植物细胞工程的应用
摘要：使用细胞大规模培养技术可以在可控的和可重复的条件下生产天然产物，而不会受到病虫害、地理、气候、季节等因素的影响，并且产物分离、提取操作相对简单。同时也将对保护人类的生存环境起到重要作用。本文介绍了植物细胞工程在制药、食品、杀虫剂、化工、环境等方面的应用,主要介绍了植物的次生代谢物质在上述一些方面所占的重要地位。
关键词：植物细胞工程植物的次生代谢物质生物制药植物性杀虫剂
细胞工程学是以细胞生物，组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物形状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。植物细胞工程是在植物细胞全能性的基础上，以植物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养，繁殖人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良品种或创制新种，或加速繁殖植物个体，或获得有用产物的过程统称植物细胞工程。
植物中含有大量的次生代谢物质，可为人类提供药品、色素、调味剂、香料、兴奋剂、杀虫剂等，仅就药物而言，美国现有一百二十多种处方药是植物药，欧洲也约有四分之一的处方药来自植物。这些天然产品与人类生活息息相关，有很大的实用价值；其中有部分具有特殊用途，且极难得到，价格昂贵。从植物中生产这些物质存在很多
缺点，植物受气候地理和季节的限制，其质量和产量受不可预测的环境因素影响，分离过程复杂而耗资很大。植物细胞培养主要集中在制药工业中的一些价格高﹑产量低﹑需求量的的化合物上（如紫杉醇﹑长春碱﹑紫草宁等），其次是油料（如小豆蔻油﹑春黄菊油等）﹑食品添加剂（如生姜﹑洋葱﹑香子兰等）﹑色素（如番红花﹑姜黄等）﹑调味剂（胡椒﹑留兰香等）﹑饮料（咖啡﹑可可等）﹑树胶（如阿拉伯树胶等）等。
二十世纪七八十年代以来 ,植物组织培养、植物原生质体培养等各种植物培养技术与植物细胞培养技术共同发展 ,在培养基配方、环境条件控制、悬浮培养技术等研究方面相互借鉴、相互促进 ;而大规模培养技术方面 ,得益于微生物发酵技术的飞速发展 ,各种各样的反应器如气升式、气泡柱式、模式等反应器相继得到应用 ,使得植物细胞大量培养的研究迅速得到借鉴发展。目前，利用细胞工程生产药物是细胞工程研究开发中最活跃、进展最快的一个产业。大规模植物细胞培养技术经过几十年的努力研究 ,已取得很大的进展 ,有些药用植物种类已实现工业化生产 ,如从希腊毛地黄细胞培养物通过生物转化生产地高辛细胞培养、从日本黄连物中生产黄连碱、从人参根细胞中生产人参皂甙等;相当种类的药用植物细胞大量培养已达到中试水平 ,如长春花生产吲哚生物碱、丹参生产丹参酮、青蒿生产青蒿素、红豆杉生产紫杉醇、紫草生产萘醌、三七生产皂甙等等。目前大多数植物细胞大规模培养生产药物距商业化生产还有一定差距 ,主要是由于:（1）植物细胞的生长周期长 ,易污染。（2）植物细胞对
生物反应器的设计装置要求较高。（3）高产细胞株较难获得。目前据报道只有二十多种植物的细胞培养物 ,其次生产物含量超过原植物 ,原因被认为是培养细胞的形态分化受到抑制 ,而大多数次生产物要在分化了的细胞中产生。由于以上的问题 ,加上与之相比 ,直接提取法成本很低 ,所以在很大程度上限制了大规模植物细胞培养技术生产药物走上商业化生产的步伐。但是 ,对一些不易栽培、稀少、不能或难以化学合成、有很高应用价值的药物 ,如紫杉醇 ,用这种方法开展研究进行生产还是很有商业价值的 ,而且从长远和环境保护的角度看 ,它应该有非常广阔的商业前景。
植物品种改良的主要目的是获得高产、优质和具有高抗性的优良品种。植物细胞工程在育种方面、通过单倍体育种技术，已培育出二百六十多种植物的单倍体植株；通过体细胞培养，筛选了多个具高抗性和高营养的体细胞突变体；通过体细胞杂交已获得多个种间、属间或科间的体细胞杂种植物。根据根瘤与豆科植物根系有共生关系的原理．使用根瘤菌接种花生、玉米等旱生作物，试验根瘤菌能否与旱生作物有共生关系和共生条件；除豆科植物外，寻找在自然界中能与农作物有共生关系的固氮菌，并研究有利于共生的条件；通过适应性变异、原生质体融合等途径创造出能直接利用分子氮的谷类、蔬菜等作物，降低农业成本，提高粮食与蔬菜中的蛋白质含量。光合作用是绿色植物通过叶绿体把太阳能转换成化学能的生物合成过程。如果能通过改造叶绿体的生物功能，培育出在沙漠、山坡、水涝和高盐等不同自然条件下高效率转换太阳能的速生植物，将对发展畜牧业与生物能
源产生巨大的作用。再者，利用细胞工程进行抗旱和抗盐作物的研究也具有十分诱人的前景。植物细胞工程是细胞工程中比较活跃、进展比较快的一个领域，它和其他植物育种技术密切结合，已形成了一条植物—细胞—植物的生产途径．加速了植物品种改良。
半个多世纪以来，有机合成杀虫剂的广泛使用，逐渐产生了严重的3R问题，即害虫抗药性、残留、害虫在猖濒。因此人们把目光转向了与环境有较高和谐度的植物性杀虫剂，由于利用植物细胞培养生产具有杀虫、杀菌活性成分的植物源农药与传统的化学农药相比有许多无可比拟的优点，所以细胞工程在这方面的应用也成为国内外研究的热点。近二十年来，国内外都投入了大量的人力、物力致力于植物园农药的研究与开发。国外对印柬、菖蒲、番荔枝等杀虫植物进行了较多的研究，其中尤以对印间的研究最为深入系统。国内在此方面的研究进展也较快，对川柬、苦皮藤、砂地柏、马桑、黄杜鹃、紫背金盘、苦参、八角茴香等多种植物都进行了详细的研究。应用细胞工程生产的新型农药在农作物病害的防治方而已取得一些可喜成果，番茄花叶病是一种较普遍的病害。人们将番茄花叶病病毒经亚硝酸诱变，培育成亚硝酸突变体N14，它是一种防治番茄花叶病病毒的弱毒疫苗。在番茄幼苗移栽前，只要把幼苗根部浸入含有该弱毒苗的液体中处理1min，移栽后长出的番茄植株就有抗病能力。这种新型的植物性杀虫基因期货形成分为天然物质，使用后以降解，对环境污染小；对害虫不易产生抗药性；对人和高等动物无害且开发成本低，故可对当今的环境污染有一定的缓解作用。
当今食品使用的甜味剂主要是砂糖，由甘蔗与甜菜提取制备而成：如何通过细胞工程生产新型甜味剂以及食用天然色素、维生素已成为研究开发的重点。大规模培养植物细胞生产调味品、香料、维生素和有机酸等将会有较大发展。自1984年日本三进石油化学公司利用紫草宁细胞培养生产的紫草宁色素研制出壳世界第一支生物口红后，利用细胞培养生产色素及化妆品也有了很大的发展。如通过长春花植物细胞悬浮培养可获得用于化妆品原料的高质量的熊果苷，用人参细胞大规模培养生产的人参提取液及人参皂苷在化妆品中已广泛地用作营养添加剂，此外还有植物细胞培养的甘草提取物等都在化妆品中应用广泛。
石油成为化工原料的主要来源是不可再生的有限资源，各国对化工原料主要依靠石油的现状感到不安，而植物通过光合作用，合成糖，再转化为淀粉、维生素、木质素等，都是再生资源，取之不尽，用之不竭。人类日常生活和工农业生产上采用的能源主要有：①化石能源；③水力、风力和潮汐能源；③原子能；④再生能源。再生能源是指植物(包括农作物、树木、牧草和藻类等)利用太阳能进行光合作用所积累的有机物，主要组分为纤维素、半纤维素和木质素等，这是传统家庭生活的主要能源。也是今后值得重视并进行合理研究开发利用的能源。再生能源的开发利用是细胞工程的研究热点之一。细胞工程在再生能源开发利用上的作用表现在两个方面：①培育能高效转换太阳能的植物，即具有高效率光合作用的植物；②和基因工程相结合，培育出能高效发酵纤维素产生乙醇等替代能源的高效菌种。
如果说二十世纪的植物细胞工程主要是科学研究阶段的工作，产业建设尚处在初创阶段，那么。二十一世纪的植物细胞工程将进入广泛的大规模产业化阶段，是对人类社会做出贡献的时期。在农业上，植物细胞工程培育的高产、优质、抗逆的植物新品种，将与基因工程技术培育的新品种一样，不断拉进农业生产的发展。医药卫生方面。细胞工程药物(包括药物、疫苗和基因治疗等)将与化学药物和中医药物三足鼎立，有效地为人类健康、延年益寿服务。特别是以基因工程和细胞工程培育的动植物来大量生产药物、疫苗或其他生物产品，无疑将会使传统的制药等工业生产方式发生重大变革。细胞工程在解决环境和能源危机方面，也将发挥更大的作用并形成产业化。
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细胞工程研究的进展及一些应用
摘要：简介了细胞工程的概念及基本操作，论述了其在若干重要领域研究取得的重大进展。并且，阐述了细胞融合技术、细胞工程培育海带、细胞工程在作物育种方面的应用。
关键词：细胞工程；作物育种；应用研究
1细胞工程的概念及其基本操作
细胞工程属于广义的遗传工程，是将一种生物细胞中携带的全套遗传信息的基因或染色体整个导人另一种生物细胞，从而改变细胞的遗传性，创造新的生物类型。它包括细胞融合、细胞重组、染色体工程、细胞器移植、原生质体诱变及细胞和组织培养技术。因此，研究者称细胞工程为细胞操作技术。
近年来，在该领域的研究最引人注目的是细胞融合(Cell fusion)技术及细胞杂交(ce11 hybridization)，并取得一些突破性研究进展。细胞融合是应用经紫外线灭活的病毒(如仙台病毒)或以聚乙二醇和溶血卵磷脂处理体外培养细胞，使其细胞质膜发生改变，导致细胞互相合并而成多核体。同种细胞的融合称为同核体，不同种细胞的融合称为异核体。后者在以后的分裂过程中，不同遗传型染色体混合产生单核合核体。应用这一技术可以分析细胞的质核关系、基因表现的调节和基因在染色体上的定位。应用细胞融合可以大量培育新的生物类型。细胞杂交是应用细胞融合技术，使不同种细胞的细胞质和细胞
核合并。由不同种的体细胞经过细胞融合后形成双核细胞，染色体在分裂过程中互混后产生的杂交单核子细胞便是杂交细胞，也称合核体。运用此法，亦可改变生物性状，培育出大量适合人类需求的新品系。
新近细胞重组(Cell Reconstitution)在细胞工程开发与应用研究方面发展较快，成果颇多。细胞重组是由不同细胞的核体与细胞质在融合子介导下并合形成完整细胞，在研究真核细胞的核、质相互关系及基因转移等方面具有重要价值。核体与胞质体在仙台病毒或聚乙二醇的诱导下能合并成为完整的重组细胞。目前不仅能使大鼠核体与小鼠胞质体并合成为新细胞，还能使人的核体与小鼠的胞质体并合成为重组细胞。若将胞质与完整的细胞融合，构成一个含有亲本核和两个亲本胞质的杂种细胞称为“胞质杂种”，就可以把一个亲本细胞的胞质基因(如线粒体基因)转移到另一个亲本细胞内，这样又成了基因重组育种新技术。这在细胞工程的研发上也取得了很多成果。
2细胞工程的发展现状
2.1细胞融合技术的研究进展
应用细胞融合技术可以培育新型生物物种。它能打破只有同种生物杂交才能育种的限制，实现了种问亦可育种的突破。目前细胞融合技术不仅可以把不同种类的植物细胞、不同来源的动物细胞进行融
合，而且还可以把动植物细胞融合在一起。该细胞工程的实施对于创造动物、植物、微生物新品种以及在医学领域都具有重要的应用价值。2O世纪60年代，法国的国家病毒学和细胞融合实验室，在进行两种小鼠肿瘤细胞的研究实验时，观察到一种新类型细胞的形成。这种新型细胞具有与亲本细胞不同的形态特征以及不同的生长方式。特别是这种新型细胞的核所含的染色体数目等于亲本细胞染色体数的总和。这个结论被进一步的重复实验观察所证实。在被推广到其他非肿瘤小鼠细胞上也得到类似的结论。实验表明，这些细胞的融合率非常低，介于lxl0 和lxl04之间，后来，研究者采用日本血凝病毒(JHV)提高了动物肿瘤细胞的融合率。这时研究人员进行新的实验时发现，JHV 病毒可受紫外线辐射而完全失活，尽管如此，它仍然保持诱发细胞融合的能力。接着，日本的科学家在这方面研究又取得了新的进展，他们通过实验证实，使用减活仙台病毒诱发人体Hela细胞和小鼠肿瘤细胞融合取得了成功，属于不同目的脊椎动物细胞之间都能诱发体细胞融合。专家们在评审这些实验新发现时指出，这既是细胞工程技术上的一项重大突破，也是生命科学理论上的一大发展，它给遗传育种，人为促进生物快速进化找到了一条新路。在这一新技术新理论的推动下，细胞工程的新成果接踵出现。如英国科学家于1975年研制成功了淋巴细胞杂交瘤技术，这是英国科学家KoMer和Milsten利用淋巴细胞与骨髓细胞进行融合并从中筛选出的杂交瘤细胞株。英国科学家还把免疫的小鼠B细胞，即能够分泌某种特殊抗体的细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂种细胞。它既能像B细胞那样产生并分泌免疫特异
抗体，又像骨髓细胞那样无限繁殖，这种纯系产生的抗体叫单克隆抗体。单克隆抗体问世后很快就应用于临床实践，被称之为2O世纪8O 年代的“生物导弹”。因为它能够引导药物定向和有选择地攻击癌细胞。目前已用于治疗诊断癌症、艾滋病等多种疑难疾病，及快速诊断人类、动物和农作物病害等方面，成为细胞工程在医学上最重要的成就之一。
2.2细胞工程培育海带
传统的海带育苗方法即夏苗培育法是以海带的生活史为依据，海上培育种海带，七月份室内采抱子，在人工降温、流水、自然光条件下使海带渡过其配子体世代，月中、下旬培育成1-2厘米的幼抱子体，待自然海水水温降到适宜时（低于20℃），幼苗出库海上养殖，幼苗需在育苗室低温培育3个月左右。
随着科学技术的进步，海带育苗方法由传统方式向生物技术细胞工程转化已成为必然趋势。海带细胞系育苗是利用细胞系进行海带育苗将室内培养的细胞系切割，使其附着于基质上，同样低温、流水、自然光培育的一种育苗方式，这种全新的育苗方法较现行的育苗方法有以下优点：一、工艺简单，育苗前的细胞系培养，在一定规模的器皿中进行即可，减少了传统育苗需海上养殖及选择种海带环节，可节省大量人力、物力、财力。二、细胞系育苗避免了大量种菜混合繁殖对品种纯度的影响，能够长期保持品种的优良性状，较大程度上解决
目前海带品种退化、混杂问题。三、细胞系在室内人工条件下培养，可随时根据生产需要进行采苗、育苗，而不受季节的严格限制，同时也避免了种海带养殖中生长发育时常受到不利因素干扰而影响育苗生产的问题。四、为杂种优势在生产上大面积应用，育种成果向生产过渡提供了条件，为育种和新品种的快速推广探索出了一条有效途径。以细胞系育苗工艺改革现有的海带海带细胞工程育苗的生产应用研究育苗方式是实现海带产业可持续发展的重要环节，是科技成果转化为生产力的具体体现。
海带细胞系技术自二十世纪年代建立以来，我国的藻类工作者在利用细胞系育苗方面进行了大量研究，一是提出了构想，即人工控制温、光、盐，快速、大量繁殖海带配子体，并用以附苗和幼苗的培育二是研究出了细胞系培养的适宜温、光、盐等因子三是进行了小型试验。但迄今为止，有关配子体无性繁殖系的大规模培养所达到的水平及相应的技术参数尚未见报道，细胞系生产性育苗尚无系统的技术工艺，细胞系育苗中的脱苗难题也一直没有得到较好的解决，我国海带苗种繁育仍然沿用抱子体采苗育苗模式。
2.3细胞工程用于作物育种
近年来国内外将染色体工程技术在农作物育种上进行开发应用研究后取得了较大进展，尤其在小麦育种上的成效尤为突出。美、英、法、原西德与前苏联等国家，通过染色休丁程技术，已成功地从黑麦、
lll羊草、偃麦草属的某些物种，向栽培小麦品种中转移并导入了抗锈病、白粉病和条斑花叶病地等基因，育成了一批有应用价值的抗病品种和品系，有的已在生产上大面积推广应用。在中国也通过植物染色体工程技术育成了一批优良小麦新品种。如西北植物研究所的专家将小麦与长穗偃麦草杂交育成了小偃4号、小偃5号、小偃6号，其中小偃6号已成为中国北方冬麦区的主栽品种，累计推广面积超过360x 104hm2。该品种的选育成果荣获国家发明一等奖。黑龙江农科院通过小麦与中间偃麦草杂交育成新曙光等品种。此外，西北植物研究所还利用植物染色体工程技术，进行异源染色体代换，育成VE小麦雄性不育系，通过三属四种的杂交，创造了穗型较大的超矮杆小麦。
3细胞工程应用的展望
据测算，优良品种对农作物增产的贡献率一般为33％。因此，大力推广优良品种，就成为实现中国农业“高产、优质、低耗”发展目标的主要途径随着农业科技进步，农业生产的不断发展与人类对农产品的日益增长的需要，必然要求育成更多高产、优质、多抗与用途多样化的农作物品种用于农业生产。要实现上述育种目标，就必须采用科学、先进与创新的育种新技术。通过以上染色体工程技术、原生质体培养、花药培养与无性系变异筛选、组织与体细胞杂交技术在农作物育种上开发应用所取得新进展的综述，充分展示了植物细胞工程技
术对加快农作物新品种的育种进程，缩短育种年限，扩大变异范围，拓宽育种领域，打破种问杂交障碍，提高育种水平所起到的重要作用。因此，可以预测并展望细胞工程技术在加速21世纪各种农作物育成进程，促进农业生产的发展与农业高新技术的产业化，必将具有更为广阔的开发应用前景。
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（六）海洋与水产技术。
充分发挥我市在海洋资源和海洋科技方面的优势，重点开展海洋资源深度开发及可持续利用研究，突破一批产业化关键技术，培育新兴海洋产业，大幅度提高我市海洋技术领域的整体水平和原始创新能力。
1.培育、引进优良品种。充分发挥市水产研究所、海洋生物工程技术研究中心等单位的作用，尽快突破黄金鮸、条斑星鲽等新品种的育苗与养成技术，集中力量进行金乌贼、西施舌、大竹蛏等地方名、优、特、新、珍、稀种类保护、繁育及规模养殖技术的研究和攻关，力争取得较大突破；研究推广高产抗逆养殖新品种，培育对虾、棱子蟹、栉孔扇贝、海参和鲍鱼等多倍体种苗，建设一批多倍体育种和养成技术开发示范基地。
6.海水资源综合利用技术。研究应用海水淡化技术，引进低成本的新型海水淡化设备，建设海水淡化示范工程。开展海水直接利用技术研究，推广海水冷却预处理、防腐蚀、阻垢、防生物附着等关键技术，建设海水直接利用示范基地。
（七）资源节约技术。
以可持续发展为目标，有重点地引进、消化、吸收、创新一批节能、节水、节材、节地和循环生产的关键共性技术，为建立节约型城市提供有力的科技支撑。
1.节能技术。支持日照钢铁厂、日照发电厂、亚太森博等耗能企业开展节能技术攻关。开展节能产品标准和节能监测等技术的研究与开发，加强城市垃圾等废弃物能源资源化技术的研究示范与推广。加强节能型住宅、公共建筑的建筑体系及关键技术研究、应用，大力推广节能技术、节能监测、循环经济技术模式。
2.节水技术。研究、推广农业高效用水、节水、雨水利用、旱地水肥优化利用与调控、污水净化利用等节水技术，大幅度提高水资源利用率。支持电力、纸浆、钢铁、化工、纺织等高耗水行业的技术引进和技术改造。
3.原材料节约技术。重点研究推广提高原材料利用率关键技术、再生材料替代技术、可回收利用材料和回收拆解技术、木材综合利用及节约替代技术。
（八）环境保护技术。
以环境友好为目标，开展环境保护技术研究，为“生态建市”提供技术支撑。
1.海岸带环境保护技术。重点加强沿海防护林带、植被恢复与建设技术、近海生态环境和有毒有害污染物检测治理技术、海洋生态环
境保护与生态修复及综合开发技术、海岸带综合治理和保护技术的研究与应用，为保护“蓝天、碧海、金沙滩”提供技术支撑。
2.环境污染综合防治技术。重点研究、推广生物降解、过滤技术和工业废水、生活污水处理技术及脱硫、除尘、固体废弃物、城市污水和垃圾综合处理与利用技术，保持城市居民的良好生活环境。
3.生态系统的修复、重建与保护。积极开展退化生态系统的修复重建技术研究与示范。开展石材加工废水综合处理技术研究。搞好山区、丘陵、平原植被种植与综合利用技术、生态修复技术、土壤污染形成机制与治理修复技术的研究与应用。
植物细胞培养 一、定义 ●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振 荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 ●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然 产物的主要来源。 ●植物细胞培养具有以下优点： 1、提高产率 2、缩短周期 3、提高产品质量 4、易于管理，减轻劳动强度 因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。 二、培养基 常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基 三、单细胞培养 1、制备方法 （1）机械法（机械磨碎、切割） （2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法） （3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织） 2、培养方法 （1）平板法（似微生物平板培养） （2）看护培养与饲养层培养法 看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。 饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。 （3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。 ①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。 ②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。 ③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。 ④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 3、保存 （1）继代培养（高等植物、海藻等） （2）低温（ 5℃～10℃） （3）冷冻（ -20℃或液氮） 植物细胞冷冻保存方法： 在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。 植物细胞冷冻保护剂组成： 7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖 四、植物细胞培养的应用 1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等） 2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等） 3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂） 4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等） 五、植物细胞的生物反应器大规模培养 1、培养特性 （1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染） （2）培养液流变特性（黏度增高） （3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
植物细胞培养产酶的研究进展 王鑫 （吉林师范大学生命科学学院四平136000） 指导教师: 杨丽萍 摘要：随着植物细胞培养技术的迅速发展，利用植物细胞培养技术生产天然产物的 技术也取得了新的进展。其中，酶是植物细胞培养产生次生代谢产物中的主要产物 之一。本文重点介绍了植物细胞培养产酶的方法和提高酶产量的有效措施，包括植 物培养细胞的技术方法、生产过程中的条件控制、提高酶产量的措施、产生酶的种 类、以及该技术未来的应用和前景。 关键词：植物；细胞培养；酶 Research progress of enzyme production obtained by plant cell culture Wang Xin （College of life science,Jilin Normal University,S iping 136000, China） Instructor: Y ang Liping Abstract:The natural production obtained by using of plant cell culture is progressing steadily along with the rapid development of plant cell culture technology. We can get many secondary metabolites by plant cell culture，including enzymes production. This article focuses on plant cell culture methods to get enzyme production and the effective measures to improve the enzyme production, including the plant cultured cells technology and methods, the conditions of control in the production process, the measures to improve enzyme production, as well as applications and prospects of the technology in the future. Keywords：plant; cell culture; Enzyme 植物细胞培养技术起源于本世纪初，从80年代起就迅速发展起来，并且拥有非常广阔的前景。目前，植物细胞培养主要有两种类型，包括单倍体细胞培养，原生质体培养[1]。植物细胞培养具有很多优越性，它不受环境，以及气候条件的限制，节约了生产空间，增值速度也要比整体植株栽培快很多[2]。植物细胞培养技术主要应用在三个领域，其中就包括有用物质的生产，因为在植物细胞生长过程中会产生丰富的代
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
植物细胞悬浮培养技术 一、基本原理 利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。 一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。 在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。 二、器材 超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子 三、操作步骤 1．配制培养基 按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。 2．水稻种子的消毒 （1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。 （2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。 （3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。 （4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。 3. 接种 在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。 4．悬浮培养的开始： 当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。培养温度为26℃，在黑暗中培养。 5．悬浮培养物的保持 进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
植物细胞组织培养技术实验指导书 生物实验教学中心 主编：杨卫民 2009-06-01
目录 实验一、植物组织培养培养基母液的配制 (1) 实验二、植物组织培养的培养基配制 (5) 实验三、康乃馨的离体快繁 (9) 实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 (14) 实验五、组织培养物的继代培养 (18)
实验一组织培养基母液的配制 一、仪器及药品 冰箱、天平（0.0001g） 容量瓶:1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml 广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml 烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺 标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1mol/L盐酸、1mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水 二、方法和步骤： 按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类 中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下： 大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液l00ml或50ml。 微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1L N6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。 铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。 植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲
动植物细胞培养的主要区别 第一篇:《动物细胞培养与植物细胞培养的区别》 动物细胞培养与植物细胞培养的区别动植物细胞培养的主要区别 1.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）动植物细胞培养的主要区别 2.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要，而需要加入植物生长激素 3.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是只含同一种的细胞的一个细胞系（或者叫细胞群）。 4.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。动植物细胞培养的主要区别 5.过程不同：植物组织培养的过程为脱分化和再分化，动物细胞培养的过程为原代培养和传代培养 7.培养目的不同：植物组织培养是为了快速繁殖和获得无病毒植株，
动物细胞培养是获得生物制品。 根据培养方式：贴壁细胞培养，半悬浮细胞培养，悬浮细胞培养 第二篇:《动物细胞培养和植物细胞培养的比较》 动物细胞培养与植物组织培养的对比 第三篇:《全国林业有害生物防治知识竞赛题含答案》 害预测预报工作的通知》要求，一般常灾区每0.5万一1万亩，偶灾区每亩，无灾区每2万一5万亩，应设一名测报员或病虫情调查员。在大片林区，可适当增加测报员或病虫情调查员的调查监测面积。（答案：1万一2万） 39、《关于进一步加强森林病虫害预测预报工作的通知》要求，要以或进行病虫情调查，掌握面上的病虫害发生情况。（答案：林班；小班） 40、《关于加强林业有害生物监测预报和突发疫情信息管理的通知》（造防函81号）要求，为了加强林业有害生物监测预报和突发疫情信息报告的管理，各地要严格按照有关要求，新发生（发现）的危险性和发生严重在50公顷以上的林业有害生物必须在日内上报国家林业局。（答案：7） 二、选择题 １、1999年以来，我国先后建立了个国家级森林病虫鼠害中心测报
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
动植物细胞培养条件的比较
动植物细胞培养条件的比较 动植物细胞的培养是细胞工程中非常重要的环节，在培养动植物细胞的过程中，培养条件有相似之处，但也有各自特殊的地方。下面，先就培养条件的不同之处进行比较： 一、培养基 植物细胞培养基一般为合成培养基，多为固体培养基，成分主要有无机营养、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。
动物细胞培养基包括天然培养基和合成培养基，可为固态，也可为液态，成分主要是水、葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等，此外，动物细胞培养还需要各种培养液。
二、营养要求 根据动植物细胞培养基的不同，我们可以看出，动植物细胞对培养基的营养要求有所不同。 植物细胞培养基根据无机盐成分可分为： （1）富盐平衡培养基（MS、LS、BL、BM）：无机盐浓度高，离子平衡性好，具较强缓冲性；营养丰富，无需额外添加复杂有机成分；微量元素种类多，浓度高。 （2）高硝态氮培养基（B5、N6）：硝酸钾含量高；铵态氮含量低；含有较高的VB1。 （3）中盐培养基（H、Nitsch）：大量元素为MS的一半；微量元素种类减少而含量增高；维生素种类比MS多（生物素、叶酸等）。 （4）低盐培养基（White、WS）：无机盐含量低；有机成分含量低。 对植物细胞的营养要求：生长代谢需要大量无机盐，需多种维生素、氨基酸和激素，要求的N源一般为无机N源，一般以蔗糖为C 源，细胞培养基要有缓冲性、等渗性。
动物细胞培养基可分为：基本培养基、通用培养基（能满足多种类型细胞生存）、完全培养基、生长培养基（基本培养基加入血清）、无血清培养基（基本培养基加入取代血清的成分）。 并且动物细胞培养基中都要加入血清或可代替血清的物质来提 供必须生长因子，以保证动物细胞的正常生长。 三、特殊条件 在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。 (1)血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。 (2)支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，高速冷冻离心机塑料等作为支持物。 (3)气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求很高，由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。 植物细胞由于其特殊性，其培养过程需要一定的特殊条件： (1)光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重
动植物细胞的大规模培养 动物细胞培养简介 所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增值过程。在此过程中，细胞不再形成组织。动物细胞培养是生产许多临床和医学上重要生物制品的一种必不可少的方法，这些生物制品包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单克隆抗体等，既推动了生物学和医学的发展，又带来了巨大的社会效益和经济效益。目前, 动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。 动物细胞培养的环境 影响动物细胞培养的主要因素有温度、pH值、CO2 、DO、葡萄糖、乳酸、氨、甲基乙二醛、培养基成分等。一般情况下，人和哺乳动物细胞的最适温度为37℃，pH值在7.2-7.4之间，CO2 水平为4-10%, DO维持在20-50%，葡萄糖是细胞培养过程中的能量的主要来源，需要维持在一定水平。乳酸、氨、甲基乙二醛等是动物细胞培养中的主要限制因素。在实际应用中，降低甲基乙二醛的浓度是通过降低葡萄糖用量来实现的。 培养基 用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。 天然培养基的优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。天然培养基的种类很多，包括血清、血浆、组织浸出液、水解乳蛋白等。其中血清是最常用的天然培养基。 合成培养基的优点是既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。然而合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。 培养方法 动物细胞的体外培养有两种类型：贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。 悬浮培养： 悬浮培养主要用于非贴壁依赖性细胞，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。对于小规模培养可采用转瓶和滚瓶培养，大规模培养则可采用发酵罐式的细胞培养反应器。悬浮培养对设备的要求也比较简单。 贴壁培养： 贴壁培养是动物培养的一种重要方法，是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和许多异倍体等贴壁依赖性细胞的培养。 优点： 1.细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液，容易更换培养液； 2.因细胞固定载体表面，不需过滤系统，容易采用灌注方式培养，从而达到提高细胞密度的目的； 3.当细胞壁贴于生长基质时，细胞将更有效的表达一种产品； 4.同一设备可培养多种细胞，并根据需要采用不同的培养液和细胞的比例； 缺点： 1.细胞繁殖贴壁后不易消化下来，培养的扩大比较困难； 2.培养设施占地面积大，设备投资大；
一、填空题 1常用的菌种纯化方法很多，主要有划线分离法、平板分离和稀释分离法。 2产酶菌种的要求安全可靠、产酶性能要稳定、产酶量高和营养要求低。 3常用菌种保藏方法有斜面低温、液石蜡封、固体曲法、沙土管法、冷冻干燥、液氮法。4控制发酵过程产生泡沫的方法有：选育不易产生泡沫的菌种、调节培养基中营养成分，减少或缓加易起泡的原料、机械消泡或化学消泡 5酶发酵的培养方式与其他发酵大同小异，基本上分为固体曲培养法、液体深层培养法 6按发酵的操作方式可分分批式反应、连续式反应、流加分批式反应。 7酶的比活力是反应速度的量度指标，酶转换数是量度指标。 1. 用阳离子交换树柱分离AA，在pH=2时，碱性氨基酸和酸性氨基酸相比，哪一个优先被洗脱? 2. 细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎、酶解破碎。 3. 酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。 4. 酶浓缩的方法主要有蒸发浓缩、超滤浓缩、脱水浓缩、反复冻融浓缩。 5. 酶干燥的方法主要有冷冻干燥、直接干燥、喷雾干燥。 6. 结晶的方法主要有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、等电点结晶法、蒸发浓缩。 7. 离心方法主要有差速离心、密度梯度离心、等密度梯度离心。 8. 加压膜分离可以分为微滤、超滤、反渗透。 9酶化学修饰的方法酶的表面修饰、酶分子的内部修饰、与辅因子相关的修饰、金属酶的金属取代等。 10酶化学修饰后的性质都发生了怎样的变化热稳定性、抗原性、对各类失活因子的抵抗力、
修饰酶在体内的半衰期、最适pH、Km 的变化。 11用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH ，用带正电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH ，用不带电荷的载体制备固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH 。 12.酶电极是由半透膜与酶胶层密切结合的传感装置。 13.氨基酸酰化酶可以催化（）。 A.D,L-氨基酸生成D-氨基酸和L-氨基酸。 B.D,L-乙酰氨基酸水解生成D,L-氨基酸。 C.L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸。 D.D-乙酰氨基酸水解生成D-氨基酸。 14与水介质中相比，酶在有机介质中热稳定性提高，催化活性降低。 15非水介质主要包括有机介质、气相介质、超临界液体介质、离子液介质。 16必需水是指（D） A. 维持酶催化反应速度所必需的水量 B. 酶催化反应速度达到最大时所必需的水量 C. 与酶分子紧密结合的水量 D. 维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量 17有机介质中酶催化的最适水含量是指（C） A. 酶溶解度达到最大时的含水量 B. 底物溶解度最大时的含水量 C. 酶催化反应速度达到最大时的含水量 D. 酶活力达到最大时的含水量
植物细胞培养技术 植物细胞培养技术就是为了某种目的而在细胞水平上对离体植物细胞或原生质体进行的一系列生物工艺学操作。它包括分离、培养、再生以及一系列相关的操作。就有用化合物的生产来说，它主要是指在无菌条件下通过悬浮培养植物细胞生产有用化合物的过程。 理论与技术基础：植物细胞全能性、微生物液体深层发酵系统、遗传工程 意义： 1）不受地理、季节和气候条件的限制； 2）节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提高经济效益； 3）可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物； 4）可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志进行； 5）可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以进行特定的生物转化获得新的有用物质。 1. 发展与成果例证 2. 培养基组成 3. 培养条件 1. 发展与成果例证 1959年Tu1ecke和Nickell首次采用大体积〔20升〕的硫酸瓶进行了蔷薇(Rosa sp．)茎段的细胞大量培养。 1967年Kaul和Staba采用多升发酵罐对小阿米(Ammi visnaga)进行了细胞大量培养的研究，并从细胞培养物中得到了第一个药用成分呋喃色酮(visnagin)。 1972年，Kato培养烟草细胞以获得尼古丁，最后放大到在20000升的生物反应器上进行分批和连续培养，其生产能力为5．82kg／m3．d。 1983年，***三井石油化学工业公司利用大规模培养紫草细胞生产紫草宁，产物终浓度达1400mg／L；随后，Ushiyama等在20000升生物反应器中成功地进行了100公斤／月的人参愈伤组织培养。 迄今为止，全世界已对近1000余种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的天然产物包括药品、香料、色素、食品、化妆品等500多种。许多植物的细胞培养已完成实验室阶段研究，正向工厂中试过渡，有的已完成工厂化生产规模的实验。如人参、紫草、毛地黄、烟草、肉桂、迷迭香、黄芪等。 2. 培养基组成 培养基的组成对植物细胞的生长和代谢物质的生产影响极大。典型的培养基有Murashige-Skoog(MS),Linsmaier-Skoog(LS)，white和B5等四种。 ---无机盐类：在无机盐中，磷酸根及氮源(NH4+或N03-)的含量对细胞的生长与物质生产有明显的影响。另外，一些金属离子如Ca2+、Cu2+、Mg2+等的含量往往也有重要影响。---碳源：通常使用2—3％的蔗糖作碳源，也有使用葡萄糖或果糖。使用单糖的优点是方便分析测定，且有助于细胞生长动力学分析。 ---植物生长调节物质：植物生长调节物质对植物细胞的生长和代谢物质生产的影响十分大。它可分为两大类：植物生长素类有2，4—D(二氯苯氧基乙酸)、IAA(吲哚基醋酸)、NAA(萘乙酸)等，细胞激动素类有BA(苄基腺凛吟)、动力精和玉米素。 ---其他因素：植物细胞培养的影响因素还有培养系统内气相组成(CO2和乙烯含量)、前体物
动植物细胞培养 动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同（表14-1）。由于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH值、溶氧、C02、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。相比之下，植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，而且植物细胞生长较微生物要缓慢，因此长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求。 在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、色素、香味物质等，必须借助于动、植物细胞的大规模培养来获得。从20世纪50年代以来，这方面已取得一些进展。但是，目前的技术还远不能满足细胞生物产品应用的要求，随着动植物培养技术研究的深入，显示出广阔的发展前景。 表14-1 动植物、微生物细胞的培养特征 第一节动物细胞大规模培养技术 动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。1962年，其规模开始扩大，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善，动物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。其发展简史见表14-2。 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。大量资料表明，生物技 术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市。美国最新预测几种畅销基因工程药物2000年全球销售额EPO大于30亿美元,G2CSF 大于20亿美元,HGH、IFN、UK均大于10亿美元,胰岛素和降钙素大于5亿美元。动物细胞大规模培养技术是 生物技术制药中非常重要的环节。目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一 步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。 表14-2 动物细胞培养技术的发展
本章主要内容 ●商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 ●培养基及其配制 ●外植体的选择与培养 ●试管苗的驯化与移载 第一节商业性组织培养实验室和小工厂 的设计与主要设备 ●培养皿的清洗； ●培养基的配制、分装和高压灭菌； ●无菌操作——材料的表面灭菌和接种； ●将培养物放到培养室培养； ●试管苗的驯化、移栽和初期管理。 (一)、洗涤室(cleaning room) ●洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 ●室内配备： ●大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 ●备有塑料筐，用于运输培养器皿。 ●备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。 (二)、准备室(repairing room) ●完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 ●如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与 培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)、缓冲室 ●进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 ●应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。 (四)、无菌操作室(transfering room) ●接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏 对组织培养成功与否起重要作用。 ●配置：
●在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁 尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 ●接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射 灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对 流。 (五)、培养室(culturing room) ●培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、 数目、及其他附属设备而定。 ●设计原则： ●充分利用空间和节省 ●能源 ●高度比培养架略高为 ●宜 ●周围墙壁要求有绝热 防火的性能。 (五)、培养室(culturing room) ●培养架大多由金属制成。 ●规格： ●一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左 右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W 的长1m，宽度一般为60cm。 ●培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或 立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。 ●控制日光照时间可安装定时开 关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。 (六)、驯化室 ●驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、 通风口以及必要的杀菌剂。 (七)、温室 ●应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必 要的杀菌杀虫装置及相应药剂。 二、仪器设备和器皿用具 ●常见仪器设备 ●1、超净台 ●2、无菌箱 ●3、空调机
专题2细胞工程 植物细胞工程的基本技术 寄语：用最少的悔恨面对过去。用最少的浪费面对现在。用最多的梦面对未来。【学习目标】1. 简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2. 列举植物细胞工程的实际应用。 3. 尝试进行植物组织培养。 【课题重点】1.植物组织培养的原理和过程 2.植物体细胞杂交的原则 【课题难点】植物组织培养的实验 【学习过程】 一、细胞工程 1．概念：应用和的原理和方法，通过或上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的或获得的一门综合科学技术。 2．分类：根据操作对象不同，可分为、。 二、植物细胞的全能性（1，2可回顾必修1相关内容） 1、植物细胞的基本结构包括、、、。 2、植物细胞主要的增殖方式是，细胞分化是指，实质是 _____。 3、细胞脱分化是指。 4、全能性是指，表现为全能性的原因是。 5．在理论上，生物的任何一个细胞都具有，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现，而是分化成各种。这是因为特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有地表达出各种，分化形成不同的细胞，从而构成生物体的不同。 三、植物组织培养技术 1．原理：植物细胞具有，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成的潜能。 2．过程 离体植物的 _ 组织幼根和芽或胚状体完整植株。 3．细胞脱分化：已的细胞经过诱导后，失去其特有的而转变成未分化细胞的过程。 4．植物组织培养：在和的条件下，将的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生、丛芽，最终形成完整植株。 四、胡萝卜的组织培养 1、实验原理
生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都具有发育成完整个体的潜能。因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有 ，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成 。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成 。 2、实验步骤 ①．将 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 。 ②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3次。 ③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。左右的小块。 ④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。 ⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。然后，在恒温箱中继续避光培养。在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 ⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。然后将试管苗移栽到大田，培养成 。 五、植物体细胞杂交技术 1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。 2．过程 离体的细胞果胶酶 纤维素酶 ???→?不同细胞原生质体???→?人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。 3．植物体细胞杂交步骤： (1)去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用纤维素酶、果胶酶去除植物细胞的细胞壁。 (2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过物理法和化学法来诱导融合。物理方法有：离心、振动、电激等促使原生质体融合。化学法是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂来诱导融合。融合后再生出细胞壁。 (3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。 【习题巩固A 级】 1．以下不． 能说明细胞全能性的实验是( ) A ．玉米花粉粒培育出植株 B ．转入贮存蛋白基因的向日葵细胞培育出植株