免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：
1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。其不同点为三步法，且有放大作用，反应完全依赖于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应灵敏度高，背景低。注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同一种动物，且二抗必须过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术把握，是组织化学的关键环节，是取得满意效果的必要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分子。此技术目前主要应用在生物胺的显示中。其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量判断是结果判断中最重要也是具有意义的判断，其判断结果有助于统计学的分析处理。组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（最终阳性产物）进行测量，以数值反应被检测物质的含量。此法是阳性结果的进一步检测和分析，更加直观地反应实验结果，更有力地说明实验结果。常用有人工定量分析与仪器定量分析两类。
9.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
10.组织化学：指在形态学基础上研究组织或细胞中物质的化学成分和活性，并进行定性、定位、定量及其代谢状态的学科。其目的是联系形态、化学万分和功能来了解组织或细胞的代谢变化。
11. ABC法：即亲和素-生物素-过氧化物酶复合物
法，其基本原理是在抗生物素和生物素之间形成共价和不可逆的结合，通过抗生物素在辣根过氧化物酶和第二抗体之间建立生物素桥联，使酶定位于所需测定的特异性抗体周围。其优点在于易于找到合适的第二抗体。
12.细胞骨架：指细胞内的结构网架，由一些细丝成分组成，包括微丝、微管、中间丝和微梁网格。
二、问答题
1.简述酶组织化学的基本原理。
答：在酶组织细胞化学方法中，从原理上讲，可分为两在类型。一类是酶是活性——酶组织细胞化学方法，属于一般组织细胞化学方法。一类是酶蛋白质的存在及存在的部位——免疫酶组织细胞化学方法，属于免疫组织细胞化学的内容。目前，通常是将两者结合起来，即显示酶活性，又酶蛋白的存在、分布及代谢情况。
2.用箭头表示免疫电镜技术（包埋前法）的过程。答：包埋前法实用于酶标法和PAP法。具体过程如下：取材→→固定→→冰冻切片（40~150μm）→→免疫染色（同酶标法和PAP法）→→选择阳性部位，在解剖显微镜下，取下阳性部位，裱于盖玻片上→→1%的锇酸固定，1~1.5h→→脱水→→平板包埋聚合→→修块、超薄切片（50~80nm）、裱于铜网→→重金属盐双重染色→→电镜观察、记录、照片。
3.简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。
答：此过程包括：⑴杂交前准备：取材和固定→玻片及盖片的处理（粘附剂的使用）→器皿处理和溶液配制容器的处理→增加组织的通透性和核酸探针的穿透性→减低背景染色→防止RNA酶的污染；⑵杂交过程（杂交反应）：包括变性与杂交；⑶杂交后处理①冲洗：用一系列浓度不同的和温度不等的平衡盐液冲洗（一般原则是盐液的浓度由高到低，温度由低到高），并在冲洗的过程中防止切片干燥；②RNA酶消化处理：仅使用于RNA杂交。
⑷显示/杂交体的检测：①同位素标记者：用放射自显影技术显示。②非同位素标记者：应选择相应的方式显示。⑸对照实验：根据核酸探针和靶核苷酸的种类在现有可能条件下选定。
4.组织化学质量控制有哪些方法？
答：组织化学质量控制的方法有：⑴实验过程的质量控制：①试剂的质量控制，包括：试剂的特异性和敏感性；最佳的稀释度；在已知阳性和阴性的标本上，观察其染色结果的复合情况；要确定染色的温度和时间；保存的时间和有效期的时间。②操作步骤的质量控制，包括：组织标本制备的质量控制；操作过程各环节的质量控制a. 各种溶液的浓度、成分、PH值的控制，容器的质量标准。b. 特殊试剂的配制：c. 步骤中间环节的控制；⑵背景染色的控制①疏水作用②离子作用—电荷作用③内原性酶活性作用④抗体污染或/抗体纯度不高⑤内原性抗生物素/生物素蛋白结合活性⑥抗原的扩散⑦交差反应⑧其它原因。
5.比较PAP法和ABC法的异同。
PAP ABC 灵敏性低（1倍）高（20倍）
特异性高更高
背景一般有背景一般很少或无背景
复合物特点PAP复合物
只用于PAP法，且抗体与一抗的种族相同
ABC复合物
用途广，可通用，用生物素标记的均可
用途免疫组织化学（IHC）IHC、ELISA、原位杂交
6.简述PAP法的过程。
答：⑴处理切片，封闭内源性物质和避免交叉反应；
⑵抗孵育切片，湿室，37℃，30-60分钟；⑶PBS 漂洗，3次，5分钟/次；⑷2抗孵育切片，湿室，室温，37℃，30-60分钟；⑸PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑹加入PAP复合物，孵育30分钟；⑺PBS漂洗，3次，5分钟/次；⑻染色0.01～0.02%H2O2+0.01～0.05%DAB+0.05～
0.10UMTris-Hcl(PH7.40)室温，3-5分钟，避光；
⑼漂洗，双蒸馏水洗涤；⑽复染；⑾漂洗，双蒸馏水洗涤；⑿脱水、透明、封片；⒀光镜观察，记录。
7.定量分析有哪些方法？
答：⑴人工定量分析；⑵仪器定量分析：①显微荧光分光光度计；②显微分光光度计/仪；③显微图像分析仪：灰度、长度、周边、面积、曲线长等；
④流式细胞计数仪；⑤激光扫描共聚焦显微镜技术。
8.增强组织化学染色的方法有哪些？
答：⑴酶消化在抗原暴露中的作用：①胃蛋白酶：0.4%、37℃、20～30分钟。②胰蛋白酶：0.1%、 37℃、5～40分钟。③链霉蛋白酶：0.06%、室温、10分钟。⑵微波炉处理在暴露抗原中的作用：其原理在于通过微波管发射较高频率的电磁波而使组织内部的分子发生高速振荡，使组织温度升高，同时加速分子交联，促使组织中抗原决定簇暴露。步骤：脱蜡、水化的标本微波处理10～20分钟，功率600W→室温冷却15分钟以上→常规免疫细胞化学染色。⑶不同抗原组织准备方法的检测：主要在固定方法和固定剂上存在差异。①细胞外和基底膜相关蛋白抗原：交联固定剂碳二亚胺和蛋白沉淀类固定剂乙醇。②细胞膜和胞浆相关免疫球蛋白：首选蛋白沉淀类固定剂乙醇。③胞浆酶和胞浆激素：醛类固定剂。④各类组织和细胞抗原：低浓度的多聚甲醛4-5h（4℃）固定后直接进行冰冻切片。
9.简述结果的判断的类型及意义。
答：结果的判断类型：⑴定性判断，即实验结果真实性判断；⑵定位判断，即结果出现的部位的确定，可以协助定性判断；⑶定量判断是结果判断中最重要也最具有意义的判断。意义：实验结果的判断直接关系着实验的成败，因此，结果判断是整个实验工作的核心和结论，必须是真实的结果，特别是一些实验结果与前人或与其它文献报道差异较大时，作出结果判断时应特别慎重。
10.简述核酸原位杂交技术的特点。
答：核酸原位杂交技术的特点如下：①特异性与敏感性高。②在组织细胞内定位可检测的靶序列。③能够将组织学表现与基因功能的变化相结合。④可完好的保存组织与细胞的形态结构。⑤不需要从组织细胞中提取核酸，避免了抽提中核酸量的损失。
⑥对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列。⑦可用于研究个别细胞中的核酸，而不受组织中其他细胞的影响。⑧不需要破裂细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。
11.用箭头表示石蜡切片技术的步骤。
答：石蜡切片技术步骤：①取材→②固定→③脱水→④透明→⑤浸蜡→⑥包埋→⑦切片。
12.简述免疫组织细胞化学技术的全过程。
答：免疫组织细胞化学技术全过程：抗原提取和纯化→→免疫动物→→抗体的分离、提取、纯化和效价的确定→→标记抗体→→标本制备→→免疫反应过程→→观察及结果判断与分析。
13.常见的免疫组织化学方法有哪些？
答：常见的免疫组织化学方法：①免疫荧光组织/细胞化学技术；②免疫酶标组织/细胞化学技术；
③过氧化物酶一抗过氧化物酶法（PAP法）；④抗
生物素—生物素复合技术（ABC法）；⑤SPA免疫组织/细胞化学技术；⑥免疫电镜技术。
14.影响核酸杂交的因素有哪些？
答：影响核酸杂交的因素：①核酸分子的浓度和长度：核酸浓度大，单链核酸间的碰撞几率大，复性几率大。单链探针浓度越大，杂交效率高，但双链探针浓度过高会影响杂交的效率。②温度：温度过高不利于核酸的复性，温度过低不利于少数碱基配对形成的局部双链分离。③离子强度：离子强度低，杂交速度慢，随着离子强度增高杂交反应率增加。
④杂交液中的甲酰胺：甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可减低核酸杂交的Tm。⑤核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，复杂性越高，形成正确配对难度越大，反应速度越慢。⑥非特异性杂交反应：为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，以减少对探针的非特异性吸附作用。
15.简述核酸分子原位杂交的基本原理。
答：核酸分子杂交是依据DNA双链碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样品中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法。即双链核酸分子（DNA双链）分子分解为单链—变性（采用加热/提PH值来实现）→→杂交后单链聚合为双链—退火/复性。
16.简述组织化学的基本要求。
答：组织化学的基本要求：①保持组织细胞良好的形态结构。②具备高度的特异性。③应有一定的灵敏性。④可重复性。⑤生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。
17.简述免疫组化在人体研究中的主要用途。
答：免疫组化在人体研究中的主要用途：㈠免疫组化在肿瘤病理学的研究和诊断中的主要应用：（1）组织起源不明肿瘤的研究；（2）研究病原体与肿瘤的关系；（3）协助确定肿瘤的良恶性；（4）测定肿瘤细胞的增殖活性；（5）分化差的癌和肉瘤的鉴别；（6）确定转移性恶性肿瘤的原发灶；（7）恶性淋巴瘤的诊断和分型；（8）为制定肿瘤的治疗方案提供依据。㈡免疫组化技术在病原微生物的鉴定中的应用；㈢免疫性皮肤疾病在诊断中的应用。
三、填空题
1.影响酶催化反应的因素是酶浓度、底物浓度、激活剂浓度、抑制剂浓度、PH值、温度。
2.核酸杂交的一般步骤是待测核酸的制备与变性→探针的制备及标记→固相支持物的选择与处理→预杂交、杂交、漂洗→检测显示杂交信号→结果的判断分析。
3.增强特异免疫染色的方法有①蛋白酶消化法②合适的抗体稀释液③温育的时间长短30~60℃4℃过夜④多层染色，提高敏感度。
4. 常用的固定剂是醛类、非醛类、金属类。
5.核糖体是核糖核酸和蛋白质组成。
6.抗体常用的标记物有荧光素、酶、抗生物素—生物素—HRP、金属。
7.根据探针的核酸性质分基因组DNA探针，cDNA 探针，RNA探针，寡核苷酸探针四类。
8.仪器定量分析技术有显微荧光分光光度计、显微分光光度计/仪、显微图像分析仪、流式细胞计数仪、激光扫描共聚焦显微镜技术。
9.组织化学的基本要求是保持组织细胞良好的形态结构，具备高度的特异性，应有一定的灵敏性，可重复性，生物反映的产物必须在原位沉淀、色深、不溶和具有稳定性的特点。
10.石蜡切片的5大步骤是①取材→②固定→③脱水→④浸蜡、包埋→⑤切片。
11.组化中常用的酶类：辣根过氧化物酶（HRP）、小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶。
12. 固定基本原则是组织块要尽量小，固定要及时和适时，选择合适的固定剂，要注意固定剂的浓度、PH值和温度。
13.固定方法是浸入法和灌注法。
14.免疫组织/细胞化学特点是高度特异性，高度敏感性，方法和过程统一，形态、机能、新陈代谢等生命活动相结合。
15.核酸原位杂交技术的特点是
特异性、敏感性高；可检测的靶序列在组织细胞内定位；能够将组织学表现与基因功能的变化相结合；可完好的保存组织、细胞的形态结构；不需要从组织细胞中提取核酸，避免了抽提中核酸量的损失；对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性，可在1%细胞中检出目的核酸序列；可用于研究个别细胞中的核酸，而不受组织中其它细胞的影响；不需破裂细胞，经适当处理后探针可进入细胞，与细胞内核酸杂交。
16.内质网分粗面内质网和滑面内质网两类。
17.根据试剂或标记物的不同分一般组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、核酸分子原位杂交组织化学四类。
18.核糖体分游离核糖体、附着核糖体、多聚核糖体三类。
19.溶酶体分初级溶酶体、次级溶酶体、残余体三类。
20.细胞骨架是微丝、微管、中间丝和微梁网架组成。
21.确定最适PH的方法是查阅文献，根据前人的经验，预实验印证和实验测定最适PH值。22.实验过程的质量控制是试剂的质量控制、操作步骤的质量控制、背景染色的控制。
23.在酶组织化学中，根据其反应原则，显示酶的方法，可分为沉淀反应法和电子传递法两大类。
24.辣根过氧化物酶（HRP）显色原有DAB、AEC、CN、H-Y试剂。
25.荧光组织化学分为自发荧光、诱发荧光、荧光染色、免疫荧光、酶促荧光。
26.荧光图象的记录方法有描述法、荧光照相、暴光时间测定法、强弱表示法、显微荧光测定法。27.免疫反应的形成可分致敏阶段、反应阶段和效应阶段三个阶段。
28.PAP法的特点是抗体活性高；灵敏度高；背景染色浅，有利于观察和记录。
29.ABC法的优点是①敏感性强；②特异性强，背景染色浅；③方法简单，节约时间；④ABC试剂盒国内已大量生产，价格适中；⑤生物素具有与多种显示剂结合的能力，可用作双重或多重免疫染色。
30.免疫电镜技术的基本要求是保持超微结构完好，结构不改变；保存最多的抗原及抗原活性。31.免疫电镜技术分铁蛋白标记免疫电镜技术、酶标记免疫电镜技术、PAP法和胶体金免疫电镜技术四类。
32.胶体金免疫电镜技术优点是①金颗粒电子密度高，清晰可辩，形态规则；②方法简单一些，不如PAP法复杂；③同一组实验，可用不同直径的金颗粒可作多种抗原的区别研究，双标；④金标抗体能发生二次电子，可作用扫描电镜观察。
33.免疫电镜技术包埋后法缺点是①抗原及活性损失大；②部位不准；③得到阳性结果难度大。
四、实验设计题
（一）某实验室拟采用ABC法研究缺血性心肌损伤时ANP（ANF）的变化。请设计此课题。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；ABC免疫复合物试剂；抗大鼠ANP的特异性兔抗体（一抗）；生物素标记羊抗兔免疫球蛋白（二抗）；正常羊血清PBS 液；DAB显色剂；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；磷酸盐缓冲液PBS；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）等。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。
⑵实验组大鼠采用结扎冠状动脉方法制作缺血性心肌损伤模型，对照组（即假手术组）只暴露冠状动脉但不结扎。
⑶实验过程：①从实验组大鼠心肌损伤组织中按设计好的不同时间点取材（对照组取材部位、时间与实验组相同），制备石蜡切片标本；②石蜡切片脱蜡下水；③3%H2O2室温避光封闭20min，蒸馏水洗；④TBS微波修复抗原，0.01mLMPBS洗3min ×3次；⑤正常羊血清37℃，孵育20min，甩干不洗；⑥兔抗ANP37℃孵育1h，0.01MPBS洗3min ×3次；⑦生物素化羊抗兔IgG37℃孵育30min，0.01MPBS洗3min×3次；⑧加ABC复合物37℃孵育30min，0.01MPBS洗4min×4次；⑨DAB室温避光显色5～10min（镜下控制显色时间），自来水终止；○10切片脱水，透明封片。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。（二）某实验室拟采用PAP法研究缺血性脑损伤时NPY的变化。请设计此课题。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；PAP免疫复合物试剂（来自于兔）；抗大鼠NPY的特异性兔抗体（一抗）；猪抗兔免疫球蛋白（二抗）；正常猪血清PBS 液；DAB显色剂；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；磷酸盐缓冲液PBS；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）等。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。
⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型，对照组（即假手术组）只暴露颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程：①从实验组大鼠大脑皮质组织中按设计好的不同时间点取材（对照组取材部位、时间与实验组相同），制备石蜡切片标本；②石蜡切片脱蜡下水；③3%H2O2室温避光封闭20min，蒸馏水洗；④TBS微波修复抗原，0.01mLMPBS洗3min ×3次；⑤正常猪血清37℃，孵育20min，甩干不洗；⑥兔抗NPY37℃孵育1h，0.01MPBS洗3min ×3次；⑦猪抗兔IgG37℃孵育30min，0.01MPBS 洗3min×3次；⑧加PAP复合物37℃孵育30min，0.01MPBS洗4min×4次；⑨DAB室温避光显色5～10min（镜下控制显色时间），自来水终止；○10切片脱水，透明封片。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。
⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。
（三）某实验室拟采用核酸原位杂交技术研究缺血性脑损伤时SPmRNA的变化。请设计此课题。1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）；0.1M PBS (pH7.2)；0.2M PB ((pH7.2)；0.1M甘氨酸；4%多聚甲醛；16×Denhardt溶液；预杂交液；20×SSC；抗体稀释液；TSM1；DIG DNA 标记检测试剂盒。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型，对照组（即假手术组）只暴露颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程：①麻醉大鼠后，用4%多聚甲醛灌流固定后取材，制备冰冻切片。②随机引物制备cDNA核酸探针，并用DIG DNA 标记检测试剂盒检测探针敏感性。③预杂交：滴加适量预杂交液，42℃30 min。④杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。（注意阴性对照）⑤洗片：4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗5min×2次。⑥3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃30min.⑦滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。⑧0.05M PBS洗15min ×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min ×2次。⑨显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。⑩将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。
（四）某实验室拟采用免疫电镜技术（包埋前法）研究缺血性脑损伤时NPY的变化。请设计此课题。
1、准备哪些试剂和药品。
二甲苯；30% H2O2和浓盐酸；梯度酒精溶液（100%、95%、90%、80%、70%）；蒸馏水；0.01M PBS缓冲液；复染液（如苏木精）；封片剂（中性树胶）；0.5%戊二醛-2%多聚甲醛；30%蔗糖/PBS 溶液；1%牛血清；抗大鼠NPY的特异性兔抗体（一抗）；生物素标记羊抗兔免疫球蛋白（二抗）。
2、写出实验的思路或过程。
⑴实验动物与分组：取大鼠（同种、同窝别、相近体重）20只，随机分为2组，实验组（缺血组）10只，对照组10只。⑵实验组大鼠采用结扎双侧颈总动脉方法制作全脑缺血性动物模型，对照组（即假手术组）只暴露颈总动脉但不结扎。
⑶实验过程：①麻醉大鼠后，经主动脉灌流0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固定后取材，制成厚切片。②PBS漂洗3次，每次15min。③30%蔗糖/PBS溶液中室温下静置至沉底。④液氮冻融，增加细胞膜通透性。⑤1%牛血清孵育组织块30min后PBS漂洗3min×3次。⑥一抗4℃孵育过夜后室温继续放置2h后PBS漂洗5min×3次。⑦生物素化二抗室温孵育3-4h后PBS漂洗3min×3次。⑧2%戊二醛-2多聚甲醛固定1h后PBS漂洗3min×3次。⑨DAB 室温避光显色5～10min（镜下控制显色时间），自来水终止；⑩1%锇酸固定30～60min后PBS漂洗，3min×3次。○11常规脱水，包埋。○12聚合。烤箱60℃24h。○13修块。聚合后的组织树脂片在显微镜下选取出阳性聚集的部位，用刀片修成1mm ×
1mm面积左右，粘于预先聚合好的树脂块上。而后依据阳性部位，将包埋块修成便于切片的形状和适当大小以提高电镜下的检出率。○14超薄切片。片厚60-100nm，置于100目铜网上。○15铅、铀染色：醋酸铀溶液染色8min，而后混合铅溶液染色8min。○16电镜观察。
⑷实验组与对照组均按上述实验过程进行。⑸观察记录结果：出现棕黄色颗粒即为阳性结果。
⑹将实验组与对照组比较，用统计学方法分析，得出结论。
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石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水： （石蜡切片染色前应置60℃1小时）。 ①二甲苯I、II，各30分钟。 ②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2抗原修复： 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附： 抗原修复液（10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制： ①储备液的配制： A液： 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml；B液： 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制： A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法： 高压锅处理技术： 枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。晾至室温抗原修复的注意事项： ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 3．PBS：5分钟，2次（置于摇床） 4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。 5．PBS水洗：5分钟，2次。 6．正常血清封闭： 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。 附： 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)： 按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体： 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。 第二天片子晾至室温 8．PBS：5分钟，2次。 9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟， 0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
标准化供应链操作规程(doc 58页)
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翔宇集团 NC标准化操作规程 供应链管理 翔宇集团信息部 2013年12月
目录 1普通采购操作规程............................................................................................................................ - 7 -1.1采购订单................................................................................................................................................... - 8 -1.2采购入库................................................................................................................................................. - 11 -1.3采购发票................................................................................................................................................. - 14 -1.4采购结算................................................................................................................................................. - 16 -1.5采购暂估................................................................................................................................................. - 17 -1.6应付单确认及生成凭证......................................................................................................................... - 19 -1.7采购付款................................................................................................................................................. - 22 -1.8凭证生成................................................................................................................................................. - 26 -1.9暂估后结算差异的处理（单到回冲）................................................................................................. - 28 -1.10采购退货................................................................................................................................................. - 30 -2普通销售操作规程.......................................................................................................................... - 34 -2.1销售订单................................................................................................................................................. - 35 -2.2销售出库................................................................................................................................................. - 39 -2.3销售发票................................................................................................................................................. - 43 -2.4确认销售成本及生成凭证..................................................................................................................... - 46 -2.5确认应收单及生成凭证......................................................................................................................... - 48 -2.6销售退货................................................................................................................................................. - 49 -3库存管理操作规程.......................................................................................................................... - 50 -3.1材料出库................................................................................................................................................. - 50 -
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
齿轮泵操作和维护-标准化操作规程 目录 1.目的 (2) 2.范围 (2) 3.职责 (2) 4.齿轮泵基本结构与工作原理简介 (2) 4.1齿轮泵结构图 (2) 4.2工作原理 (2) 5.齿轮泵操作 (2) 5.1启动前检查 (2) 5.2泵的启动和运行 (2) 6.维护和保养 (2) 6.1泵维护概要 (2) 6.2机械密封的维护 (2) 6.3润滑的维护 (2) 7.故障、故障原因及处理方法 (2)
1.目的 明确齿轮泵的操作方法、工艺参数控制方法，正确使用机泵，确保安全、平稳运行。2.范围 适用于中化珠海石化储运有限公司南迳湾库区的齿轮泵的使用和管理。 3.职责 3.1生产部操作工负责根据工艺要求正确开、停泵，进行机泵运行中检查，填写运行记 录。 3.2工程设备部负责机泵的维护检修。 4. 齿轮泵基本结构与工作原理简介 4.1齿轮泵结构图 1、泵盖 2、轴承 3、齿轮 4、泵体 5、轴图 4.2工作原理 动力通过轴传给齿轮，一对齿轮带动转子做同步反向旋转运动，使进口区产生真空，将介质吸入，随转子转动，将介质送往出口，继续转动，出口腔容积变小，产生压力（出口高压区）将介质输出。由于转速较低，自吸能力较强，流动性能较差的高粘介质，有充分的时间和速度充满空穴，所以适用于高粘介质。油泵内部密封面大，内泄较少，所以油泵效率较高，一般可达70%以上。同时可以达到高压输送介质。并且对较稀介质也有良好的适应性 4.3概述 4.3.1特点 TLB型稠油泵属于凸轮式容积泵。该泵采用机械密封，具有转速低、效率高、运转平稳、自吸能力强、操作方便、泵可预热、性能可靠、寿命长等特点。 4.3.2范围及用途 专门为高粘介质设计的高效油泵。该泵对粘度适应范围较宽，从2 mm2/s至100000 mm2/s
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总 结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
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免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。 组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。 一、动物的致死法及取材 (一)致死法 (1)空气栓塞法向动物静脉注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。 (2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。 (3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。 (4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。 (5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。 (二)取材注意事项 (1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。 (2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。 二、尸体解剖的取材 尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。 (1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。 (2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。 (3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。 (3)脾一块。 (4)胰一块。 (6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长 (7)膀胱一块。 (8)肾上腺左、右各取一块。 (9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。 (10)骨脊椎骨一块。 (11)胸腺一块。 (12)子宫宫颈和宫体数块。 (13)睾丸或卵巢各一块。 (14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。 (15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。 如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。 三、活检标本的取材 (一)常规活检标本的取材 应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪
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文档编号： 版本号： 密级： 翔宇集团 NC标准化操作规程 供应链管理 翔宇集团信息部 2013年12月
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目录 1普通采购操作规程............................................................................................ - 7 -1.1采购订单 ............................................................................................................... - 9 -1.2采购入库 ............................................................................................................. - 12 -1.3采购发票 ............................................................................................................. - 15 -1.4采购结算 ............................................................................................................. - 17 -1.5采购暂估 ............................................................................................................. - 18 -
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序
考试：标准化基础知识-标准化基础1 【单选】统一化是从个性中提炼共性，着眼于（） ? A. 统一性 ? B. 一致性 ? C. 多样性 ? D. 唯一性 ? A ? B ? C ? D ?正确答案：B 2 【单选】系列化是对（）产品中的一组产品同时进行标准化的一种形式? A. 同一类 ? B. 不同类 ? C. 所有 ? D. 一种 ? A ? B ? C ? D ?正确答案：A
3 【单选】简化是在肯定某些个性的同时共存，着眼于（） ? A. 一致性 ? B. 互换性 ? C. 精炼 ? D. 简练 ? A ? B ? C ? D ?正确答案：C 4 【多选】按标准制定的主体，标准分为国际标准、区域标准、国家标准及（）? A. 出口标准 ? B. 行业标准 ? C. 地方标准 ? D. 企业标准 ? A ? B ? C ? D ?正确答案：B C D 5 【多选】我国现阶段标准化工作中国家标准方面存在的问题是（）
? A. 标龄过长，标准老化现象十分严重 ? B. 标准制修订周期过长 ? C. 采用国际标准率低，标准更新速度跟不上 ? D. 标准内容不协调，形式与WT0规则不符合 ? A ? B ? C ? D ?正确答案：A B C D 6 【多选】标准文件有不同的形式，包括标准、（）等 ? A. 技术规范、规程 ? B. 技术报告；指导性技术文件 ? C. 试制总结 ? D. 指南 ? A ? B ? C ? D ?正确答案：A B D 7 【判断】等差数列、等比数列是已经标准化了的一般数值系列（）? A. 正确
? B. 错误 ?正确 ?错误 ?正确答案：错误 8 【判断】标准的使用价值通过其适用性表现出来，是标准的自然属性。标准的适用性如何，可以作为衡量该项标准使用价值大小的客观尺度（） ? A. 正确 ? B. 错误 ?正确 ?错误 ?正确答案：正确 9 【判断】标准化理念与个人的工作学习密切相关（） ? A. 正确 ? B. 错误 ?正确 ?错误 ?正确答案：正确 10 【判断】标准的载体就是标准的表现形式是一种文件（） ? A. 正确 ? B. 错误
综述 摘要在临床病理诊断中，免疫组化技术是一项应用广泛的技术，可鉴定多方面的指标，通过免疫组化可以判断肿瘤和疾病的多方面指标。 关键词病理诊断免疫组化技术 前言 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。在临床病理研究中免疫组化技术的应用很广泛，随着技术的发展免疫组化不仅在肿瘤的研究中具有重要意义，而且在疾病的确定等方面也表现出了良好的应用价值。 1 免疫组化技术 观察组织切片中抗原的数量及其在组织中的分布情况，对抗原进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。由于抗原与抗体特异性结合，因此通过免疫组化使标记抗体的显色剂( 酶、荧光素、同位素、金属离子等等) 显色来确定组织细胞内抗原( 多肽和蛋白质) 。IHC 所用标本主要为两大类: 组织标本和细胞标本，其中制作组织标本最常用、最基本的方法是石蜡切片。 2 免疫组化技术在临床诊断中的应用 2．1 肿瘤良恶性的判断 对于反应性增生还是肿瘤性增生，可用免疫球蛋白( Ig) 的轻链抗体检测B 淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别。在滤泡反应性增生时，滤泡反应中心的细胞不表达细胞凋亡蛋白( bcl-2) ，bcl-2 阴性; 而在滤泡性淋巴瘤中，由于90% 以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2 的高表达，bcl-2 阳性。而增殖细胞核抗原( PCNA) ，周期素( Cycling)，核抗原( Ki-67) 通过对肿瘤细胞增生的程度作出评价，从而提示增生细胞的良恶性。 2． 2 确定肿瘤分期 肿瘤分期是判断预后的一个指标，与是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭密切相关，而通过免疫组化方法可以判断肿瘤是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭。 2． 3 细胞属性的判定 通过特定抗体标记出细胞内相应的抗原成分，来判定细胞的属性，确定肿瘤的来源。如细胞角蛋白( CK) 是上皮性标记，CK 阳性提示肿瘤为上皮源性肿瘤; 降钙素抗体是甲状腺髓样癌特有的标记; 甲状腺球蛋白( Tg) 阳性提示是甲状腺滤泡性癌; 前列腺特异性抗原( PAS) 仅见于前列腺上皮; 胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 阳性则提示胶质肿瘤; CD20 和CD79a 阳性则提示B 细胞淋巴瘤; 平滑肌肌动蛋白( Actin) 阳性提示肿瘤为平滑肌源性; 胃肠道间质瘤中原癌基因蛋白产物CD117 阳性; 血管源性肿瘤中内皮细胞标记物CD34 阳性等等。 2． 4 确定来源不明的转移瘤的原发部位 对于来源不明的转移瘤，用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源［5］，进一步确定原发部位。