第一部分防腐挑战实验调研结果
1 实验样品
样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。
2 微生物挑战性实验
2.1实验菌株
不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株
菌株
美国
(药典)
美国
(ISP公司)
英国
(药典)
德国
(Henkel公司)
德国
(S&M公司)
白假丝酵母√√√√√黑曲霉√√√√√红色青霉√
绿色木霉√
绳状青霉√大肠埃希氏菌√√√√镉绿假单胞菌√√√√金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√
产气肠杆菌√
表皮葡萄球菌√日勾维肠杆菌√洋葱假单胞菌√√
肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√
表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择
种类菌株数量
革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌
至少选一种表皮葡萄球菌
发酵革兰氏阴性杆菌肺炎克雷伯氏菌
至少选两种阴沟肠杆菌
大肠埃希氏菌
变形菌属
日勾维肠杆菌
非发酵革兰氏阴性杆菌铜绿假单胞菌
至少选一种洋葱假单胞菌
荧光假单胞菌
恶臭假单胞菌
黄杆菌属
不动杆菌属
酵母
白假丝酵母
至少选一种近平滑假丝酵母
霉菌
黑曲霉
至少选一种黄绿青霉
产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上
2.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基
2.3 试验用菌液的配置
（1）标准悬液的配制
1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。
（2）细菌菌悬液的配制
实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；
此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
（3）霉菌菌悬液的配制
将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
2.4 接种
2.4.1接种方式
（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。
（2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。
2.4.2接种次数和时间
（1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期28天。（一次加菌的28天微生物挑战实验）
（2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）a法：第21天再接种一次，试验周期为28天。（有实验表明，第21天接菌和不接菌时，第28天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）b法：每隔两周接种一下，连续三次（即第1、3、5周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为49天；
c法：每周接种一次，连续5次，试验周期为35天。（S&M公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30个月内的防腐安全）
2.4.3操作方法
称取待测样品30g，对应加入0.3ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。
a.水溶性样品
10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取1ml样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
b.油溶性样品
取10g样品，加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；
吸取1ml已稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。
2.5培养
细菌放在32.5±2.5℃的培养箱中培养；
霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养；
混合菌在28℃的培养箱中培养。
2.6菌落计数
分别在0、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。
菌落计数的标准方法：
①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；
②有两个稀释度在30～300之间，求比值。若比值≤2，报告平均数；若比值>2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；
③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；
④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；
⑤所有稀释度均在30～300之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30或300的平均菌落数计算；
⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；
⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后×2，以报告全皿菌落数。
2.7评价标准
2.7.1 CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准
CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g（ml）（CFU为菌落单位），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。
2.7.2 美国评价标准
在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表3所示。
表3 美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准
2.7.3国内评价标准
国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。
表4 国内所用微生物防腐挑战实验评价标准
第二部分实验室可采取的方案
1 实验样品
2 微生物挑战性实验
2.1实验菌株
金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌
2.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基
2.3 试验用菌液的配置
实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37℃（细菌）和28℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10^8CFU/ml）和霉菌悬液（10^6CFU/ml），置于4℃冰箱储藏备用。
2.4一次加菌的28天微生物挑战实验
量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10^6~10^7CFU/ml，霉菌浓度为10^4~10^5CFU/ml，充分混匀。将样品在28摄氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d取样品分析含菌量（培养计数法）。
2.6评价标准
附：实验中所需的仪器和药品