酸裂解酶几乎没有活性。原因在于丙酮酸氧化能力下降，醋酸生成速度减慢，为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶很少。再者，由于该酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶活性，并阻遏该酶的生成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向沿异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动。 （4）生物素对氮代谢的影响 生物素限量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时由于完全氧化降低的结果，使ATP的形成减少，蛋白质合成活动停滞。在铵离子适量条件下，生成积累谷氨酸，且生成的谷氨酸也不会通过转氨作用生成其他氨基酸。在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶、琥珀酸氧化力、丙酮酸氧化力、蛋白质合成、乙醛酸循环比例、草酰乙酸和苹果酸脱羧反应都不断加大，导致谷氨酸量减少，通过转氨作用生
γ-聚谷氨酸发酵关键技术的研究 γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是微生物合成由谷氨酸单体缩合形成的高聚物,单体间以酰胺键相互连接,具有多种优良特性,如无毒、生物可降解、生物相容、强溶于水等,广泛用于食品、环保、农业等领域。本文从γ-PGA生产菌的诱变选育和发酵过程优化展开研究,以期提高γ-PGA产率。主要研究内容如下:(1)采用ARTP 技术对出发菌株L13进行诱变处理,诱变条件为:处理距离2 mm、最佳处理时间300 s、样品加量10μL、通气量10 SLM。 以不产生脂肽和γ-PGA高产作为筛选标准,从突变库中筛选获得一株性能 优良的突变株ZF5。通过摇瓶发酵与5 L罐分批发酵验证,该菌株发酵过程仅产生少量泡沫,不产生脂肽副产物,在5 L罐中发酵18hγ-PGA产率达到26.1 g/L。 (2)在对枯草芽孢杆菌ZF5发酵特性研究基础上,通过添加适量的金属离子、氨基酸对γ-PGA发酵进行调控,以提高γ-PGA产率。 结果发现:Ca2+、Mo6+能够促进菌体的生长和γ-PGA的生物合成,最适浓度分别为0.1 g/L和0.06 g/L;Zn2+对菌体生长和产物合成都无显著影响;Cu2+和Mn2+对菌体的生长有一定抑制作用,但是Mn2+对γ-PGA产物积累促进作用最强,添加0.3 g/L的Mn2+发酵24 hγ-PGA产率最高为28.5 g/L,较对照提高了11.8%。谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸对γ-PGA的合成具有促进作用,其中谷氨酸、天冬氨酸效果更为显著。在发酵初始添加3 g/L的L-谷氨酸可使γ-PGA产率提高23%,最高达到31.5 g/L;在稳定期添加5 g/L的L-天冬氨酸可使γ-PGA产率提高17.6%,达到30.7 g/L。 (3)通过单一pH控制发酵策略研究发现,菌株ZF5最适生长pH为6.5,产物γ-PGA积累的最适pH为7.0。通过两阶段pH控制策略有效地实现了菌体快速生
谷氨酸发酵过程优化与控制研究 【摘要】：谷氨酸产生菌既是谷氨酸发酵反应过程的主体，也是反应过程的生物催化剂。通过对影响谷氨酸发酵生产的菌种、原料、发酵环境条件等因素进行分析，指出采用代谢工程方法优化生产菌种和发酵工艺，能够使菌种发酵的综合技术得到不断提高。 关键词：谷氨酸发酵；菌种；流加糖；生物素；发酵环境条件；控制 谷氨酸发酵生产是谷氨酸产生菌在其生命活动过程中分解、代谢营养物质、合成所需产物———谷氨酸的生化过程。在这个过程中，影响谷氨酸产生菌生长、繁殖、代谢及合成产物的因素很多，通过人工干预有目的地控制这些因素，使其最终满足谷氨酸菌种的代谢合成需要，可以达到增加产物、降低消耗的目的。谷氨酸产生菌既是反应过程的主体，也是反应过程的生物催化剂，它摄取原料的营养，通过细胞内特定的酶系列进行复杂的生化反应。其底物中的反应物透过细胞壁和细胞膜进入细胞体内，在酶的作用下进行催化反应，将反应物转化为产物并释放出来，细胞的内在特性及其代谢规律是影响生化反应的关键因素。因此，发酵是一个比其他工业过程更为复杂的动态过程。 1 选育优良菌种 高产、纯正、优良的菌种是保证发酵成功的前提，因此优良生产菌种的选育一直是谷氨酸发酵的主要研究课题。谷氨酸发酵一般采用黄色短杆菌（Brevibacterium fLavum）为出发菌株，根据代谢控制发酵原理进行人工诱变，定向选育高产率的菌种。 在菌种的保藏和培养过程中，与一切生物发酵生产一样，菌种是发酵生产成败的内因，生产选用高产、纯正、优良的菌种，必须做好 5 个方面的控制：①严格保藏温度和干燥的环境，满足菌种不变异、不退化、不污染的条件。保藏菌种要经分离、纯化、筛选，要有专门的冷藏设备，周围的环境要清洁无污染，对于细菌的保藏可采用- 80 ℃冰箱保藏液体菌种的方法。②生产使用的菌种要尽量减少传代次数，斜面菌种一般以 2 代~ 3 代可用于生产的为佳。③严格菌种培养的原材料，试剂原料经过摇瓶和生产试验后，要基本固定规格和生产厂家。有机原料更换批号要做摇瓶试验，每批都要留样做下批试验的对照。④一级种子的
综述：谷氨酸的发酵与提取工艺 第一部分谷氨酸概述 谷氨酸非人体所必需氨基酸，但它参与许多代谢过程，因而具有较高的营养价值，在人体内，谷氨酸能与血氨结合生成谷氨酰胺，解除组织代谢过程中所产生的氨毒害作用，可作为治疗肝病的辅助药物，谷氨酸还参与脑蛋白代谢和糖代谢，对改进和维持脑功能有益。另外，众所周知的谷氨酸钠盐即味精有很强烈的鲜味，是重要的调味品。 1996、1997、1998年味精年产量分别为55.0万吨、56.64万吨、59.03万吨。尽管如此，我国人均年消耗味精量还只有400g左右，而台湾省已达2000g。因此，中国将是世界上最大的潜在味精消费市场，也就是说，味精生产会稳步发展。这也意味着谷氨酸的生产不断在扩大[1]。 谷氨酸生产走到今天就生产技术而言已有了长足进步,无论是规模还是产能都今非昔比,与此同时各厂家还在追求完美, 这是行业进步的动力,也是生存之所需。实际上生产工艺是与时俱进的,没有瑕疵的工艺是不存在的。如:配方及提取方法现在是多种多样,有单一用纯生物素的,也有用甘蔗糖蜜加纯生物素的, 还有加玉米浆干粉或麸皮水解液及豆粕水解液等等;提取方法有:等电-离交、等电-离交-转晶、连续等点-转晶等等[2]。 本综述简述谷氨酸生产的流程及发酵机制，着重介绍谷氨酸的提取工艺。 第二部分谷氨酸生产原料及其处理 谷氨酸发酵的主要原料有淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、醋酸、乙醇、正烷烃(液体石蜡)等。国内多数谷氨酸生产厂家是以淀粉为原料生产谷氨酸的，少数厂家是以糖蜜为原料进行谷氨酸生产的，这些原料在使用前一般需进行预处理。 (一)糖蜜的预处理 谷氨酸生产糖蜜预处理的目的是为了降低生物素的含量。因为糖蜜中特别是甘蔗糖蜜中含有过量的生物素，会影响谷氨酸积累。故在以糖蜜为原料进行谷氨酸发酵时，常常采用一定的措施来降低生物素的含量，常用的方法有以下几种:(1)活性炭处理法; (2)水解活性炭处理法;（3）树脂处理法。 (二)淀粉的糖化 绝大多数的谷氨酸生产菌都不能直接利用淀粉，因此，以淀粉为原料进行谷氨酸生产时，必须将淀粉质原料水解成葡萄糖后才能供使用。可用来制成淀粉水解糖的原料很多，主要有薯类、玉米、小麦、大米等，我国主要以甘薯淀粉或大米制备水解糖。 淀粉水解的方法有三种：①酸解法；②酶解法；③酸酶(或酶酸)结合法。 1．酸解法用酸解法生产水解糖，其工艺流程如下： 原料(淀粉、水、盐酸)调浆→糖化→冷却→中和→脱色→过滤除杂→糖液2．酶解法先用α-淀粉酶将淀粉水解成糊精和低聚糖，然后再用糖化酶将糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的方法，称为酶解法。 与淀粉的酸解相比，酶解法具有以下一些优点：①酶解反应条件比较温和。细菌α-淀粉酶是在pH6.0～7.0、温度85～90℃条件下，将淀粉液化成能溶解于水的糊精和低聚糖；而糖化酶是在pH4.0～4.5、温度58—60℃条件下，完成糖化反应的。②由于酶的作用专一性强，因此水解过程中很少有副反应发生。③淀粉乳
目录 一、谷氨酸简介 (2) 二、谷氨酸发酵的工艺流程 (2) 2.1谷氨酸生产菌种 (3) 2.2生产原料 (3) 2.3培养基制备 (3) 2.3.1碳源 (3) 2.3.2氮源 (3) 2.3.3生物素 (4) 2.4种子扩大培养 (4) 2.5谷氨酸发酵 (4) 三、谷氨酸发酵的工艺控制 (4) 3.1环境控制 (4) 3.1.1pH (4) 3.1.2温度 (4) 3.1.3通风量 (5) 3.1.4泡沫 (5) 3.1.5无菌 (5) 3.2.细胞膜渗透性控制 (5) 四、小结 (5) 五、参考文献 (6)
谷氨酸发酵工艺 山东农业大学生命科学学院08级生物工程2班邢若枫 摘要：众所周知，日常所用调味料味精就是L一谷氨酸单钠盐(monosodiuo gluamate，MsG)。自1909年日本发明并工业化生产味情以来，几经变迁，已发展成为以谷氨酸发酵为主体的世界性氨基酸发酵工业。1956年从日本开始，以后先后由面二筋豆粕和废糖蜜浓缩物水解的方向，转向以糖质为原料的细菌发酵法。生产味精谷氨酸之类氨基酸的发酵，区别于传统的酿酒和抗菌素发游，是一种改变微生物代谢的代谢控制发酵。本文则就谷氨酸发酵生产过程、谷氨酸发酵机制和研究动向等方面，说明谷氨酸发酵的发展。[1] 关键词：谷氨酸；发酵；工艺；研究；发展 一、谷氨酸简介 谷氨酸一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。分子式C5H9NO4、分子量147.13076。 谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。谷氨酸可生产许多重要下游产品如L—谷氨酸钠、L—苏氨酸、聚谷氨酸等。氨基酸作为人体生长的重要营养物质，不仅具有特殊的生理作用，而且在食品工业中具有独特的功能。谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种，作为营养药物可用于皮肤和毛发。用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛乳头、毛母细胞有营养功能，并能扩张血管，增强血液循环，有生发防脱发功效。用于皮肤，对治疗皱纹有疗效。脑组织只能氧化谷氨酸，而不能氧化其它氨基酸，故谷酰胺可作为脑组织的能量物质，改进维持大脑机能。谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。在工业上，聚谷氨酸可降解塑料，是环境友好材料。[2] 谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵。谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。 谷氨酸产生菌主要是棒状类细菌，这类细菌中含质粒较少，而且大多数是隐蔽性质粒，难以直接作为克隆载体，而且此类菌的遗传背景、质粒稳定尚不清楚，在此类细菌这种构建合适的载体困难较多。需要对它们进行改建将棒状类细菌质粒与已知的质粒进行重组，构建成杂合质粒。受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株，特别是选用谷氨酸缺陷型变异株为受体，便于从转化后的杂交克隆中筛选产谷氨酸的个体，用谷氨酸产量高的野生菌或变异菌作为受体效果更好。供体菌株选择短杆菌及棒杆菌属的野生菌或变异株，只要具有产谷氨酸能力都可选用,但选择谷氨酸产量高的菌株作为供体效果最好。这样就可以较容易地在棒状类细菌中开展各项分子生物学研究。有了合适的载体及其转化系统后，就可通过DNA 体外重组技术进行谷氨酸产生菌的改造。这对以后谷氨酸发酵的低成本、大规模、高质量有较大的发展空间。[3] 二、谷氨酸发酵的工艺流程 菌种的选育，培养基配制，斜面培养，一级种子培养，二级种子培养，发酵（发酵过程参数控制通风量、pH、温度、泡沫），发酵液。（流程见图表1）