目录
目录 (1)
摘要 (3)
Abstract (5)
前言 (10)
1 立题依据 (10)
2 课题研究思路 (14)
3 技术路线 (15)
4 已经具备的实验条件 (16)
正文 (17)
第一部分穿心莲内酯的含量测定 (17)
1 实验材料 (17)
2 实验方法及结果 (18)
3 小结 (20)
第二部分穿心莲内酯对细菌生长曲线的影响 (21)
1 实验材料 (21)
2 实验方法及结果 (22)
3 小结 (28)
第三部分穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1 生物被膜形成的影响30
1 实验方法 (30)
2 实验方法及结果 (31)
3 小结 (38)
第四部分穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1 QS系统中lasR/rhlR以及pvdQ基因表达的动态影响 (40)
1 实验材料 (40)
2 实验方法与结果 (41)
3 小结 (54)
讨论 (56)
结论 (68)
参考文献 (69)
论文的创新点 (74)
问题与展望 (75)
综述 (76)
致谢 (93)
在校期间公开发表的学术论文、专著及科研成果 (94)
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摘要
目的
考察穿心莲内酯铜绿假单胞菌PAO1生物被膜（BF）形成过程的影响，并在分子水平动态检测药物与细菌群体感应系统的相关性，从分子水平探讨穿心莲内酯的抗菌机制，进一步开发和利用提供科学的实验依据和理论。
方法
1 以穿心莲内酯作为对照品，采用高效液相色谱法制作穿心莲内酯实验品的控制质量药材。采用96孔板培养法，分别给予铜绿假单胞菌标准株、大肠杆菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株和铜绿假单胞菌PAO1穿心莲内酯100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL，0.1 μg/mL，0.01 μg/mL和0.001 μg/mL后，在24h内每隔1h 用酶标仪（A=420nm）检测96孔板培养液的吸光度并绘制生长曲线。
2 用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A和碘化吡啶荧光染色，采用激光共聚焦显微镜（LSCM）观察10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL和0.01 μg/mL穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜的形态和厚度的影响。
3 采用实时荧光定量PCR检测100 μg/mL、1 μg/mL和0.01μg/mL穿心莲内酯对铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统相关基因lasR/rhlR及pvdQ基因mRNA水平在2
4 h内动态表达的影响。
结果
1 通过测试细菌24 h内的生长曲线，结果显示空白组和药物组的生长曲线无差异，说明穿心莲内酯无明显影响细菌的生长的作用；
2 激光共聚焦显微镜（LSCM）结果显示，24h可观察到绿色和红色荧光信号零散，表明细菌刚刚开始聚集，多糖基质有微量的形成，生物被膜开始形成。48h 时可见绿色荧光逐渐增强增多，红色信号开始有小团聚集，表示生物被膜已逐步增多。72h时红色信号大量聚集，绿色信号成片生成，结构致密，表示生物被膜已分化成熟。在药物作用下，随着时间的推移，药物对细菌的作用逐渐显现出来，这种抑制作用在0.1μg/ml剂量左右最为明显；随着时间和药物浓度的变化，给药后各组的生物被膜的厚度也在发生变化。在24 h时空白对照组生物被膜厚度