角膜地形图基本概念 一、基础概念 (1)角膜表面分区 ①中央光学区，正中央直径4mm面积的区域，非常近似于球面，曲率变化范围小于0．25D，具有最重要的屈光学意义。②旁中央区，距角膜中央4mm至7~8mm直径环形区域，此处角膜曲率逐渐降低，逐渐呈非球面。③周边区，距角膜中央7~8mm至11mm直径环形区域，此处角膜曲率明显降低，即变得扁平，呈非对称形。④角膜缘区，角膜移行至巩膜约0．5~lmm的环形区域。 (2)角膜中心 1)角膜瞳孔中心注视点与瞳孔中心连线在角膜表面的交点，通常用于角膜屈光手术前的定位。 2)角膜反射中心注视同轴光源时，同轴光线在角膜表面的反射点。 3)角膜视轴中心注视点与黄斑中心凹连线在角膜的交点，因难以精确定位，故临床上常以角膜反射中心替代之。 (3)角膜表面规则性指数,SRI 评价角膜中央4．5mm范围内表面规则性的一个指标，SRI值越小，表示角膜中央表面规则性越好，中国人正常值为0．2±0．2。 (4)角膜表面非对称性指数，SAI。反映角膜中央区相隔180度对应点角膜屈光力差值总和的一个指标，中国人正常
值为0．3±0．1。 (5)模拟角膜镜读数，SimK。中国人正常值为43．2±1．3D 二、正常角膜地形图 正常角膜地形图与年龄相关，并受生理周期、时间和睡眠的影响。决定角膜形态的因素有：曲率半径、角膜上皮厚度、角膜基质厚度、上皮表面规则程度及作用于角膜的机械因素等。正常角膜地形图常见类型： 1)非对称领结形占32．1％，屈光度分布呈不对称领结形。 2)圆形占22．6％，屈光度分布均匀，自中央到周边逐渐递减。 3)椭圆形占20．8％，中央屈光度分布均匀，周边分布对称性不均匀，近似椭圆。 4)对称领结形占17．5％，屈光度分布呈对称领结形，有对称性角膜散光，且领结所在子午线上屈光力最强。 5)不规则形占7．1％，屈光度分布不规则，表明角膜表面形态不好，注意排除泪膜异常、聚焦不准或注视不良。 正常角膜表面形态呈光滑规则对称的非球面，SRI为0．2±0．2，SAI为0．3±0．1，角膜中心屈光力为43±1．4D，SimK为43．2±1．3D，角膜下方与上方平均屈光度差值(I-S)为-0．3±0．8D，同一人双眼屈光力差值为0．5±0．2D。 三、角膜地形图的意义 （一）、检查意义 1、对角膜整体进行形态学的分析
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
角膜 [编辑本段] 角膜构成 角膜(Cornea)位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形，从前面看为横椭圆形。成年男性角膜横径平均值为11.04mm，女性为10.05mm，竖径平均值男性为10.13mm，女性为10.08mm，3岁以上儿童的角膜直径已接近成人。中央瞳孔区约4mm直径的圆形区内近似球形，其各点的曲率半径基本相等，而中央区以外的中间区和边缘部角膜较为扁平，各点曲率半径也不相等。从角膜前面测量，水平方向曲率半径为7.8mm，垂直方向为7.7mm，后部表面的曲率半径为6.22-6.8mm。角膜厚度各部分不同，中央部最薄，平均为0.5mm，周边部约为1mm。 角膜分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层(epithelium)、前弹力层(lami na elastica anterior又称Bowman膜)、基质层(stroma)、后弹力层(lamina elastic a porterior又称Descemet膜)、内皮细胞层(endothelium)。上皮细胞层厚约50u m，占整个角膜厚度的10％，由5-6层细胞所组成，角膜周边部上皮增厚，细胞增加到8-10层。过去认为前弹力层是一层特殊的膜，用电镜观察显示该膜主要由胶原纤维所构成。基质层由胶原纤维构成，厚约500um，占整个角膜厚度的90％，实质层共包含200-250个板层，板层相互重叠在一起。板层与角膜表面平行，板层与板层之间也平行，保证了角膜的透明性。后弹力层是角膜内皮
细胞的基底膜，很容易与相邻的基质层及内皮细胞分离，后弹力层坚固，对化学物质和病理损害的抵抗力强。内皮细胞为一单层细胞，约由500000个六边形细胞所组成，细胞高5um，宽18-20um，细胞核位于细胞的中央部，为椭圆形，直径约7um。
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细
第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
美国全新近视眼手术：角膜基质环 角膜基质环手术起源: 在日新月异的眼科屈光治疗领域中，有着三次里程碑式的突破。经过近半个世纪的摸索，人类通往光明的道路终于打开。 在上世纪70年代中期，RK手术的问世使人类的美好愿望成为可能，尽管由于科学水平的限制，手术还存在一些缺陷，但毕竟使通过医疗手段改变人类的屈光状态成为可能。 十几年前，经过无数次实验和论证，准分子激光这一时代性的技术被应用于屈光手术，由于其成熟的手术设计，精确的激光定位，以及良好的治疗效果，迅速在全球得到普及开展。十几年间，已经成功为几百万例近视眼患者实施手术，但对于部分患者而言，比如圆锥角膜，干眼症等情况，由于自身角膜的限制，只能是望洋兴叹。我们通常把这一类人群称为“近视眼手术的禁区”。一旦不慎突破，后果不堪设想。让人不禁联想起金庸小说中“有越雷池半步者，杀无赦”的场面，毫发之间，利剑高悬。 人类又开始了新的探索，直至角膜基质环手术的问世，使所有的疑问都得到了完美的解决。角膜环植入术通过在角膜旁中央区植入高分子
PMMA材料制成的150度双弧行结构，有效的降低中央角膜曲率，从而改善视力，摘掉眼镜。该术式对瞳孔区（视区）不造成任何损伤，比准分子激光手术直接损伤“视区”更加安全合理。可逆性调整更是这一技术的显著优势，即可以随时调整位置或取出，角膜中央地形可迅速恢复，患者还可选择其它治疗方法，不受任何影响。由于以上特点，该手术被业界称为“无创近视眼手术”为圆锥角膜，干眼症以及对安全性要求非常高的近视眼患者提供了一个完美的解决方案。 通过北京佳汇眼科大量的临床工作统计数据，目前圆锥角膜疾病发病率很高，大量的圆锥角膜患者面临着无法得到有效治疗，只能被动等待的尴尬处境。由于圆锥角膜有很大的几率可能因角膜穿孔而必须接受角膜移植手术，在国内，角膜的供体非常短缺，而且供体偏老龄化，可以想象一个青年患者，移植了一个70岁以上老人的角膜，由于角膜本身的问题，成功的几率很低。而且，即使手术成功，间隔几年还需要再次移植，一个30岁左右的患者，一般一生需要做多次角膜移植，每一次所需要承担的风险都会成比例增加。所以，我们深深理解圆锥角膜患者的困境和无助。经过院方领导长期的努力，北京佳汇眼科终于和美国INTACS公司达成战略合作伙伴关系并通过了美国专家的技能考核标准，北京佳汇眼科和美国著名的INTAC视光学矫正公司联手，在中国首先推出角膜基质环近视眼系列治疗系统，并被美国INTAC视光学矫正机构正式定为中国角膜基质环的科研教学手术培训合作基地。
-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定 广东学药学院 报ournJa lfoGuang dngo ParmhceutiaalcUn ievrsty i unJ 2．14， 030（3） C 7 5胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定 鉴 12 万丽 1 易，林，桦贝伟 剑（ 1 广．药学院东中医药研究 / 广东省院代性谢病疾中医防 治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点 究室/ 国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广 5州10006 ；．2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510 006）培 养神经干胞细（NSCs ）并，对其行进鉴定方。采法用动手 法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NS C 培s养基行进养培。细胞疫免光荧检法测N CSs特异性标记子 3 d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。果分离脑的细体胞培外养48 h已部分大壁贴神，经干胞细团第 3 代时，。少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经
神经球周围在存较多刺微。细表胞达一中种间丝蛋白，即巢 蛋白（nes ti）n 。论结成功分、离鉴定出C57小鼠 NSsC， 并在体外可件条进下行传扩增培代养。关键词：C 57 胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号Ｒ392 文献 志标码 A：d i： 10．o396 9 j/．sin．1s060873．8214003．0．22878 （3 214）0 00354340 章文编号：0016 -Is laoion，t culurtean d iedtifnciaitnoo f eunalrste mcel sl rfmoC5 e7bmyorin mccieW N Ai1L， IYHual n2 ，iBEI W iejia1n 1．（uGnagdogn TMCKey L abratory ofroM taboelc iisDaees，s Ky eLbarotorayo Modfluaintg Lievrt oTrat HepeyripemlaiS ATM， anC Ldeev 3l Labraotroyo f Liid Mpteboaism SAlTM，CIn stiute oftChinese edMciinla Sicneec，GsuagnongdPha racemtucail UinvesrtyiGuan，gzohu5 1006，0hCin；a 2．St m eCle Ｒlseeacrh Depratmne，t choSlo o fifL Sceeicens， uS nYtasn Ueinersivyt， Guagnzhou， 50006，1China） bsArtatc：Obejtivc Toei slotae cu，turl aned deitnfiy hte eunarlste m cllse（ SCN ）s． Meth od NSsCs for mftal eimce ewe irsloteda bydi sesticon ad nnzeyatmi dcgiestoin a，n ductlrude ni he opttima slreufreem SCN mdeimu． he Tpesifcicb ioamker orf
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法 胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。 具体步骤 一、ES培养基 在LIF存在的条件下维持细胞培养。 二、EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。 2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。 3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液
4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。 5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。 6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。 7. 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。 三、ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。 2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES:
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF 加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞。方法收集小鼠3.5 d的囊胚培养，用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，形成的ES细胞样集落，72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养，观察集落的生长状态，并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。结果 ES细胞有其典型的形态学特征：集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚；单个细胞体积小、核大；对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测，在AKP底物作用下，未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色，分化的不着色。结论昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞。 【关键词】小鼠胚胎干细胞 ES细胞系 Abstract：Objective To isolate and culture embryonic stem (ES) cells from Kunming species mouse. Methods The blastocysts of 3.5 d from Kunming species mouse were collected, cultured on the fibroblast cell feeder layers for 72 h. The cells from inner cell mass(ICM) were isolated and subsequently cultured in vitro.Then the stem cells were identified by AKP stainin
胚胎干细胞的培养及其影响因素 前言 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。 1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。 由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。 研究内容与方法 1.材料 1.1实验动物 昆明白小鼠。 1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C （Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因 子；干细胞生长因子；牛胰岛素。[2] 2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5] 2.1 胚胎的获取 昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。选妊娠11.5-16.5D 母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎[6]。 2.2 组织原代培养
中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第23期 2010–06–04出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research June 4, 2010 Vol.14, No.23 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 4303Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China Liu Feng ☆, Studying for doctorate, Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China liufengdyx@https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html, Correspondence to: Chen Hui-ling, Doctor, Associate chief physician, Department of Endocrinology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China huilingcheng_8@ https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html, Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30771025* Received:2010-03-24Accepted:2010-05-12 中南大学湘雅医院内分泌科，湖南省长沙市410008 刘 峰☆，男，1980年生，江西省安福县人，汉族，中南大学在读博士，主要从事糖尿病及其并发症的研究。 liufengdyx@https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html, 通讯作者：陈慧玲，博士，副主任医师，中南大学湘雅医院内分泌科，湖南省长沙市410008 huilingcheng_8@https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html, 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225(2010)23-04303-06 收稿日期：2010-03-24修回日期：2010-05-12(20100324013/W · Q) 小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G 的培养*☆ 刘 峰，雷闽湘，陈慧玲 Preparation of mouse feeder layer cells and culture of mouse embryonic stem cell SF1-G Liu Feng, Lei Min-xiang, Chen Hui-ling Abstract Liu F, Lei MX, Chen HL. Preparation of mouse feeder layer cells and culture of mouse embryonic stem cell SF1-G. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(23): 4303-4308. [https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html, https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html,] 摘要 刘峰，雷闽湘，陈慧玲.小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G 的培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(23):4303-4308. [https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html, https://www.doczj.com/doc/6c1816800.html,] 0 引言 胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团和原始生殖细胞中分离出来的全能干细胞[1-2]，具有无限增殖和全能分化的潜力。在研究生长发育胚胎发育、遗传疾病、肿瘤发生的理想模型，组织再生工程中具有广阔的临床应用价值，为疾病治疗提供了崭新的思路。近年来，胚胎干细 胞成为生物医学领域的研究热点之一。 胚胎干细胞体外培养条件要求非常严格，在体外极易分化、死亡，保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目前，要保持其未分化状态生长，必须在培养基中加入分化抑制因子——白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor ，LIF)或将其培养在能分泌分化抑制因子且无增殖能力的饲养层细胞上[3]，MEF 饲养层作为一种哺乳动物胚胎干
小鼠诱导型多能干细胞OSKM -1说明书 SCSP number: SCSP-1201 细胞名称: OSKM-1 细胞描述: 小鼠诱导型多能干细胞 小鼠品系: C57BL/6，Oct4-EGFP转基因小鼠 重编程转录因子：Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc 细胞来源: 中科院上海生命科学研究院生化细胞所李劲松研究组 SCSP 培养液: 小鼠iPS完全培养液：SCSP-618 DMEM（invitrogen 12430）485 ml ES级FBS（biochrom S0415）90 ml Glutamax（invitrogen 35050） 6 ml NEAA（invitrogen 11140） 6 ml Nucleosides（Millipore ES-008-D） 6 ml LIF（Millipore ESG1107）60 ul β-Mer（invitrogen 21985） 1.5 ml PS (Millipore TMS-AB2-C) 6 ml 细胞说明: 小鼠诱导型多能干细胞（iPS），带GFP基因 细胞总数/每支: 106 体积/每支: 500μl 传代方法:提前24h准备MEF细胞：事先包被0.2%明胶，按106/T25的 量铺MEF细胞，使用10%DMEM。待接种上mES细胞后更换 为mES完全培养液。 传代周期：3-4天传代比例：1：4—1：7 换液频率：每天 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃ 冻存液：培养液80%，FBS10%，DMSO 10% References: Jiang, J., Lv, W., Ye, X., Wang, L., Zhang, M., Yang, H., Okuka, M., Zhou, C., Zhang, X., Liu, L., et al. Zscan4 promotes genomic stability during eprogramming and dramatically improves the quality of iPS cells as demonstrated by tetraploid complementation. Cell research. 2013 Jan;23(1):92-106