实验一DNA的小量制备
小量法提取植物基因组DNA(CTAB法)
1 实验目的:
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物DNA,用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等,这就是研究基因结构与功能的重要步骤。本实验目的就是学习从植物材料中提取与测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法,进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理
细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取DNA 时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例:RNP 在0、14mol/L NaCl中溶解度很大,而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时,RNP的溶解度变化不大,而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时,DNP的溶解度最大,为纯水中溶解度的2 倍,因此通常可用1、4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品,可用适量的RNase 处理提取液,以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法:
1. CTAB 法:
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵,hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB):就是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7mol/LNaCl)就是可溶的,当降低溶液盐的浓度到一定程度(0、3 mol/L NaCl)时从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 能溶解于乙醇中。
2. SDS 法:
利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠,Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)使DNA 与蛋白质分离,在高温(55～65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp,在基因克隆工作中,通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上,否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比例太低,严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则:(1)尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)、多糖等杂质,并防止与抑制内源DNase 对DNA 的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。
几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子,故实现(1)尽量去除蛋白质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如EDTA、柠檬酸,而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA 处于溶解状态时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行DNA 溶液转移时用大口(或剪口)吸管。提取的DNA 就是否为纯净、双链、高分子的化合物,一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔
点”(melting temperature, Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。
3材料与试剂:
3、1长春花叶片
3、2 试剂
(1)CTAB 提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8、0),20 mmol/L EDTA-Na2,1、4mol/LNaCl(如表1),2% CTAB,使用前加入0、1%(V/V)的β-巯基乙醇。
表1 CTAB提取缓冲液配制
用HCl 调pH 值。
(2)TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8、0)。
(3)氯仿/异戊醇:将氯仿与异戊醇按体积24:1的比例混匀,置棕色瓶中,4℃保存。
4 仪器设备
离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。
5 方法与步骤:
5、1 在提取过程中用到的吸头,提取缓冲液等先高压灭菌(121℃,20min),取出后待用;
5、2 取大约指甲盖大小的植物叶片,放入1、5ml的EP管中, 加入液氮,用钢珠研磨成粉末状,再加入600μL的CTAB提取缓冲液,;
5、3 65℃水浴锅中水浴40min,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),轻轻混匀,颠倒几次,乳化1min。4℃,11,000rpm离心10min;
5、4 吸上清到新离心管中(约400μl),加入等体积预冷异丙醇,混匀,-20℃放置20min沉淀DNA;
5、5 5000 rpm常温离心15min,倒掉上清液;
5、6 用75%乙醇(900μl)洗沉淀,11,000rpm离心2min,倒掉乙醇,再用乙醇同样处理一次;
5、7 置于干燥仪干燥10min,将水分蒸干;
5、8 加入50μL去离子水,融解DNA,同时加入RNA酶(按每50μL DNA加入1μL RNase),37℃30min;
5、9 利用分光光度计检测OD260,同时进行1％凝胶电泳检测;
5、10 琼脂糖电泳检测DNA:制作1%的琼脂糖凝胶,吸取提取的DNA溶液5μL电泳检测;
5、11 -20℃保存DNA备用;
5、12 提取的DNA的浓度检测:取少量待测DNA样品,用蒸馏水稀释1,000倍;用蒸馏水做空白,分别在260nm、280nm测DNA样品的吸光值。
【注意事项】
1、叶片磨得越细越好。
2、注意移液器的正确使用。
3、由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
6、思考题
1.制备的DNA 在什么溶液中较稳定?
2.为了保证植物DNA 的完整性,在吸取样品、抽提过程中应注意什么？
7 实验结果:
结果计算
式中OD260nm 为260nm 处的光密度;L 为比色杯光径(cm);0、020 为1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
DNA 的紫外吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA 溶液适当稀释后,在751 分光光度计上测定其OD260nm、OD230nm 与OD280nm。如OD260nm/ OD230nm≥2OD260nm/ OD280nm≥1、8,表示RNA 已经除净,蛋白含量不超过0、3％。
8 实验分析:
传统DNA提取方法
CTAB 法、SDS 法就是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA; 然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂与盐离子,以免影响核酸溶解与抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。
CTAB 就是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐( > 0、 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0、 1～0、 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。SDS 就是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质与多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使 SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的 DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS 法操作简单,温与,也可提取到高分子量的DNA ,但所得到的产物含糖类杂质较多。
基因组DNA 经典的提取方法由于无需昂贵仪器与药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康。
DNA提取新方法
近年来出现了以螯合树脂、特异性 DNA 吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础 DNA 提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人与动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品 DNA 。
已有多篇利用纯化柱与玻璃粉纯化植物基因组 DNA 的报道。马小军等将CTAB 液提取与氯仿抽提两步的上清液直接通过Wizard 纯化系统纯化得到的DNA ,RAPD 扩增效果良好,产率达2 250μg/ g 。
张博等用硅珠(SiO2) 颗粒吸附DNA 纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的 DNA 样品。
黄椰林等对常规CTAB 法提取的DNA 用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN 的APCR 产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚与萜类化合物等次生代谢物的植物样品与长期保存的标本材料。
袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA。
目前国内外开发了多种商品化的DNA 提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效, DNA 质量较高,但价格昂贵,提取量少。
著名的国外的试剂盒生产厂家有Sigma2Aldrich、Promega、Invitrogen、 TaKaRa 、Whatman 等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液与组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。
国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。
除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。
DNA 试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA 提取—扩增 PCR 试剂盒,将DNA 提取与PCR 扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如Sigma2Aldrich 公司的Sigma’s Extract2N2Amp Plant PCR kit 等。
另外,还有高通量的DNA 提取产品,如高通量组织细胞研磨仪MM301 ,在常温与冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48 个甚至192 个。美国应用生物系统公司6100 型核酸提取仪,可用于RNA、DNA 的提取纯化,可自编程序, 可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96 个样品。