第25章病毒及其疫苗的生产制备技术
第一节病毒的生产制备
病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。
一、病毒生产的目的和用途
1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。
2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。
3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。
4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。
5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。
二、病毒生产制备的方法
1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。
2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。
3、细胞培养法（详见第二篇第18章）
不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。
以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。
第二节病毒疫苗的生产制备
病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
一、病毒疫苗的种类
(一)灭活疫苗：目前常用的有流行性乙型脑炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍体细胞与地鼠肾细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗），流感灭活疫苗。常用甲醛为灭活剂，以灭活病毒核酸而不影响其抗原性。
(二)减毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通过动物传代或细胞传代筛选对人毒力低的变异株病毒。常用的有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。
(三)亚单位疫苗：用化学试剂裂解病毒，提取包膜或衣壳上的亚单位，除去其核酸，以此制成的疫苗称亚单位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神经氨酸酶亚单位疫苗。
(四)多肽疫苗：采用乙肝携带者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制备的HBsAg基因表达产物制备的疫苗。
(五)基因缺失的减毒活疫苗：在病毒的基因组中，使其有毒力的相关基因发生缺失而制成的减毒活疫苗称基因缺失的减毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代），单纯疱疹病毒的α22基因缺失株，目前有待进一步研究。
(六)基因工程亚单位疫苗：将病毒表面抗原基因，通过基因重组，在酵母或CHO细胞中进行表达亚单位多肽抗原成分而制成的疫苗，称基因工程亚单位疫苗，如乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母和CHO细胞中表达而提取获得的纯品HBsAg多肽。即将上市。
(七)重组牛痘多价活疫苗。以牛痘苗为载体来表达数十种外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒，经一次划痕接种可使机体同时能获得对多种病毒的免疫力，大大减少了接种次数。此外腺病毒和脊髓灰质炎病毒的活疫苗也可作为载体与轮状病毒的抗原基因重组后的活疫苗，经口服后可同时获得两种病毒的免疫力，有待于进一步研究、开发。
上述病毒疫苗有的是采用细胞培养技术和细胞工程来进行生产制备的，现将采用细胞工程制备病毒疫苗种类和敏感细胞以及生产方式规于下表。
二、细胞培养法制备的常用疫苗（如表25-1）。
表25-1 采用细胞培养法生产的常用病毒疫苗
疫苗制备疫苗
的细胞培养方法
名称活/死(疫苗株)
脊髓灰灭活（Salk株）猴肾细胞（原代/2-3代）转瓶培养
质炎疫苗活（Sabin株）Vero细胞微载体培养
腮腺炎活（ME株）幼地鼠、狗肾转瓶培养疫苗豚鼠肾细胞罗氏瓶培养
麻疹活疫苗
Edomonste、
L16、沪191、
Moraten、
Schwar2株
原代鸡胚纤维母
细胞，人二倍体
人羊膜、狗肾、羊肾
豚鼠肾细胞
罗氏瓶培养
转瓶培养
单纯疮疹
死（72株）兔肾、豚鼠肾罗氏瓶培养
病毒疫苗豚鼠胚成纤维细胞转瓶培养
巨细胞病毒疫
苗活（Towne株）
WI-38人胚肺细胞转瓶培养
狂犬病毒疫苗死（AV01/AV02株）
（CUS株）
人二倍体细胞微载体培养
流行性乙型
脑炎疫苗
灭活（5-3株）人二倍体细胞多层滋养增殖器
森林脑炎病毒疫苗灭活
鸡胚纤维母细胞
幼地鼠肾细胞
转瓶培养
三、用细胞培养制备病毒疫苗的优点：
病毒疫苗的制备开始多用动物脏器、禽类胚胎（第一代疫苗）。然而因来源困难，很不经济，制作麻烦，数量受限，更危险的是这些组织中间可能含有潜在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代细胞来制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙脑疫苗等，随着细胞培养的发展，特别是自70年代后我国二倍体细胞株相继建立，为疫苗生产创造了极为有利的基础，这比用原代细胞制备疫苗更优越。如：
（1）在细胞传代期间可进行比较全面的检查，特别是对潜在病毒和致癌性的检查，确保安全。
（2）可使逐渐适应于无血清（或无蛋白）培基中生产繁殖，以排除过敏因素。
（3）可挑选对病毒敏感的细胞克隆。以利病毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量的提高。
（4）易于大量生产和进行连续自动化工业生产，以满足量的需求。
国外已建立的二倍体细胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，国内已建立KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生产，如麻疹活疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗等，从目前发展来看，用二倍体细胞制备疫苗将有取代其他原代细胞和传代细胞的趋势，但目前仍有一些病毒疫苗的制备还需用原代细胞，近年来有人主张用肿瘤细胞制备人用灭活疫苗。
四、提高疫苗的效力常采用的方法：
（1）细胞的药物处理：用某些药物处理细胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其方法为：在细胞形成单层后，用一些化学药物来处理，然后洗去，再接种病毒，就可使病毒提前成熟，产量高，现列表如下：
