糖尿病肾病（diabetic nephropathy ，DN ）其特征在于肾小球系膜细胞的肥大和增殖、肾小球基底膜
增厚和细胞外基质蛋白的过度积聚，最终导致肾小球硬化［1］。大量实验证实TGF-β1在DN 肾小球病变过程中起重要作用［2］。Resveratrol ，一种存在于红葡萄酒中的多酚植物抗毒素，研究发现它具有抗氧化、抑制生长等作用而用于肿瘤和心血管疾病的治
Resveratrol 对高糖所致大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响
胡爱平，游
娜，徐家蓉，蒋秀琴，缪
珩，鲁一兵*
（南京医科大学第二附属医院内分泌科，江苏南京
210011）
［摘要］目的：探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响及Resveratrol 的干预作用。方法：体外培养大鼠肾小球
系膜细胞。①分为正常对照组（NC 组，葡萄糖浓度5．6mmol ／L ）、高糖组（HG 组，葡萄糖浓度30mmol ／L ），分别观察24、48、72h ；
②分为NC 组、HG 组、Resveratrol 组（Res 组，葡萄糖浓度5．6mmol ／L＋Resveratrol 20μmol ／L ）和高糖＋Resveratrol 组（HG＋Res
组，葡萄糖浓度30mmol ／L＋Resveratrol 浓度分别为5、10、15、20μmol ／L ），各组细胞分别培养48h 。用半定量RT-PCR 和
Western blotting 法检测细胞内TGF-β1mRNA 和蛋白表达变化。结果：①与NC 组相比，HG 刺激后大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA
和蛋白表达明显增加，差异均有显著性，P 值均＜0．01；②与HG 组相比，HG＋Resveratrol 干预后，大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA 和蛋白表达呈浓度依赖性减少，差异均有显著性（P 值分别为＜0．05，＜0．01）。Res 组和NC 组之间TGF-β1mRNA 和蛋白表达的差异无显著性（P ＞0．05）。结论：高糖能上调大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1mRNA 和蛋白表达，Resveratrol 可能通过抑制高糖引起的系膜细胞TGF-β1高表达而在糖尿病肾病中起治疗作用。［关键词］
Resveratrol ；高糖；大鼠肾小球系膜细胞；转化生长因子-β1
［中图分类号］R 587．1
［文献标识码］
A ［文章编号］1007-4368（2009）04-0475-05
Effects of Resveratrol on the expression of TGF-β1in rat mesangial cells under high glucose
HU Ai-ping ，YOU Na ，XU Jia-rong ，JIANG Xiu-qing ，MIAO Heng ，LU Yi-bing *
（Department of Endocrinology ，the Second Affiliated Hospital of NJMU ，Nanjing 210011，China ）
［Abstract ］
Objective ：To investigate the effect of Resveratrol （Res ）on the expression of high glucose-activated transforming
growth factor-β1（TGF-β1）in rat renal mesangial cells．Methods ：①Cultured rat renal mesangial cells were exposed to D-glucose at 30mmol ／L for periods of 24，48，72h ，respectively．Normal glucose （5．6mmol ／L ）served as control．②Cultured rat renal mesangial cells were divided into four groups ：normal glucose （5．6mmol ／L ），high glucose （30mmol ／L ），normal glucose plus Resveratrol
（20μmol ／L ），high glucose plus Resveratrol at 5，10，15，20μmol ／L ，respectively for periods of 48h．The mRNA levels of TGF-
β1were measured by RT-PCR and the protein levels of TGF-β1were detected by Western Blotting．Results ：As compared to normal cells ，exposure of rat renal mesangial cells to D-glucose at concentrations of 30nmol ／L caused a time-dependent increase in the mRNA and protein levels of TGF-β1and reached the highest level at approximately 48h．The addition of Resveratrol significantly attenuated high glucose-enhanced mRNA and protein levels of TGF β1（P ＜0．05or P ＜0．01）in a dose-dependent manner．No notable difference at the mRNA and protein levels of TGF-β1was found between Res and NC group （P ＞0．05）．Conclusion ：High glucose contributes to an increasing of TGF-β1expression at both the mRNA and protein levels in rat renal mesangial cells．Resveratrol can significantly reverse high glucose up-regulated expression of TGF-β1in the rat renal mesangial cells and may play a role in the treatment of diabetic nephropathy．
［Key words ］
Resveratrol ；high glucose ；rat ；mesangial cells ；TGF-β1
［Acta Univ Med Nanjing ，2009，29（04）:475-478，523］
［基金项目］
江苏省教育厅科研基金项目（07KJD320141）
*
通讯作者，E-mail ：luyibing2004＠126．com
第29卷第4期2009年4月南京医科大学学报（自然科学版）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING （Natural Science ）
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第29卷第4期
2009年4月南京医科大学学报
疗［3－4］。还有试验证实Resveratrol可通过调节细胞周期蛋白cyclinD1、P21Cip1的表达来调控细胞周期进程，抑制细胞增殖［5］。Resveratrol是否通过抑制TGF-β1表达而延缓DN的发展，目前尚未见报道。本实验在体外培养大鼠的系膜细胞，观察Resveratrol对高糖刺激的大鼠系膜细胞TGF-β1表达的影响来探讨Resveratrol在DN中的作用及其可能机制。
1材料和方法
1．1材料
Resveratrol（美国Sigma公司），大鼠肾小球系膜细胞系（HBZY-1，购自上海长征医院），培养液由含葡萄糖（5．6mmol／L）的DMEM培养基（美国Gibco公司）、10％胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、3．7g／L碳酸氢钠、15mmol／L HEPES（上海生物工程有限公司）等组分组成。Tripure Isolation Reagent （瑞士Roche公司），小鼠抗大鼠TGF-β1单克隆抗体（美国R＆D公司），小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体（美国BD公司），羊抗小鼠IgG（武汉博士德公司），ECL显色剂（美国Pierce公司）。PCR仪Perkin Elmer 2400，凝胶图像分析系统（上海天能GIS-2010）。
1．2方法
1．2．1细胞培养及分组
大鼠肾小球系膜细胞置于5％CO2、37℃培养箱内培养、传代。待细胞贴壁并85％融合时无血清培养24h使细胞同步化。①分为正常对照组（NC组，即无血清培养液中葡萄糖浓度5．6mmol／L）、高糖组（HG 组，即无血清培养液中葡萄糖浓度30mmol／L），分别观察24、48、72h；②分为NC组、HG组、Resveratrol 组（Res组，即无血清培养液中葡萄糖浓度5．6mmol／L ＋Resveratrol20μmol／L）和高糖＋Resveratrol组（HG＋Res组，即无血清培养液中葡萄糖浓度30mmol／L＋Resveratrol浓度分别为5、10、15、20μmol／L），各组细胞分别培养48h。各组实验至少重复3次。1．2．2RT-PCR法检测各组细胞TGF-β1mRNA的表达
采用Trizole一步法进行总RNA抽提。紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，A260／A280在1．6～1．8之间。逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR 扩增。引物由上海英骏公司合成。TGF-β1Sense：5′-CAAGTGGACATCAACGGGTT-3′，antisense：5′-GCTCCAAATGTAGGGGCAGG-3′。扩增产物大小为296bp。GAPDH sense：5′-CACCCTGTTGCTGTAGC-CATATTC-3′，antisense：5′-GACATCAAGAAGGTG-GTGAAGCAG-3′。扩增产物大小为196bp。PCR反应条件，GAPDH：预变性95℃5min，变性94℃30s，退火55℃40s，延伸72℃59s，32个循环后72℃延伸7min。TGF-β1：预变性95℃5min，变性94℃30s，退火58℃40s，延伸72℃55s，32个循环后72℃延伸7min。取PCR产物5μl在2％琼脂糖凝胶上电泳，对电泳带进行密度扫描，以TGF-β1／GAPDH比值代表TGF-β1mRNA的相对表达量。各组实验至少重复3次。
1．2．3Western blotting检测细胞TGF-β1蛋白的表达10cm培养皿内加入1ml蛋白裂解液，提取细胞总蛋白。浓度按Bradford法测定。取总蛋白50μg，加等量样品处理液，100℃煮沸5min，12％十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂牛奶的TBST封闭1h，加TGF-β1单克隆抗体（工作浓度1∶200）和β-actin 单克隆抗体（工作浓度1∶2000），4℃杂交过夜，洗膜后加辣根过氧化酶标记的IgG（工作浓度分别为1∶1000、1∶2000），室温下孵育，1h后再次洗膜加入ECL显色剂。用凝胶图像分析系统对条带密度扫描，测量得到的光密度比值（TGF-β1／β-actin）作为TGF-β1蛋白的相对表达量。各组实验至少重复3次。1．3统计学方法
结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS12．0软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，两组均数之间采用q检验，P＜0．05为差异有显著性。
2结果
2．1高糖对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达的影响
正常对照组在各个时间点TGF-β1mRNA和蛋白表达无明显变化。与0h相比，高糖刺激后24、48、72h TGF-β1mRNA和蛋白表达较0h明显增加，P值＜0．01，差异均具有显著性。其中48h TGF-β1mRNA和蛋白表达最高，见表1、2，图1、2。2．2Resveratrol对大鼠肾小球系膜细胞培养48h TGF-β1mRNA和蛋白表达的影响
与HG组相比，Resverstrol对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达的抑制作用呈浓度依赖性。Resverstrol浓度在10、15、20μmol／L能明显抑制大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白表达，P值分别为＜0．05和＜0．01，差异均具有显著性。而与NC组相比，Res组大鼠肾小球系膜细胞
476··
表1
不同时间高糖对大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA 表达的影响
Tab 1Effects of high glucose at different time on the expression of TGF-β1mRNA in rat mesangial cells
与0h 相比，**P ＜0．01。
NC 组HG 组0．80±0．080．72±0．090．84±0．091．18±0．14
**0．88±0．091．26±0．15**
0．91±0．101．04±0．12**（x ±s ）
TGF-β1／GAPDH mRNA
0h
24h
48h
72h
组别
TGF-β1mRNA 和蛋白表达的差异无显著性，P 值＞0．05。见表3，图3、4。
表2不同时间高糖对大鼠系膜细胞TGF-β1蛋白表达的影响
Tab 2Effects of high glucose at different time on the enpression of TGF-β1protein in rat mesangial cells
与0h 相比，**P ＜0．01。
NC 组HG 组0．60±0．180．69±0．110．68±0．09
1．03±0．13**0．71±0．101．26±0．15**0．74±0．090．94±0．12**
（x ±s ）
TGF-β1／β-actin 蛋白
0h
24h
48h
72h
分组
表3
不同浓度Resveratrol 对大鼠系膜细胞TGF-β1
mRNA 和蛋白表达的影响
Tab 3
Effects of Resveratrol at different con centration on the expression of TGF-β1mRNA and protein in rat mesangial cells
与NC 组相比，**P ＜0．01；与HG 组相比，△P ＜0．05，△△P ＜0．01。
（x ±s ）
分组
NC 组
HG 组Res 组
HG＋Res 组5μmol ／L 10μmol ／L 15μmol ／L 20μmol ／L
TGF-β1／GAPDH mRNA 0．75±0．101．26±0．140．79±0．091．13±0．131．07±0．12△0．98±0．11△△0．94
±0．12△△
TGF-β1／β-actin 蛋白
0．84±0．091．57±0．16**0．87±0．101．46±0．151．32±0．15△1．03±0．12△△0．96
±0．11△△
胡爱平等：Resveratrol 对高糖所致大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响
第29卷第4期2009年4
月
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第29卷第4期
2009年4月南京医科大学学报
3讨论
肾小球系膜细胞属于血管周细胞，它不仅是细胞外基质合成和降解的主要场所，也是生成多种细胞因子的主要细胞，包括TGF-β1。TGF-β1是一些小分子的可溶性多肽，通过系膜细胞的高亲和性受体发挥效应，能促进系膜细胞的增殖和系膜基质的分泌，因此，在肾小球硬化的发病中起着十分重要的作用［6－7］。本实验结果显示，高糖能明显增加大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1mRNA和蛋白的表达，并以48h TGF-β1mRNA和蛋白表达最高。高血糖是如何调控TGF-β1的表达，其机制目前尚不清楚。有研究认为，血糖升高可能通过糖基化终末产物（AGE）的形成、活性氧簇（ROS）和血管紧张素Ⅱ的增高、己糖胺通路活化等，上调TGF-β1的表达。TGF-β1通过受体信号传递发挥以下生物学作用：①TGF-β1能促进肾小球系膜细胞的蛋白质合成，阻止细胞从G1期过渡到S期，从而促进细胞肥大。②TGF-β1增加肾小球系膜细胞细胞外基质蛋白分子的合成，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原，纤维连接蛋白（fibronectin，FN），层粘连蛋白（laminin）和蛋白多糖的合成。TGF-β1通过上调蛋白酶抑制因子，如纤溶酶原激活物抑制因子（PAI）和金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）的合成，下调基质降解蛋白酶如胶原酶的合成，阻止新合成的细胞外基质降解。随着细胞外基质的积聚，最终导致肾小球硬化［6－8］。
Resveratrol的化学名为芪三酚（3，5，4′-trihy droxystibene），分子式C14H12O3，相对分子量228．25ku，属于非黄酮类多酚化合物，广泛存在于多种植物中，并以新鲜葡萄皮中含量最高。具有清除自由基、抑制血小板聚集、保护心脑血管和抗炎症、抗过敏与抗肿瘤等多种药理作用［3－4］。尽管有研究［9－10］发现Resveratrol能通过抑制P38MAPK、P53和SIR2途径和氧化应激预防糖尿病大鼠糖尿病肾病的发生，但具体的机制仍不明。本实验结果表明用Reserva-trol干预后能显著抑制高糖条件下TGF-β1mRNA 的高表达及其蛋白合成和分泌均明显减少，并且Reservatrol干预组对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白的抑制作用呈浓度依赖性。Resvera-trol能和许多种细胞信号分子结合，激活多种转录因子NF-κB、STAT3、β-catenin和PPAR-γ；抑制蛋白激酶PI3K、JNK和AKT；调节细胞周期基因p53、Rb、PTEN、cyclins和CDKs的表达［11］。Resveratrol还能减少高糖引起的AMPK的磷酸化，增加AMPK的活性［12］。Reveratrol通过使FoxO1蛋白转位到细胞核，增加脂肪细胞中FoxO1蛋白水平，使ROS的产生减少，IL-6、PAI-1、MCP-1等炎症因子的表达下降［13］。因此，目前的研究认为Reveratrol能抑制高糖诱导的TGF-β1高表达可能与其作用于多种信号转导途径有关。Reservatrol干预肾小球系膜细胞，使TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显下降，则可能减轻高糖引起的系膜细胞的增殖和肥大，减少细胞外基质的合成，而延缓肾小球硬化的发生。
总之，本研究显示Resveratrol能明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞TGF-β1的高表达，Resvera-trol能通过抑制高糖引起的肾小球系膜细胞TGF-β1的高表达而在糖尿病肾病的治疗中起作用，具体的机制有待于进一步研究。
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［收稿日期］
2008－08－10
就卒中后血压管理而言，其分期的目的是：早期保证组织灌注，同时避免高压性灌注损伤，保护脑循环组织和功能；恢复期减少血管并发症，促进神经功能修复。因此，卒中后血压管理的分期概念和微循环功能理论的卒中后分期概念也不同。有研究［11］提示急性期血压管理时间为3～7天，与本研究治疗组用药时间特点基本相符。本次研究尚记录到：所有治疗组对象3天后未再使用急性期血管活性药物，2周内未见出血再发生，3周内所有对象均出现恢复期血压管理指征。该用药特点尚提示：脑出血后血压管理的分期很可能应包括脑出血后较早的时间，一般支持治疗时期，和恢复期血压管理治疗时间。
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2008－04－22
22222222222222222222222222222222
（上接第478页）
刘文旭等：规范化血压管理与治疗对急性脑出血（基底节区）预后影响的临床研究
第29卷第4期2009年4月
523··
醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3的表达影响 贾庆华杨霄鹏杨志华哈小琴﹡唐瑜 （中国人民解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃省干细胞与基因药物重点实验 室，甘肃兰州730050，﹡通讯作者） 摘要目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞（HRMC）凋亡作用及Caspase-3活性的影响。方法醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒HRMC 6、12、24、48h后，四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞增殖。经醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒24h 后Hochest33342染色法检测观察细胞形态学变化；细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting检测Caspase-3的转录与表达。结果与空白对照组相比，不同浓度的铅均不同程度的抑制了HRMC的增殖(P<0.01)。Hochest33342-PI染色显示出醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting结果显示醋酸铅组的Caspase-3转录与表达升高。结论醋酸铅可促进人肾小球系膜细胞凋亡, Caspase-3参与了凋亡过程。 关键词: 醋酸铅；人肾小球系膜细胞；Caspase-3；凋亡 The Caspase-3 expression in the toxic effect of lead acetate on the human renal mesangial cells(HRMC) JIA Qing-hua Yang Xiao-peng Yang Zhi-hua HA Xiao-qin Tang Yu (Experimental Center of Medicine, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Key Labaratory of Stem Cell and Gene Drug in Gansu Province, Lanzhou 730050, Gansu Province, China) Abstract Objective To investigate the effects of lead acetate on apoptosis and activity of caspase-3 in human renal mesangial cells(HRMC). Methods After treated with 5、10、20μmol/L lead acetate 6、12、24、48h, methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) was performed to measure HRMC proliferation. Hochest33258-PI staining was applied to observe the morphological changes, and the transcription and expression level of Caspase-3 was detected with immunohistochemical method, RT-PCR and Western blotting after lead(5、10、20μmol/L) treating HRMC 24h. Results Lead acetate significantly inhibited the cell viability of HRMC(P<0.01). Characteristical changes of apoptosis in HRMC were observed in the treated group. RT-PCR、western blotting and immunohistochemical analysis indicated the transcription and expression of Caspase-3 was increased by the treatment. Conclusion Lead acetate could induce apoptosis in HRMC with a possible mechanism which may be related to the activation of caspase-3. Key words: lead acetate; human renal mesangial cells(HRMC); Caspase-3; apoptosis 铅是环境中广泛存在的一种强重金属毒物，对机体的各个系统都有损害，特别是对肾脏。肾脏承担了近2/3排泄途径再由尿道排出[1]，当排泄率降低而吸收率升高，更易造成铅在体内的蓄积，最终导致铅中毒。大量研究动物实验已经证明铅中毒引起肾脏功能的损伤[2,3]，但其损伤机制尚不清楚。目前有关醋酸铅肾 甘肃省支撑计划项目(090NKCA106)
什么是系膜增生肾小球肾炎 系膜增生肾小球肾炎，这种肾脏疾病对我们来说是比较陌生的，那么什么是系膜增生肾小球肾炎呢？这个问题对于我们来说，也是需要了解一下的。接下来本文就为大家介绍系膜增生肾小球肾炎的相关知识，感兴趣的朋友可以一起来看看哦！下面请大家看详细的介绍。 系膜增生肾小球肾炎是根据光镜所见的一种病理形态学诊 断的肾炎，是一组以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的肾小球疾病。1977年世界卫生组织正式 将其列为一种原发性肾小球肾炎病理类型。 系膜增生肾小球肾炎的病因仍未明确。部分病例起病前有感染史，以上呼吸道感染居多， 系膜增生肾小球肾炎但病原不明，感染对系膜增生性肾小球肾炎确切的作用也不清楚。鉴于免疫荧光检查有多种表现，推测系膜增生性肾小球肾炎的致病因素可能存在多种。
系膜增生肾小球肾炎的治疗方法应根据临床表现结合病理特点选择使用，并须通过长期随访，调整治疗方案。一般治疗同其他肾脏疾病。 1、单纯血尿病理改变仅有轻度系膜增生，中度以下蛋白尿伴或不伴血尿，24h尿蛋白定量小于1.5g，病理改变为轻度或中度系膜增生的患者，轻者无须特殊治疗。对于尿蛋白定量1～2g/24h的患者，给予常规量糖皮质激素治疗，有助于缩短缓解时间，减轻肾脏的病理改变。 2、大量蛋白尿或肾病综合征此类患者无论病理改变轻重，均应给予足量的糖皮质激素治疗。即便病理学改变为系膜增生轻微、无弥漫性Ig和（或）补体沉积，也不伴局灶节段性肾小球硬化者，也要给予泼尼松（强的松）治疗。 3、合并高血压及肾功能不全此型为系膜增生性肾炎中预后最差者。病理改变显示中度至严重弥漫性系膜增生伴局灶节段性
填空 弥漫性硬化性肾小球肾炎的特点是大量肾小球____________及__________。纤维化、玻璃样变性 肾盂肾炎是_________和__________感染性__________性炎。 弥漫性新月体性肾小球肾炎电镜检查见_________不规则__________部分 _________出现__________，_________。 急性毛细血管内增生性肾小球肾炎免疫荧光检查见毛细血管壁的________有 ________的IgG、C3沉积。 有一患者临床表现为少尿，血尿、蛋白尿、管型尿、水肿和高血压，经治疗后在短时间内痊愈，应诊断为下列哪种肾小球肾炎B A：新月体性 B：毛细血管内增生性 C：慢性硬化性 D：轻微病变性 第2题：关于肾细胞癌的组织来源下列哪项正确 d A：起源于血管内皮细胞 B：起源于系膜细胞 C：起源于移行上皮 D：起源于肾小管上皮 第3题：肾于肾炎细胞感染的主要途径是：b A：血源性感染 B：上行性感染 C：坏死后感染 D：以上都不是 第4题：有广泛新月体形成的是下列哪型肾小球肾炎：d A：膜性肾小球肾炎 B：IgA肾病 C：膜增生性肾小球肾炎 D：毛细血管外增生性肾小球肾炎 第5题：下列哪项不符合慢性肾盂肾炎：a A：双肾病变对称 B：双肾病变不对称 C：皮髓分界不清 D：肾盂肾盏变形 第6题：肾盂肾炎最常见的致病菌是：d A：葡萄球菌 B：链球菌 C：痢疾杆菌 D：大肠杆菌 第7题：关于肾母细胞瘤，下列哪项不正确： A：成人多见 B：瘤体巨大 C：肿瘤有多种成份 D：切面呈多色彩性 第8题：纤维化玻璃样变的肾小球相互靠近集中的现象见于下列哪型肾炎：b A：慢性肾盂肾炎 B：硬化性肾小球肾炎 C：膜性肾小球肾炎 D：新月体性肾小球肾炎第9题：慢性肾盂肾炎肉眼检查可见肾脏表面有b A：弥漫细小颗粒 B：不规则凹陷瘢痕 C：多发性小脓肿 D：斑块状出血状 第10题：弥漫性膜性肾小球肾炎的病变特征是：b A：系膜弥漫性增生 B：毛细血管壁弥漫性增厚 C：系膜及基底底膜均增生 D：局灶性基底膜增厚 第11题：急性增生性肾小球肾炎患者出现高血压的主要原因是：d A：肾素增加 B细动脉硬化 C小动脉硬化 D：水钠潴留 第12题：新月体性肾小球肾炎免疫荧光检查结果显示d A：线状荧光 B颗粒状荧光 C：荧光阴性 D：以上均可 第13题：下列那项符合轻微病变性肾小球肾炎：c A：间质病变轻微B：肾小管病变轻微 C：肾小球病变轻微D：血管病变轻微 第14题：新月体形成过程中刺激球囊壁层上皮细胞增生的主要成分是 d A：红细胞B：白蛋白C：血小板D：纤维素 第15题：新月体内的细胞主要是：c A：脏层上皮细胞B：血管内皮细胞 C：壁层上皮细胞D：系膜细胞 第16题：下列哪项符合急性肾盂肾炎：a A：肉眼观有大小不等的小脓肿形成 B：系膜细胞明显增生C：发病机理为变态反应 D：肾小管上皮再生明显 某患者发现尿中有细菌及变性坏死的中性白细胞，应诊断为下列哪种疾病 c A：肾小球肾炎B：肾萎缩C：肾盂肾炎D：肾积水 第18题：急性增生性肾小球肾炎肉眼观病变特征为：a A：大红肾B：大白肾C：脓肿肾D：出血肾 第19 下列哪型肾小球肾炎发病与T细胞功能异常有关d A：膜性肾小球肾炎B：膜增生性肾小球肾炎 C：硬化性肾小球肾炎D：轻微病变性肾小球肾炎 第20题：关于肾小球肾炎的发病机制，下列哪项错误：d A：体液免疫性损伤B：细胞免疫反应参与 C：主要由炎症价质所致D：感染因子直接引起
高迁移率族蛋白1刺激人肾系膜细胞增殖并分泌纤维化相关 因子 摘要】目的：探讨高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein,HMGB1)在促使人肾系膜细胞(human renal mesangial cell, HRMCs)增殖及分泌纤维化相关因子中的作用。方法：用不同浓度梯度的重组HMGB1刺激体外培养的人肾系膜细胞，以CCK-8测定人人肾系膜细胞增殖情况，以ELISA方法检测培养上清液中纤维化相关因子TGF-β1的分泌量，以real-time PCR法测定细胞周期蛋白cyclinD、PNCA蛋白的表达。结果：一定浓度的HMGB1可刺激人肾小球系膜细胞的增殖，细胞内细胞周期蛋白cyclinD、PNCA基因表达增加，细胞培养上清液中TGF-β1浓度增高。结论：HMGB1通过刺激人肾小球系膜细胞增殖并分泌TGF-β1参与了肾脏纤维化过程。 【关键词】高迁移率族蛋白1；人系膜细胞；纤维化；TGF-β1；增殖；细胞因子【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）36-0023-03 Effect rHGMB1 on proliferation of human renal mesangial cells and secretion of fibrosis-related cytokines. Zhou Jianguang,Chen Yu. Department of General Medicine, The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310019, China. 【Abstract】Objective To investigate the role of HMGB1 in inducing human renal mesangial cells (HMCs) to proliferate and secret fibrosis-related cytokines. Methods Recombinant protein HMGB1 (rHMGB1) was incubated with HMCs and then proliferation assay was carried out with CCK-8; cyclinD and PCNA genes were determined with real time PCR; supernate of cultured HRMCs with rHMGB1 was examined for detection of TGF-β1 with ELISA method. Results HMGB1 promoted proliferation of HRMCs; HMGB1 increased expression of cyclinD and PCNA genes involving cell proliferation; rHMGB1 increased secretion of TGF-β1 in supernate of cultured HMCs. Conclusion rHMGB1 was involved in fibrosis of kidney by inducing HRMCs to proliferate and secret fibrosis-related cytokines. 【Key words】HMGB1; Human renal mesangial cells; Fibrosis; Cytokines; Proliferation; TGF-β1 肾脏纤维化是多种疾病导致肾功能衰竭的共同通路。肾脏系膜细胞的增殖，纤维化相关因子对肾脏固有细胞的刺激，是肾脏纤维化的两个重要因素。慢性的炎症反应又是导致肾脏纤维化的另一重要因素。高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein, HMGB1)是晚期炎症因子，可诱发和促进炎症反应，也和多个脏器的纤维化有关。狼疮性肾炎的主要病理表现为增生性肾小球肾炎。我们在前期狼疮小鼠的研究中发现，系膜增生明显的小鼠肾脏组织HMGB1表达明显升高。据此推测HMGB1可能促进人肾系膜细胞的增殖，后者分泌纤维化相关因子，促使肾脏纤维化的进程。本实验拟通过体外细胞学实验观察重组HMGB1对人肾系膜细胞增殖和纤维化相关因子分泌的影响。 1.材料和方法 1.1 材料和试剂 CCK-8试剂盒购买自江苏碧云天生物有限公司，逆转录试剂盒以及Real time-PCR试剂盒购自TAKARA公司。ELISA试剂盒（TGFbeta1）购自RD公司。人肾系
小鼠肾系膜细胞 小鼠肾系膜细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肾系膜细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肾系膜细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肾系膜细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肾系膜细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
Caspase与细胞凋亡
Caspase与细胞凋亡 沈阳市第一人民医院神经内科 （110041）李莉 摘要：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。是细胞内由基因编码调控的按严格程序执行的细胞自杀过程。细胞凋亡是细胞生长发育过程的重要生命现象，是目前生物医学领域中的一个重要研究课题。阐明细胞凋亡的分子机制可对一些疾病的防治（如肿瘤，神经退行性疾病等）产生积极影响。许多实验提示细胞凋亡涉及一个瀑布式（Cascade）基因表达过程。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。本文就其生物学特性及其在凋亡中的作用机制作一综述。 关键词：Caspase；细胞凋亡
细胞凋亡的原词Apoptosis由两个拉丁字组成。Apo指离开，ptosis是落下，意思是细胞凋亡有如秋天落叶，到一定时候即失去生命力，遂即脱落，细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的，按严格程序执行的细胞自杀过程。通常需要30到60分钟，细胞凋亡形态学上的变化主要有DNA破碎，染色质凝集，细胞皱缩，线粒体肿胀和凋亡小体形成，而整个过程的结束以凋亡小体被吞噬为标志。多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA的降解：DNA降解成180-200bp或其倍数的片段，因此在琼脂糖凝胶电泳上可见到有特征性的梯形图谱。目前对凋亡的研究深入到分子水平，发现多种半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartase）在细胞凋亡之中发挥着重要作用。 1、什么是Caspase 通过对美丽线虫（nematode caenorhabditis elegans）的细胞死亡机制的研究发现，至少有3个基因直接参与了细胞凋亡的调节。ced-3、ced-4直接介导细胞死亡，为促凋亡基因，其编码的蛋白分别为CED-3、CED-4、ced-3在细胞中起关键作用，称为线虫自杀基因，CED-3则称为死亡蛋白酶；ced-9则拮抗其作用，为抗凋亡基因，其编码的蛋白质为CED-9。后来发现CED-3与哺乳动物的白介素-1β转换酶（Caspase-1，原名为interleukin-1β-converting enzyme，ICE）具有高度同源性，CED-4，CED-9则分别与Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、Bcl-2同源。Bcl-2基因家族产物包括促进及抑制凋亡的两个蛋白质亚群[1]。哺乳动物的ICE 类蛋白是一组半胱氨酸蛋白酶[2]；且有以下共同特点：①和ICE有同源性；②有高度保守QACXG（X为R、Q或G）五肽序列[3]；③有发挥酶活性所必须的半胱氨酸；④特异地裂解天门冬氨酸位点；⑤前体蛋白均无活性，均需经蛋白水解后才产生活性；⑥转染不同细胞可诱导凋亡。因
系膜增生性肾小球肾炎患儿Bax蛋白表达与外周血淋巴细胞凋亡的关系 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的明确病理类型为系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)的原发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS) 患儿外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)Bax蛋白的表达与PBLs凋亡的关系。探讨MsPGN-NS患儿糖皮质激素(glucocorticoid，GC)抵抗的部分机制。方法所有患儿和正常儿童均于清晨空腹条件下采取静脉血，以密度梯度离心法分离PBLs，所得细胞用植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)或PHA+1×10-6mol/L地塞米松(dexamethasone，Dex)处理，培养24 h和48 h后应用流式细胞仪检测Bax蛋白的表达及细胞凋亡率。结果①MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs Bax蛋白表达量均显著高于空白对照组(P0.01)，且呈时间依赖性(48 h24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组Bax 的表达均低于正常儿童相应组(P0.01);②MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs凋亡率均高于空白对照组(P0.01)，且呈时间依赖性
(48 h24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组细胞凋亡率均低于正常儿童组(P0.01)。结论MsPGN-NS患儿PBLs Bax蛋白表达水平与PBLs凋亡率呈明显正相关，但其表达显著低于正常对照组，提示Bax蛋白的低表达是导致MsPGN-NS患儿PBLs凋亡减少，进而造成GC抵抗的原因之一。 【关键词】系膜增生性肾小球肾炎;肾病综合征;外周血淋巴细胞;Bax;凋亡 )Abstract：Ojective To investigate the relationship between expression of Bax protein and apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBLs) in children with primary nephrotic syndrome (NS) with the pathology type of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), so to further explore the mechanism of glucocorticoid-resistance in children. Methods The PBLs in MsPGN-NS and normal children were isolated with Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. Then they were treated with phytohemagglutinin (PHA) or PHA plus dexamethasone (Dex). At the 24th and 48th hour of culture, the expression levels of Bax protein and apoptosis proportion were measured by flow cytometric analysis. Results The Bax protein levels in PBLs of Dex in the control group were much higher than those in both the MsPGN-NS group and normal children (P0.01) in a time-dependence manner (48 h24 h). However, at each time point the Bax protein levels of
肾小球肾炎的常见发病机理 肾小球肾炎的三大发病机理。肾小球肾炎是肾病疾病的一种，经常引起肾功能衰竭。肾炎肾病一般早期症状不明显，到了晚期肾功能衰竭，危害病人的生命。肾小球肾炎分为原发性和继发性两种，下面我们听听专家是如何介绍的，原发性肾小球肾炎的发病机理。 肾小球肾炎的三大发病机理，专家给出如下解释： 1、免疫复合物沉积在肾小球上皮细胞： 上皮细胞受到损伤，其表面的C3b受体会进一步诱使大量免疫复合物沉积至上皮下，导致膜型肾病的产生。如果光学显微镜下仅有肾小球上皮细胞肿胀，电子显微镜下可见上皮细胞足突广泛融合变平，则为微小病变肾病，绝大多数病例预后良好。 2、免疫复合物沉积在肾小球系膜区： 大量的免疫复合物沉积肾小球系膜区，吸引炎性介质浸润，产生炎性反应。导致肾脏系膜细胞损伤，使系膜细胞增殖、收缩。系膜细胞增生、系膜基质增多，这就是系膜增生性肾小球肾炎，此时如果再有内皮细胞的增生，就是毛细血管内增生性肾小球肾炎。随着细胞分泌的介质、基质增多，毛细血管管腔狭窄，造成缺血缺氧，同时系膜细胞在炎性介质与基质的作用下表型转化为肌成纤维细胞，大量细胞外基质产生，病情恶化，肾脏纤维化进展;系膜细胞收缩，导致滤过面积较少，滤过的分数降低，基底膜受到损伤，通透性增加，有用物质漏出;再有系膜细胞的吞噬功能下降，使得免疫功能下降，大分子物质不能被吞噬，大量堆积最终使得系膜细胞表型转化为肌成纤维细胞，分泌不易被降解的ECM，健康肾脏功能的细胞逐步丧失。总之，受损的系膜细胞在肾脏纤维化中占据了中心位置。随着损伤细胞的扩大和蔓延，肾脏的健康肾单位愈少，肾脏纤维化逐步进展。 3、免疫复合物沉积在肾小球内皮下： 正常健康的肾小球内皮细胞有其正常的功能，当内皮细胞受到损伤，结构发生变化，功能也相应的产生变化。受损后的内皮细胞抗凝活性下降，促进了血小板的粘附与聚集，导致肾小球毛细血管微血栓形成，局部缺血缺氧;再者由于受损，NO(一氧化氮)、PGI2(前列环素)等血管扩张因子减少，分泌的血管紧张素增加，导致血管收缩，产生肾内高压;此外，受损后电荷滤过屏障产生障碍，基底膜受伤通透性增加。内皮细胞受损后的三种结果交互作用，进一步导致肾脏局部微循环障碍，部分肾小球硬化，并出现血尿、蛋白尿等临床表现。 研究表明，肾小球肾炎患者发病的机制有很多，主要为抗原抗体反应引起的变态反应。 由于各类感染以及药物等，抗原抗体结合形成免疫复合物，根据自身不同的体积以及所携带电荷的影响沉积在肾脏不同的固有细胞区域，分别沉积在内皮下、系膜区、上皮下位置，免疫复合物不断的沉积，对肾脏不同的固有细胞形成损伤。根据肾脏病变的性质、部位以及范围，分为不同的病理类型，微小病变肾病，膜性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎等。 肾小球肾炎的三大发病机理。肾小球肾炎发病机理很多，大多数都是由肾小球肾病疾病演变而来，常规检查时肾病病人会有很多检查，主要表现特征是面色苍白、乏力、生长发育迟缓等就诊，确诊时常已伴有不同程度的肾功能不全。希望大家能够注意多多预防肾病疾病，做好肾小球肾炎的预防与治疗工作。
低密度脂蛋白对培养的人肾小球系膜细胞的增殖作用及冬虫夏草对其的影响 * 摘要目的：探讨肾小球硬化的发病机理；并发现治疗肾小球硬化的治疗方法。方法：(1)通过测定［3H］胸腺嘧啶的掺入率，检测体外培养的人肾小球系膜细胞的增殖；(2)对人肾小球系膜细胞进行纯化和培养并对低密度、高密度脂蛋白进行［125I］标记。结果：(1)肾小球系膜细胞选择性结合和摄取［125I］LDL，(2)LDL刺激系膜细胞增殖且增殖作用具有双向性，(3)冬虫夏草对LDL 引起的细胞增殖具有抑制作用。结论：LDL刺激系膜细胞增殖可能直接参与肾小球硬化的发病，高脂血症对肾脏的损害可能由肾小球系膜细胞介导；抑制系膜细胞增殖可能对肾小球硬化的防治具有一定的可行性。 主题词人类；脂蛋白类，LDL；冬虫夏草；肾小球硬化症，病灶性Proliferation of cultured human mesangial cells caused by LDL and the adserse effect of Cordyceps WANG Xiao-Xia, WU Zhao-Long Shanghai Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai(200032) Abstract AIM:To study the pathogenesis of glomerulosclerosis in vitro and find a treatment method of glomerulosclerosis.METHODS：Human glomerular mesangial cells were purified and cultured: Low density lipoprotein(LDL) and high density lipoprotein (HDL) labelled with［125 I］; and human mesangial cells （HMC）proliferation measured by counting ［3 H］thymidine incorporation. RESULTS：(1) Cultured HMC uptake ［125 I］LDL selectively, (2)LDL stimulated HMC proliferation and had a biphasic effect on HMC proliferation, (3)Cordyceps militaris had a strong inhibition on HMC proliferation induced by LDL. CONCLUSIONS：HMC proliferation induced by LDL may directly participate in the pathogenesis of glomerulosclerosis. The deleterious effects of hyperlipidemia on the kidney may be mediated by HMC. Therefore, inhibiting HMC proliferation may be practicable in the treatment of progressive glomerulosclerosis. MeSH Human; Lipoproteins, LDL; Glomerulosclerosis, focal; Cordyceps sinensis 肾小球硬化是导致肾功能减退的主要因素之一［1］。研究发现，高脂血症与肾小球硬化关系密切。高脂血症时，大量脂质沉积在系膜细胞表面引起细胞增殖，可能是导致肾小球硬化的关键［2］，作用机理还不太清楚。为了在细胞水平
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明 1. 对于悬浮细胞： a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。注意：PBS重悬不能省 略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。 b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 c. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 d. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。 e. 室温(20-25oC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。 f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。 2. 对于贴壁细胞的消化后检测：
P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义△ 柳飞，唐万欣，黄颂敏* 四川大学华西医院肾内科，四川 成都 610041 摘 要：目的：探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。方法：将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组：正常对照组，高糖组，甘露醇组，不同浓度胰岛素组，高糖加不同浓度胰岛素组。用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光（FSC）大小。结果：正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(p<0.01)；FSC为正常对照组的1.42倍(p<0.01)。不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加，但无统计学意义（p>0.05）。结论：(1) P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。(2) 高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调，且与渗透压无明显关系。(3) P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大，在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。 关键词：糖尿病肾病 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21 细胞肥大 糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糠尿病主要的微血管并发症之一。在西方发达国家，DN已成为终末期肾功衰（End-stage Renal Failure, ESRD）的首位病因。在我国，随着糖尿病的逐渐增加，糖尿病肾病也呈上升趋势。因此，深入研究DN的发病机制，制定更加有效的防治措施已成为肾脏病工作者面临的重要问题。 DN的发病机制尚未完全阐明，一般认为是多种因素共同作用的结果。DN早期即出现肾小球高滤过以及肾小球肥大。肾小球肥大可导致肾脏结构不可逆的变化，如肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致终末期肾功衰。近年来的研究证实各种因素对细胞生长的影响最终发生在细胞周期水平[1]。细胞周期调控依赖于一系列细胞周期调控蛋白。其中，P21是目前已知的具最广泛活性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。P21的过度表达与许多细胞增殖抑制和肥大有关[2-4]。有研究表明，糖尿病早期肾脏肥大至少部分与肾皮质P21蛋白表达增加有关[5]。而系膜细胞肥大在早期肾小球肥大中起关键作用，这已在糖尿病患者和糖尿病大鼠动物模型研究中得到证实[6、7]。P21在肾小球系膜细胞肥大中发挥什么作用，目前国内外研究甚少。 本研究采用半定量RT-PCR法，观察高糖刺激，不同浓度胰岛素作用下，鼠1097系膜细胞中P21mRNA的表达及其变化。相应条件下，用流式细胞仪测量细胞前向角散射光大小，从而获得系膜细胞体积大小，从细胞分子水平探讨高糖、胰岛素干预下，P21在系膜细胞肥大-肾小球肥大的关系，为DN的防治寻求新的治疗靶。 1 材料和方法 *通讯作者△教育部博士点基金资助项目，编号20020610078
细胞种类统计，培养基加抗生素 细胞名称PK-15 猪肾细胞； 形态特性上皮细胞样 生长特性贴壁生长 细胞数量100万-200万 培养条件EMEM+10%Hyclone灭活血清 特征特性PK-15细胞建系于1955（Stice,E）。是PK-1a细胞的克隆系。该细胞系可用于多种病毒的增值及特性研究。另外，电镜观察发现，PK-15细胞内有C-型病毒颗粒存在，是研究C-型病毒的材料。
细胞培养常用几款抗生素比较 １、最常用：青霉素、链霉素联合抑制细菌，即所谓的“双抗”，主要针对革兰氏阳性菌、阴性菌；对于细菌的感染也可用庆大或卡那霉素； ２、如果真菌污染严重，可用两性霉素／制霉菌素控制； ３、若为支原体污染，可用庆大霉素／四环素／红霉素； 关于细胞培养抗生素使用的建议：由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，及时清理污染细胞可大大减少支原体、病毒的污染机会。潜在的支原体、病毒的感染会带来很大的危害。这些微生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者得到错误的实验结果。由于过滤技术的提高和超净台质量的改进，在规范细胞培养操作过程中引进污染的机会已经被大大减低。所以，建议常规的的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培养污染源较多(如组织培养)或者非常珍贵的细胞株时才使用抗生素。 青霉素80万u+pbs 4ml,链霉素100万u+pbs 5ml,各自混匀后，再一起混匀，过滤分装在9个1ml EP管中，放在-20度，配1升培养基时加1ml,或者按这个比例临时加。
双抗就是青链霉素混合液，青链霉素混合液(100X) (Penicillin-Streptomycin Solution）双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素-链霉素溶液(100X)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。 青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。 做法：青霉素是160万单位(0.96g)/瓶，链霉素是100万单位(1g)/瓶，取青霉素0.06g，链霉素0.1g，加10ml灭菌双蒸水，配制成青链霉素1万单位的母液，过滤后分装在小EP管中。使用时，可取1ml母液放入100ml的培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活 化（Caspase ）→进入连续反应过程 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开 关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋 亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外 界因素是细胞凋亡的启动剂， 它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号， 引起细胞凋亡，我们以 Fas -FasL 为例：Fas 是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家 族成员，它与 FasL 结合可以启动凋亡信号 的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡 诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的 Fas 相关蛋白 FADD 。Fas 又称CD95，是由325个氨基 酸组成的受体分子， Fas 一旦和配体 FasL 结合，可通过 Fas 分子启动致死性信号转导，最 终引起细胞一系 列特征性变化，使细胞 死亡。 Fas 作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但 FasL 的表达 却有其特点，通常只出现于 活化的 T 细胞和NK 细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效 地以凋亡途径置靶细胞于死地。 Fas 分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,deathdomain ）。三聚化 的 Fas 和FasL 结合后，使三个 Fas 分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同 死亡结构域的 蛋白FADD 。FADD 是死亡信号转录中的一个连接蛋白， 它由两部分组成：C 端（DD 结构域）和N 端（DED ） 部分。DD 结构域负责和Fas 分子胞内段上的 DD 结构域结合，该蛋白再以 DED 连接另一个带有 DED 的后 续成分，由此引起N 段DED 随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶 8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多 个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的 级联反应，即 Caspases ，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而 TNF 诱导的细胞凋亡途径 与此类似2）细胞色素C 释放和Caspases 激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心， 它不仅是 细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验 表明了细胞色素 C 从线粒体释放是细胞 凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 C 在dATP 存在的条件下能与凋亡相关 因子 1（Apaf-1）结合， 使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体， caspase-9被激活，被激活的 caspase-9 能激 活其它的caspase 如caspase-3 等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡 诱导因子，如 AIF ，参与 激活caspase 。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。 促凋亡因子能诱导细 胞色素 C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素 C 从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的 关键问题。 多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途 经也有细胞色素 C 从线粒体 的释放。如对Fas 应答的细胞中，一类细胞（ type1）中含有足够的胱解酶 8（caspase8）可被死亡受体 活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达 Bcl-2并不能抑制Fas 诱导的细胞凋亡。在另一类细胞 （type2） 如肝细胞中，Fas 受体介导的胱解酶 8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号 需要借助凋 亡的线粒体途经来放 大，而 Bid-- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶 8 向线 粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚， 但是已经确定Caspase 即半胱天冬蛋白 酶在凋 亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是 Caspase 不可逆有限水解底物的级联放大反应 过程，到目前为止，至 少已有 14种Caspase 被发现，Caspase 分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱 氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase 基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β 和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括 caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase 家族一般具有以下特征：1)C 端同源区存在半胱氨酸激活位点，
细胞凋的亡概念 细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，在一定的条件下，细胞遵循的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 从细胞功能上看，细胞凋亡对多细胞生物体具有重要的意义。一方面在生物发育过程中细胞凋亡可以清除没有功能的、不需要的、不正常的和有害的细胞，优化组织器官的结构和细胞数目，确保正常个体发育。另一方面在生物体整个生命过程中，每天都会产生许多功能异常的细胞，如癌变细胞、衰老细胞、被微生物侵袭的细胞等。细胞凋亡可以将这些细胞清除，并且由新诞生的功能正常的细胞替换。因此，体内细胞的诞生和死亡处于动态平衡，从而维持机体组织器官中细胞数量稳定和功能正常。 细胞凋亡信号转导通路 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活(Caspase)→进入连续反应过程。由于细胞凋亡启动阶段的不同，其可分为三条主要通路，即线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路。 线粒体通路，即通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活 Caspase。线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。此通路由含BH3 结构域的Bcl-2 家族成员(Bid、 Bad、 Bim、 Harikari 、Noxa等)与另外的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆的Bcl-2家族成员(Bax亚家族成员Bax，Bak 等) 相互用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，从而引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素 C (Cytc)和其他蛋白。Cytc 的释放是线粒体凋亡路径的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子 1(Apaf-1)结合，使其形成多聚体，而后通过 Apaf-1 氨基端的 Caspase 募集结构域(caspase recruitment domain CARD)募集胞质中的Caspase-9 前体，并促使 caspase-9 与其结合形成凋亡小体，被激活的 caspase-9能激活其它的 caspase 如caspase-3 和 caspase-7 等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如 AIF，参与激活 caspase，促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。 内质网通路，即由内质网失常引起，而非以细胞膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发。内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网Ca2+平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累是关键步骤，它们会诱导位于内质网膜的Caspase-12 的表达，同时诱导胞质的 Caspase-7 转移到内质网表面。Caspase-7 可激活Caspase-12，而激活的Caspase-12 可进一步剪Caspase-3 从而引发细胞凋亡。 死亡受体通路：由各种外界因素作为细胞凋亡的启动剂，然后通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受(TNFR)基因超