科技知识讲座
植物基因的克隆与转化(3)
转基因植物中报告基因的检测方法
李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223)
检测转基因植物有许多方法。根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。
NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。在转基因植物、动物和原核生物中, NPT-Ⅱ基因广泛地被作为选择标记,用来研究基因的表达及其调节。
在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中研磨转化的植物材料,制取细胞的提取物。将提取物点在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上以避免酶的不可逆变性。电泳后,将胶从胶槽中取出,放在反应缓冲液里平衡,然后在聚丙烯酰胺凝胶上面注入一层含卡那霉素和(γ-32P) ATP底物的琼脂糖固定。NPT-Ⅱ酶接触底物后,酶促反应在凝胶夹层中进行并得到具有放射性的磷酸卡那霉素。通过S outhern转移将磷酸化的卡那霉素转移到磷酸纤维素滤纸上。基本分子卡那霉素和磷酸卡那霉素可以结合在滤纸上,ATP则不能。经过洗涤除去背景的ATP。通过放射自显影显示出放射性的卡那霉素,从而确定在聚丙烯酰胺凝胶上哪些条带上的蛋白质具有NPT-Ⅱ的活性。进一步的定量分析可以将滤纸上反映出NPT-Ⅱ活性的条带切下用闪烁计数器进行测量。
G us基因的检测: E.coliβ-葡萄糖苷酸酶的编码序列已经发展成为转化植物的报告基因系统。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶。采用一些商业上提供的特种β-葡萄糖苷酸酶作为底物,其反应产物可用分光光
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度、荧光(灵敏度较分光光度检测法为高)和组织化学(该方法可观察到外源基因在特点器官、组织,甚至单个细胞内的表达情况,它催化的底物为X-gluc,产物为蓝色化合物)的方法检测。β-葡萄糖苷酸酶的基因已经被克隆和测序,并编码稳定的酶,这个酶具有令人满意的性质,可以用来进行嵌合基因的构建及分析,它提供的嵌合基因系统很容易得到好的质量和高的灵敏度。尤其在组织化学分析中应用这个标记基因,可以判定嵌合基因在不同细胞类型、器官和发育阶段的活性定位。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。
荧光素酶基因检测系统:荧光素酶基因是一种动物蛋白基因,目前研究较多的是荧光虫荧光素酶及细菌产生的荧光素酶。荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类,在镁离子、ATP及氧的作用下酶使底物脱羧,生成激活态的氧化荧光素,发射光子后,转变为常态的氧化荧光素。由于这类酶的活性不需要转录后修饰,无二硫键,不需要辅酶因子和结合金属,因此几乎可以在任何宿主细胞中表达。荧光素酶基因作为一个报告基因还有一个优点,即检测的灵敏度高,检测迅速而且操作方便,对于研究低水平表达的基因有较大的意义。由于生物中普遍缺少内源荧光,因此该基因几乎不存在背景干扰问题。荧光素酶与反应底物混合后所产生的荧光持续数秒到数分钟即消失。检测需要闪烁计数器和荧光计。荧光素酶的可检测浓度在理想状况下少于10-20m ol/L。
胭脂碱和章鱼碱检测:冠瘿碱合成酶基因存在于农杆菌T i质粒或Ri质粒上,该基因与T i质粒的致瘤作用无关,故在构建载体时,有时将该基因保留作为报告基因使用。该基因的启动子是真核性的,在农杆菌中该基因并不表达,整合到植物染色体上后即行表达,编码与冠瘿碱合成有关的酶,催化冠瘿碱合成。目前已发现的催化冠瘿碱合成的酶主要有两种,一种是胭脂碱合成酶,另一种是章鱼碱合成酶。其检测原理是通过纸电泳分析筛选出存在胭脂碱和章鱼碱的转化植物材料。将植物材料直接挤压在电泳图谱纸上,进行电泳。在电场作用下,胭脂碱和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分离开,用菲醌这一敏感的荧光染料进行染色,即可进行观察。
Cat基因(即氯霉素乙酰转移酶基因)的检测:氯霉素最早是从放线菌中分离出来的抗菌素,它能够选择性地与原核细胞50S 亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合,抑制蛋白质生物合成。Cat基因编码氯霉素乙酰转移酶,该酶催化乙酰C oA转向氯霉素形成乙酰化产物,乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素的活性,失去干扰蛋白质合作的作用。真核细胞不具有氯霉素乙酰转移酶基因,无该酶的内源性活性,因而Cat基因可以作为真核细胞转化的标记基因及报告基因,Cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性,而非转基因植物则不具有这种抗性。Cat基因的活性可以通过反应底物乙酰C oA的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型C oASH的生产来测定,目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DT NB分光光度计法。Cat基因不仅用来检测外源基因是否转化成功,而且在研究转化的外源基因在植物体内的表达调控中起重要作用,是目前研究基因表达调控最常用的报告基因之一。
Pat基因的检测:Pat基因为抗除草剂基因,它编码PPT乙酰转移酶(PAT)。PPT是一种谷氨酸结构类似物,能竞争地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶(G S)的活性。当PPT 存在时,G S活性被抑制,细胞内NH+4积累,细胞中毒而死亡。PAT基因编码的PPT 乙酰转移酶可以催化乙酰基有乙酰C oA分子上转移到PPT分子的游离氨基上,使PPT 乙酰化,乙酰化了的PPT失去对G S的抑制
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国外养鱼新法种种
变温养鱼法 莫斯科农业大学的试验养殖场,水生物专家们经过试验,成功地开发出变换水温养鱼的新方法,可在不改变鱼饲料的前提下,大大加快鱼苗的生长速度。这种方法是在育鱼苗的池中,安装一个调控加热器,通过对池水加热,使池水温度略高于普通水温110℃～115℃,并在停止加温、水温降至正常后,再继续进行加热。这样,依次循环,使池水的水温经常在110℃～115℃的范围内变化,从而使鱼苗的生产速度加快40%左右,同时,可使鱼苗出水后对水温的适应性更强,死亡率降低2%～3%。
激素养鱼法 加拿大的生物学家埃德瓦尔特多纳尔德森,将从小鸡和小牛身上提取的生长激素荷尔蒙,加入到鲑鱼鱼苗的饲料中去,可使鱼的生长速度快1倍,日增重指数可达到2138%,而使用普通饲料,日增重指数仅为1148%。美国科学家还从鱼身上提取生长激素,植入另一条鱼,可使植入生长激素的鱼体内,产生比原来多1倍的生长激素,从而使鱼的生长速度大大地加快,日增重可提高50%以上。
咸水养鱼法 新加坡国立大学的科学家,采用盐度为3%的淡咸水饲养鲤鱼仔鱼,可明显地提高鲤鱼仔鱼的成活率、生育率和生长率。如果在淡咸水中饲养的鲤鱼仔鱼的饲料里,再加入1×10-8的甲状尿素,制成微型胶囊后饲喂,还可增进其食欲,加快其生长速度。
音乐养鱼法 日本的许多养鱼场让鱼听音乐,以促进鱼生长。在此基础上,还开发出便于捕获的新的音乐养鱼法。这种新的音乐养鱼法,就是在鱼卵人工孵化以后,每次喂幼鱼饵料时,都伴放一种音乐,使幼鱼形成听到这种音乐,就到进食地点进食的习惯。将幼鱼放在大面积鱼池进行饲养后,每次投食,继续伴放这种音乐,使鱼集中到进食地点。所以,到捕捞成鱼时,只要一伴放这种音乐,鱼就和往常一样,到进食地点来,得以顺利地将其捕捞。
选择养鱼法 美国佛罗里达州泊尔梅特水产公司的专家,采用选择性繁殖技术,经过8年时间, 28代的选择性繁殖,将称为迪拉彼亚的鱼,培育成一种无刺的肉用鱼。这种无刺的肉用鱼,只有一根脊椎,鱼刺已全部退化,食用时肉中不再带刺。其成鱼的个体重约两磅,肉味鲜美。一尾雌鱼一年可繁鱼苗约6000尾。目前,这种无刺的肉用鱼,已经推广到美国的35个州和一些外国的水产公司进行养殖。
扬州市宝应叶挺东路17号信息部(225800) 何 人
作用,因而转化了Pat基因的植物表现出对除草剂PPT的抗性。目前PPT来源有两种:一种是化学合成的,称为Basta;另一种是通过微生物发酵产生的含有PPT的三肽,称为Bialaphose。Pat基因也有两种,一种是来自Streptomyces hygrocopicus的bar基因(因其抗Basta而得名),另一种是来自S.viri2 dochrgtnes的pat基因,bar和pat都编码PAT。Bar基因可以作为转化体筛选标记,又因其检测的灵敏度高,所以也用作报告基因。Bar基因的表达产物PAT活性测定方法有硅胶G薄层层析法及DT NB比色分析法。
DHFR基因的检测:DHFR基因又称氨甲喋呤抗性基因,编码二氢叶酸还原酶。二氢叶酸还原酶在DNA生物合成中起重要作用。氨甲喋呤与二氢叶酸结构类似,竞争性抑制二氢叶酸还原酶活性。植物细胞的二氢叶酸还原酶对氨甲喋呤极为敏感。以氨甲喋呤作为选择剂筛选转化细胞时,非转化的植物细胞在含有一定浓度氨甲喋呤的培养基上不能正常生长,而转化细胞中含有标记基因表达的二氢叶酸还原酶,氨甲喋呤对它的抑制作用很弱,所以转化细胞能够在添加氨甲喋呤的培养基中生长。二氢叶酸还原酶活性检测的方法是将植物材料在含有氨甲喋呤及放射性标记的磷酸盐培养上培养,然后提取总DNA,琼脂糖凝胶电泳后将X胶片放在凝胶上放射自显影检测放射性标记的磷酸盐是否掺入到DNA分子中。X胶片上出现放射性植物DNA条带的样品具有DHFR活性,证明DHFR基因已经在植物细胞内表达。
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基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.doczj.com/doc/618965786.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
植物转基因原理与技术 植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程.微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。 原理 根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同,可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系.植物转基因流程图如下所示。 外植体）
愈伤组织瞬时表达 外源基因植物受体细胞 原生质体 生殖细胞稳定表达 获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定(PCR，Southernblot，Northernblot，生理指标鉴定等) 技术 就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术,直接转化技术和种质转化技术。下面分别叙述。 一载体转化技术 载体转化技术是指通过农杆菌的Ti或Ri质粒,植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法.其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法.病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。
转基因动物与克隆动物的区别：转基因，用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物[1]。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动（有性繁殖）。克隆，通常是一种生物技术，以人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（例如：植物），产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。 基因工程的内容，原理，步骤：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术[1]；取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；构建基因的表达载体；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。基因工程是人类根据一定的目的和设计,对DNA 分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术 现代生物工程：现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技；可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。[1] 生态系统(Ecosystem)是指在一个特定环境内，相互作用的所有生物和此一环境的统称。此特定环境里的非生物因子（例如空气、水及土壤等）与其间的生物之间具交互作用[2]，不断地进行物质的交换和能量的传递，并借由物质流和能量流的连接，而形成一个整体，即称此为生态系统或生态系。 中国的环保策略：科学协调行业间关系，制定持续发展规划；实现森林资源的供需平衡，持续利用；建立自我调节的生态系统；提高人们的“绿色环保”意识；完善相关法律并严格执行；林业的可持续发展，城市的可持续发展 公害public nuisance，凡由于人类活动污染和破坏环境，对公众的健康、安全、生命、公私财产及生活舒适性等造成的危害均为公害，由于大气污染、水体污染、噪声污染、振动、恶臭等所影响和侵害的是不特定的公众，所以由此产生的危害一般均称为公害。
转基因克隆技术研究进展 摘要：转基因克隆技术是最近发展起来的利用细胞核移植技术生产转基因动物的方法，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。与传统转基因方法相比具有明显的优势。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。 关键词：转基因动物克隆转基因克隆 引言： 转基因动物( transgenic animal)是指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因组整合，并随细胞的分裂而增殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。[ 1 ]在转基因动物作为当今生命科学中一个发展最快、最热门的领域正在改变着生物医药、农业生产、环境保护、生物材料，甚至是整个生命科学的研究与发展面貌的时代背景下，如何高效率低成本的生产出所期望的转基因动物已成为科学界甚至商界关注的热点。 克隆(cloning)是英语“clone”音译，来源于希腊语“klon”[2]，原意是扦插枝条，即无性繁殖。动物克隆指不通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传物质后代的过程。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，所以在一般情况下人们往往把它称为动物克隆技术。克隆技术的发展为转基因动物的研究应用带来了契机，两者的结合既有迫切性又有必然性。而且，这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化[3]。 转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。[3]转基因技术与克隆技术结合，创建转基因克隆动物，已经成为本世纪培育遗传工程动物的主导性技术途径。转基因克隆技术作为一种高效而低成本生产转基因动物的技术已经为转基因动物的生产带来了新的契机。本文概述了传统转基因技术的缺陷、转基因克隆技术的优越性、研究概况以及目前存在的问题等。 1.动物传统的转基因技术概述 现代转基因动物研究始于20 世纪80年代初。1980年， Gordon等首次报道用显微注射法获得转基因小鼠。1982年， Palmiter等将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了个体比对照鼠增大一倍的“超级小鼠”，从此揭开了转基因动物研究的新篇章[1，4]。先后出现了显微注射法、反转录病毒载体法、胚胎干细胞介导法、精子载体法等转
科技知识讲座 植物基因的克隆与转化(3) 转基因植物中报告基因的检测方法 李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223) 检测转基因植物有许多方法。根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。 NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。在转基因植物、动物和原核生物中, NPT-Ⅱ基因广泛地被作为选择标记,用来研究基因的表达及其调节。 在含蛋白酶抑制剂的缓冲液中研磨转化的植物材料,制取细胞的提取物。将提取物点在非变性的聚丙烯酰胺凝胶上以避免酶的不可逆变性。电泳后,将胶从胶槽中取出,放在反应缓冲液里平衡,然后在聚丙烯酰胺凝胶上面注入一层含卡那霉素和(γ-32P) ATP底物的琼脂糖固定。NPT-Ⅱ酶接触底物后,酶促反应在凝胶夹层中进行并得到具有放射性的磷酸卡那霉素。通过S outhern转移将磷酸化的卡那霉素转移到磷酸纤维素滤纸上。基本分子卡那霉素和磷酸卡那霉素可以结合在滤纸上,ATP则不能。经过洗涤除去背景的ATP。通过放射自显影显示出放射性的卡那霉素,从而确定在聚丙烯酰胺凝胶上哪些条带上的蛋白质具有NPT-Ⅱ的活性。进一步的定量分析可以将滤纸上反映出NPT-Ⅱ活性的条带切下用闪烁计数器进行测量。 G us基因的检测: E.coliβ-葡萄糖苷酸酶的编码序列已经发展成为转化植物的报告基因系统。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶。采用一些商业上提供的特种β-葡萄糖苷酸酶作为底物,其反应产物可用分光光 53 2000年第6期 云南农业科技
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通
动物克隆与转基因 一、人工辅助生殖通常都指那些技术？这些技术主要针对何种需求（可以从阐述技术优缺点的视角来分析）？ 人工辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART）主要包括人工授精(artificial insemination, AI)、卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation, IVM)、体外受精(in vitrofertilization, IVF)、胚胎体外发育(in vitro production, IVP)、胚胎移植(embryo transfer, ET)和配子冷冻等。这些技术主要可用于改善动物的生殖性能、保护生物多样性和推动基础研究等。在动物方面，可用于商业（如高产）或名贵动物的繁殖及濒危动物的保护研究。此外，还有助于转基因动物克隆和转基因的相关基础研究。 在人类方面，有人工授精、试管婴儿、卵浆内单精子注射技术（ICSI）、种植前遗传学诊断（PGD）及辅助孵化（AH）等，试管婴儿技术（包括体外受精和胚胎移植等）主要解决不孕不育症，自我调控人类的生殖。但是，人工辅助生殖技术还有很多不完善的地方，对于不同的动物研究进展情况不同，主要在超排卵、核移植克隆等方面有待进一步发展。用于人类的辅助生殖技术，也存在一定的弊端，如无法保证妊娠率、多胎率较高、伴随着并发症以及费用风险较高等。此外，用于人类的辅助生殖技术还会引发一些伦理问题。 尽管人工辅助生殖技术尚存在一系列问题，但随着其快速的发展和完善，将有着更加广泛的应用。 三、胚胎分割、胚胎克隆和体细胞克隆在技术方法上有何不同？简单
分析体细胞克隆未来的应用方向和途径。 胚胎分割（Embryo bisection）的理论根据是动物细胞具有全能性，指借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。 胚胎克隆以未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞作为核供体，与体外成熟后去核的卵母细胞融合构建成克隆胚胎，或再从克隆胚胎内分离出细胞移入成熟去核卵母细胞融合后即可发育成再克隆胚胎，将这些胚胎移入同期发情的母体得到克隆体和再克隆体。 体细胞克隆则是取出一个双倍体细胞核移入一个去核的卵细胞，并在一定条件下进行核卵重组，再植入代孕母体中发育成新个体的过程。供体细胞均来自高度分化的体细胞，其种类繁多、数量无限。 体细胞克隆技术在动物育种及珍稀动物保护领域具有极其广阔的应用前景，异种克隆则为器官移植提供了一种全新的、可行的方法。体细胞克隆技术在未来将会与基因工程、干细胞技术相互结合，往简单、实用、高效等方向发展。 参考文献： [1]韩堃，石艳春等人类辅助生殖技术研究进展（J）Chinese Journal of Woman and Child Health Research Vo1．19 No．6 2008 [2]刑华犬科动物的生殖生物学与辅助生殖 [3]马利兵，王凤梅等哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展（J）生物技术通报，2009，5：51-54
水稻转基因 一、实验目的 1.学习水稻组织培养的方法 2.学习水稻转基因的方法 二、实验原理 目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。 历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。 三、试验步骤： 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；
2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周） 一、农杆菌培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。 二、共培养和抗性愈伤组织的选择 1．感菌与共培养： 1）取培养好的菌液500μl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01； 2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟； 3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 4）将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2.5天。 2．选择： 1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
转基因克隆动物技术涉及的生物学问题生物学转基因 1 转基因克隆动物技术简介转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因导入其中，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。这种结合不仅仅是简单的技术叠加，而是技术的重组、综合和优化，它实现了高效率、低成本的转基因动物制作，已成为当前动物生物技术领域研究的新热点。 1.1转基因克隆动物技术的发展历程 Wilmut研究小组在取得克隆绵羊“多利”后，Schnieke等用阳离子脂质体介导外源基因转染到培养的绵羊胎儿成纤维细胞中，然后将细胞融入去核卵母细胞中，经激活后在体外培养至囊胚期，移入同步受体母羊中，最后获得6只转基因绵羊。 Cibelli等用同一方法获得了3只转基因牛。 xx年6月21日，日本静冈县中小家畜实验场宣布，该实验场和北里大学合作，成功克隆出了体内含有水母基因的转基因猪。该实验第一次成功地把转基因技术和体细胞克隆技术有机地结合在一起。
xx年12月24日，我国东北农业大学刘忠华教授的转基因克隆猪获得成功，3头含绿色荧光蛋白的转基因克隆猪自然分娩。 1.2转基因克隆动物培育过程 转基因克隆动物的培育过程如图1所示。 2 转基因克隆动物涉及的生物学问题 2.1生物技术 2.1.1基因工程 图1中过程A表示目的基因的获取，目前常用的方法有以下几种：①从基因文库中获取目的基因；②利用PCR技术扩增目的基因；
③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。得到目的基因后，还要构建基因表达载体，才能导入受体细胞。 图1中过程C表示将目的基因导入受体细胞，常用的方法为显微注射法。目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，还需要对目的基因进行分子水平上的检测。检测方法包括：DNA分子杂交法、DNA-RNA杂交法和抗原一抗体杂交法。 2.1.2细胞工程 图1中过程B表示从供体动物的某一部位取体细胞，在体外进行动物细胞培养，得到能进行传代的体细胞。过程D和E表示采用显微操作技术，用微型吸管吸出供体细胞的细胞核，注入去核的卵母细胞中(也有人将供体细胞注入受体细胞中)。过程F表示从受体动物中获得卵巢，再采集卵母细胞，在体外培养成熟，即培养到减数第二次分裂中期。过程G表示通过电刺激使两个细胞融合，得到重组细胞。 2.1.3胚胎工程
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
植物转基因技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
生物工程的导论论文之植物转基因技术 生物1002班郭雅莉 201041006 摘要：目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。为此，我将对植物转基因技术及其应用、和当代社会发展的概况进行系统阐述，同时对转基因食品的安全性问题进行系统的讨论。 关键词：国际状况转基因技术应用安全性问题 自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 然而由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食 品”[1]。 一、国际植物转基因技术状况简介 转基因技术已在多种植物上获得成功，转基因的棉花、大豆、玉米、水稻、烟草、番茄、油菜等重要粮食作物和经济作物已作为商品投入市场。其进入田间实验的种类不断增加，除转基因粮食作物之外，转基因蔬菜、瓜果、牧草、花卉、林木及特用植物数量逐渐增加，基因种类和来源日益丰富，转基因性状日趋多样复杂。 在所涉及的转基因方法中，农杆菌介导法占50种，基因枪轰击法24种，DNA直接转移法2种，电击介导法2种，化学介导法1种[5]。已把一
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ， 100ml ，Agar (琼脂) 100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=。 2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它ＤＮA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，19９５;舒群芳等,199７),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。?1功能克隆（funｃtｉonal Cloｎing) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆（Colｌis,1995)。其具体作法是：在纯化相应的编码蛋白后构建cDＮＡ文库或基因组文库,DNＡ文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,（2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从ｃＤNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst１和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对
灰质葡萄孢（Bｏtrytiｓ cineｒce)的抗性，在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hａin等,１985)。Kondo等198９年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989）。周兆斓等构建了水稻ｃDNA文库，分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的ｃDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化，使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucｕmｂer Mｏｓaic virus)（CMV)，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,19８９)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(ｐotato ｖｉruｓ X， pvx）,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因，并将外壳蛋白基因转入马铃薯中，以期获得抗pｖｘ病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。病毒外壳蛋白（Ｃoａt proteiｎ cp)基因的成功克隆，可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Proteｉn Mediated Rｅsiｓtａnｃｅ CPMR)或病毒ＣP-ＲN Ａ介导的抗性。Vａｎｋａn 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9，可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物（Van Ｋan 等,１9９1)。我们１9９5年构建了天麻cDＮA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的ｃDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳 等,1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、
动物克隆技术的发展和现状 ——动物遗传工程文献综述
动物克隆技术的发展和现状 摘要：本文简要概述了克隆的概念，全面综述了国内外动物克隆技术及其原理、研究进展和现状，并根据当前克隆技术理论和实践，对该技术的应用和价值进行综述和讨论。 关键词：动物克隆；核移植；体细胞克隆 动物克隆技术，又称动物核移植或无性繁殖技术。它是通过特殊的人工手段，对动物特定发育阶段的核供体（如胚胎分裂球或体细胞核）及其相关的核受体（如去核的原核胚或成熟的卵母细胞），不经有性繁殖，进行体外重构，并通过胚胎移植，从而达到扩大同基因型动物种群的目的。 动物克隆技术在畜牧业生产、医药生产和疾病治疗、生物学基础理论研究以及野生濒危动物的拯救和保护等诸多领域发挥着巨大作用。 1 动物克隆技术的发展 1.1 国外克隆技术的发展： 早在1938年，Spemann就通过蝾螈胚胎分割实验证明了自己的核移植设想。 1952年，Briggs和King将青蛙卵进行核移植，获得重组胚并发育形成小蝌蚪，20世纪六七十年代两栖类、鱼类也相继克隆成功[1]。 1996年,Hoppes克隆小鼠成功标志首例哺乳动物克隆成功[2]。随后，他采用显微去核和病毒介导相继获得克隆羊、克隆兔、克隆猪[3,4]。 1996年，美国克隆猴获得成功，这是人类首次灵长类克隆成功，并引发克隆人与伦理争论[5]。 1997年，克隆绵阳“多莉”的诞生，标志体细胞克隆进入了一个新时代。 1998年，Wilmut等利用核移植和转基因技术，成功地获得了转基因克隆绵阳。 1999年，华裔科学家赖良学等通过基因敲除和体细胞克隆技术相结合，成功获得“基因敲除”克隆猪。 2002年，华裔科学家杨向中宣布成功获得具有两种人类凝血因子的“双基因”克隆猪。 1.2 国内克隆技术的发展 我国的动物克隆技术相对发展比较晚，但几年发展速度较快并且受到国际同行的高度肯定和认可。无论是在同种动物的胚胎细胞克隆、同种动物的体细胞克隆还是异种动物的克隆方面都有很大进步。 同种动物胚胎细胞克隆：1972年，童第周利用核移植技术首次获得了克隆黑斑鲤鱼。1990年，张涌等由同一个胚胎经过多代克隆之后，分别移植于几个羊受体内获得了45只克隆羊。1993年，王斌和范必勤等通过胚胎细胞核移植得到了3只克隆兔。1995年，邹贤刚和杜森进行了山羊继代研究，得到了4只克隆羊。1997年，陆长富和卢光秀等供货的了6只核移植仔鼠。1998年，杜森等用羊胎儿成纤维细胞获得2头克隆山羊。 同种动物体细胞克隆：2002年10月16日中午，中国第一头利用玻璃化冷冻技术培育出的体细胞克隆牛在山东省梁山县诞生；2005年，我国第一头体细胞克隆猪诞生。2013年，一胎8头体细胞克隆小猪在南京农业大学诞生，这是江苏省首例利用徒手克隆核移植技术生产的克隆猪；2013年，世界首例体细胞克隆山羊“元元”在杨凌西北农林科技大学诞生，这一重大科技事件的发生，标志着我国在世界克隆技术领域占据领先地位。
转基因原理、GMO检测原理及生物安全评价 摘要从技术原理和方法进展着手，综述了植物转基因的不同方法。植物基因转化方法主要包括载体介导的转化和直接基因转移，着重阐述了植物转基因方法的机制以及各种方法的适用范围、应用实例和进展；比较了相互的优缺点。并讨论了GMO 生物安全评价的主要内容、常用的检测方法和近年来国内外有关生物安全问题的研究进展。 关键词植物转基因；载体介导法；直接导入法；GMO；生物安全；检测方法 Abstract In the thesis，the different measures of piant gene transformation were summarized according to the technoiogy principie and method deveiopment，especiaiiy in expatiating the mechanism and appiicabie range of the methods，providing some exampies in appiication and deveiopment，and its advantage and disadvantage.And discussed GMO biological safety evaluation main content of commonly used detection methods and the recent research progress on biological safety of. 早在20 世纪70 年代，人们就开始探索植物转基因研究。1970 年，Morton 等人关于钙盐处理大肠杆菌即能吸收外来DNA 的发现，奠定了磷酸钙诱导外源基因的高效转化。近几十年，随着高等植物的细胞培养、组织分化和再生，以及基因重组技术发展日趋成熟，植物转基因技术应运而生。而随着现代生物技术的迅速发展,生物安全问题逐渐成为国际社会关注的热点问题之一。 一、植物转基因技术和方法概述 1 载体介导法 1.1 农杆菌介导法农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。它是利用根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）的T（i Tumer induce）质粒和发根农杆菌（Agrobaterium rhizogenis）的R（i Root induce）质粒上的1 段T- DNA 区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中，T - DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。 1.2 病毒介导法病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体。植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有3 种：t单链RNA 植物病毒载体系统，是以单链RNA 为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA，将其克隆到质粒或粘粒载体上，把外源基因插入到病毒的cDNA部分，通过体外转录，将带有外源基因的病毒DNA 感染并进入植物寄主细胞。Kozicl 和Siegal 于1984 年首先应用