基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目（２０１２３３１３５
）作者简介：丁 楠（１９８８－）
，女，硕士，研究方向：新疆地产资源新药开发研究。通信作者：高晓黎，女，教授，博士生导师，研究方向：药物传递系统研究与新药开发，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｌｉ＿ｇ
＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。ＨＰＬＣ法测定石榴皮提取物中鞣花酸的含量
丁 楠，高晓黎
（新疆医科大学药学院药剂／物化教研室，乌鲁木齐 ８３００１１
）摘要：目的 建立石榴皮提取物中鞣花酸含量的ＨＰＬＣ测定方法。方法 色谱条件：色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＣ－Ｃ１８（２）（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相为乙酸乙酯∶磷酸（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）∶磷酸二氢钾（０．０１ｍｏｌ／Ｌ）∶甲醇（０．０５∶２０∶２０∶６０）；流速１ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２５４ｎｍ；柱温２５℃。结果 鞣花酸在５．３６～１７１．４０μｇ／ｍＬ范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为９７．８２％，ＲＳＤ为１．４１％（ｎ＝９）。结论 ＨＰＬＣ法简便，准确，重复性好，可用于石榴皮提取物中鞣花酸的含量测定。
关键词：石榴皮；鞣花酸；ＨＰＬＣ
中图分类号：Ｒ９１４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－５５５１（２０１２）０６－０７７０－
０３Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ Ｐｅｅｌ ｂｙ
ＨＰＬＣＤＩＮＧ Ｎａｎ，ＧＡＯ Ｘｉａｏ－
ｌｉ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ ８３００１１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒ－ｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｐｅｅｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｏｎａｎ Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＣ－Ｃ１８（２）ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ，０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４－Ｈ３ＰＯ４，ｍｅｔｈａｎｏｌ（０．０５∶２０∶２０∶６０）ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２５４ｎｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ａｔ ２５℃．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄｗａｓ ５．３６～１７１．４０μｇ／ｍＬ．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９７．８２％ａｎｄ ＲＳＤ ｗａｓ １．４１％（ｎ＝９）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｐｏｍｅ－ｇｒａｎａｔｅ ｐ
ｅｅｌ．Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｐｅｅｌ；ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ；ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ） 石榴皮为石榴科植物石榴（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍＬ．
）的果皮，性温，味酸、涩，归大肠经，具有涩肠止泻、杀虫、收敛止血的功效。石榴皮富含多酚类物
质，
主要含有没食子酸、鞣花酸、安石榴林、安石榴苷等。鞣花酸是没食子酸的二聚衍生物，呈反式没食
子酸单宁结构，其具有抗氧化［１］、抗癌变［２］、抗诱
第３５卷 第６期新疆医科大学学报
Ｖｏｌ．３５ Ｎｏ．６
２０１２年６月Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｕｎ．２０１２
变［３］及抗突变作用，还兼备抗菌、抗病毒作用，广泛应用于食品、医药、医疗和化妆品等领域［４－５］。周本宏等［６］采用ＨＰＬＣ法测得石榴皮水解液中鞣花酸的含量约为１２％，但峰形不对称，拖尾较严重；李鸿飞等［７］测得石榴皮中鞣花酸含量约为５．２ｍｇ／ｇ，但由于操作参数不明确，而较难借鉴。本实验建立了ＨＰＬＣ法测定石榴皮提取物中鞣花酸含量的方法。该法操作简便，结果准确、可靠，为石榴皮提取物的生产提供了质量控制方法。
１ 仪器与试药
Ｗａｔｅｒｓ ２６９５型高效液相色谱仪（美国Ｗａｔｅｒｓ公司），ＫＱ－５００ＤＥ型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＳ１１０Ｓ电子天平（北京塞多利斯公司），ＨＷＳ２４型电热恒温水浴锅（上海
一恒科技有限公司），循环水式多用真空泵（郑州长城科教仪器有限公司），鞣花酸对照品（美国Ｓｉｇｍａ公司，含量≥９５％），甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯，石榴皮提取物（本实验室自制）。
２ 方法与结果
２．１ 色谱条件 色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ ＴＣ－Ｃ１８（２）（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相为乙酸乙酯∶０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸∶０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾∶甲醇（０．０５∶２０∶２０∶６０）；流速１ｍＬ／ｍｉｎ；柱温２５℃；检测波长为２５４ｎｍ；进样量为１０μＬ。在此色谱条件下，鞣花酸与其他相邻色谱峰的分离度＞１．５，理论塔板数不低于７ ０００。对照品及供试品色谱图见图１
。
图１ 鞣花酸对照品（Ａ）和样品（Ｂ）ＨＰＬＣ图（１为鞣花酸）
２．２ 对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸对照品
８．５７ｍｇ置５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至
刻度，摇匀。经０．２２μｍ的微孔滤膜滤过，制成每
１ｍＬ含０．１７１ ４ｍｇ的溶液，作为对照品溶液。
２．３ 供试品溶液的制备 精密称取石榴皮提取物
０．１ｇ，加７０％丙酮５０ｍＬ，浸渍２４ｈ，超声处理
３０ｍｉｎ，滤过，残渣用７０％丙酮２５ｍＬ洗涤，合并滤
液和洗涤液，用旋转蒸发仪将丙酮溶液蒸干，加
５０％甲醇溶液５０ｍＬ（含１．２ｍｏｌ／Ｌ盐酸），９０℃回
流８ｈ；用旋转蒸发仪浓缩至干，残渣加甲醇溶解，定
容于５０ｍＬ容量瓶中。精密吸取１ｍＬ置于１０ｍＬ
容量瓶中，加甲醇定容，经０．２２μｍ的微孔滤膜滤
过，作为供试品溶液［８］。
２．４标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液适量，
分别配制成浓度为５．３６、１０．７１、２１．４３、４２．８５、
８５．７０、１７１．４０μｇ／ｍＬ鞣花酸对照品系列溶液，进
样１０μＬ，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标、鞣花
酸浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程得Ｙ
＝１１４ ９３９ Ｘ－３４３ ３２４，ｒ２＝０．９９９ ９，结果表明在
５．３６～１７１．４０μｇ／ｍＬ范围内，鞣花酸峰面积值与
浓度呈良好的线性关系。
２．５ 精密度试验 取供试品溶液，连续进样６次，
分别进样１０μＬ，计算鞣花酸峰面积值，ＲＳＤ为
０．７９％，表明仪器精密度良好。
２．６ 稳定性试验 取供试品溶液，分别于０、２、４、
６、８、１０、１２、２４ｈ进样分析，测定鞣花酸峰面积，计
算得ＲＳＤ为０．８７％，说明供试品溶液在２４ｈ内具
有良好的稳定性。
１
７
７
第６期丁 楠，等：ＨＰＬＣ法测定石榴皮提取物中鞣花酸的含量
２．７ 重复性试验 取石榴皮提取物０．１ｇ，精密称定，按“２．３”项下方法操作，平行６份，分别测定含量，计算得鞣花酸含量的ＲＳＤ为１．６４％，表明该方法重复性良好。
２．８ 加样回收率试验 称取已知含量的石榴皮提取物约０．０５ｇ，共９份，精密称定，按低、中、高浓度定量加入鞣花酸对照品溶液，按“２．３”项下方法制成供试品溶液，进样１０μＬ，计算鞣花酸回收率，平均回收率为９７．８２％，ＲＳＤ为１．４１％（表１）。
表１ 加样回收率试验结果
样品重量／ｇ样品含量／ｍｇ加入量／ｍｇ测得量／ｍｇ回收率／％平均回收率／％ＲＳＤ／％０．０４８ ９．４１ ７．８５ １７．０３ ９７．０７
０．０４８ ９．４５ ７．８５ １７．０６ ９６．９４
０．０５３ １０．４７ ７．８５ １８．１９ ９８．３４
０．０４７ ９．３３ ９．８２ １９．００ ９８．４７
０．０５４ １０．６５ ９．８２ ２０．４６ ９９．９０ ９７．８２ １．４１０．０４６ ９．０２ ９．８２ １８．５０ ９６．５４
０．０４９ ９．７２ １１．７８ ２１．１９ ９７．３７
０．０５３ １０．５１ １１．７８ ２２．２６ ９９．７５
０．０５３ １０．３９ １１．７８ ２１．７０ ９６．０１
２．９ 样品含量测定 称取３批石榴皮提取物，每批约０．１ｇ，按“２．３”项下方法操作，依法进行测定，计算３批样品中鞣花酸的含量，平均含量为２０．１３％，ＲＳＤ为１．７６％。
３ 讨论
对鞣花酸对照品溶液进行紫外扫描发现鞣花酸在２５４ｎｍ和３７０ｎｍ处有吸收峰，两波长处鞣花酸的分离较为理想；由于在２５４ｎｍ处响应值和灵敏度高，故将２５４ｎｍ作为鞣花酸的检测波长［９］。
鞣花酸能以游离的形式存在，而更多的是以缩合形式（如鞣花单宁、苷等）存在于石榴皮中，在酸性条件下，游离鞣花酸可以通过水解的方式得到释放，因此酸水解是提取石榴皮总多酚有效部位中鞣花酸的一个关键步骤。本试验是先采用７０％丙酮进行超声提取，滤过，滤液经减压浓缩除去溶剂后，残渣用含１．２ｍｏｌ／Ｌ盐酸的５０％甲醇进行回流水解，结果表明经此方法提取的样品中鞣花酸峰形对称，杂质干扰少，方法重现性好，结果稳定、可信。
参考文献：
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［８］ 贝玉祥，杨阳，郭英，等．高效液相色谱法测定诃子中鞣花酸的含量［Ｊ］．时珍国医国药，２００９，２０（９）：２１７８－２１７９．
［９］ 吕琴，刘金宝．石榴皮醇提物对小鼠体液免疫功能的影响［Ｊ］．新疆医科大学学报，２００７，３０（５）：４８４－４８６．
［收稿日期：２０１２－０３－０５］
（本文编辑 王艳）
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７新疆医科大学学报第３５卷