血细胞分离培养
以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞, 很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代, 近年来由于细胞培养技术的发展, 已有血细胞培养成功的报道, 正常血细胞在体外培养生长时间短, 只有白血病细胞, 血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系, 但多半为EB 病毒等致瘤病毒引起的转化细胞, （EBNA检查阳性）, 二甲基亚砜（DMSO ）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转, 表现为正常细胞. 所建立的细胞系多半为单核细胞系、B 淋巴细胞系、T 淋巴细胞系, 只在IL-2 产品问世后,T 细胞才可在体外建系、建株.
血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得. 也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞, 从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核- 巨噬细胞, 从骨髓中可以获得前提血细胞, 并可长期培养生长. 加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖, 例如在淋巴细胞中加入IL-2 （TCGF ）, 可促进T 细胞生长, 建立T 淋巴细胞系. 在多发性骨髓瘤细胞（B 细胞）培养中, 加 B 细胞生长因子, 可建立 B 细胞系；加入IL-6 （或正常淋巴细胞培养48h 的培养上清中的IL6 ）可使 B 细胞在体外长期培养, 建立了IL-6 依赖的B9 细胞系. 在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素D3, 可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞.
（一）外周血细胞分离：
外周血中除红细胞外, 还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等, 通常是分离这些血细胞的重要来源. 其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll 分离法.
1 、自然沉降法：
将无菌抗凝血放入试管中, 在37 ℃水浴中静置, 自然沉降1-2h, 可见到红细胞下沉, 并有明显分层, 上层血浆中富含有大量的和淋巴细胞, 下层主要为红细胞. 此方法简便但各层中的细胞种类多, 不纯. 血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主, 但也含有血小板, 大单核细胞和少量红细胞. 下层虽以红细胞为主, 但也有上述各种细胞, 此法适用于淋巴细胞转化试验.
2 、差异沉降法：
用6% 的右旋糖酐或3% 的明胶溶液无菌消毒后, 分装于中试管中, 由于这些物质能使红细胞形成“串状”, 比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快, 因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开. 其方法如下：用6% 的右旋糖酐溶液5-10ml, 经抗凝血5ml 加入上层中混合后静置于37 ℃水浴中30-60min, 即可见红细胞下沉, 上层富含大量粒细胞和淋巴细胞, 下层为红细胞, 使两者易于分离开, 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验, 下层可用于红细胞培养和实验, 经PBS 洗 3 次后即可加入培养基培养, 可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产. 此法分离的细胞纯度也不高.
3 、氯化铵分离法：
0.83% 氯化铵（NH4CL ）可使红细胞破裂, 通常将分离获得的粒细胞. 淋巴细胞中混有的少量的红细胞用0.83% 氯化铵进行裂解, 以排除红细胞的干扰. 另外, 此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备, 在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用. 方法如下：
将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经2000r/min 离心20min, 吸出上清血浆, 将下层的红细胞、白细胞混合后, 加入0.83 氯化铵, 用量为血细胞悬液液量的 3 倍, 于 4 ℃作用20min 后离心弃去上清.
在沉淀层中再加入新鲜0.83 氯化铵混匀后于 4 ℃作用20min, 以便彻底清除红细
胞, 离心弃上清.
收货下层的细胞用PBS 洗3 次后, 再用含5% 人AB 型血清的（含100U/ml 卡拉霉素）培养基制成悬液, 调整细胞浓度为（8-10 ）x10^9 个/L, 分瓶加塞在37 ℃普通培养箱中旋转培养（12r/h ）.
混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（NDV-F ）诱导22h, 收货上清就可生产白细胞干扰素. 此法分离的细胞纯度更差.
4 、Ficoll 分离法：
采用Ficoll 和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液, 通过2000r/min 离心后可使血细胞以不同相对密度分离开, 如分离淋巴细胞可选用相对密度1.077 的分离液；若分离血小板可用相对密度 1.090 的分离液, 若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度 1.120 的分离液, 现以淋巴细胞分离为例, 方法如下.
取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液, 用无钙、镁离子的PBS 稀释3-4 倍.
将Ficoll 淋巴细胞分离液事先分装于离心管中, 使其沉于管底, 并在37 ℃中预热.
用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入, 不让细胞悬液冲破分层液界面, 使其悬于分层液上方.
以2000r/min 离心20min 后, 不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上, 由于红细胞在Ficoll 作用下成串下沉, 故在离心管中分布在Ficoll 层下方, 淋巴细胞分布在Ficoll 层上方.
收集浑浊带分离获得的淋巴细胞, 用无钙、镁离子的PBS 洗3 次后, 再用培养基洗1 次后计数, 分瓶培养.
此法分离获得淋巴细胞纯度高.
分离液的制备：9% Ficoll （20 ℃下相对密度约1.020 ）24 份与33.4% 泛影葡胺（用泛影钠或Conray400 也可, 在20 ℃下相对密度约1.200 ）10 份混合后, 将其相对密度调至 1.077 金额可获得淋巴细胞分离液, 于121 ℃高压蒸汽灭菌30min, 室温保存备用. 若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整, 若配制低相对密度的分离液用稀释的Ficoll 来调整.
（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：
从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液, 在免疫学研究中是经常用到的. 方法如下.
无菌取上述淋巴器官, 若为扁桃体, 应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后, 在含高浓度抗生素的洗液中 4 ℃浸泡2-4h, 以防污染.
将淋巴器官剪成碎块, 用镊子压挤碎块, 或在金属丝网上研磨, 用洗液冲洗, 或用玻璃匀浆器研磨, 制成悬液.
自然下沉10min 后, 吸取上层细胞悬液, 弃去下层沉淀的组织块,1500r/min 离心, 取沉淀物, 用无钙、镁离子的PBS 洗 2 次后, 混悬于培养基中, 分瓶培养.
用上述分离法所获得的拎包细胞, 可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验, 同时可用于细胞因子的诱生和制备, 或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK 细胞) 、T δ细胞等, 供细胞移植用.
（三）人脐带血细胞分离培养：
人脐带血来源方便, 采集容易, 对母婴均无伤害. 近年来研究表明, 脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质, 具有刺激和促进骨髓造血干/ 祖细胞增殖、分化和再植能力的功能, 是造血生长因子的重要来源.
脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞, 其中CFU-G 、BFU-E 、CFU-GM 近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/ 祖细胞, 比骨髓更原始, 具有很强的自我复制和再植能力. 脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞, 对骨髓造血具有支持作用, 在体外培养扩增中具有更大的增值能力, 是造血干细胞的理想来源, 已被应用于Fanconi 贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗, 并容易获得骨髓造血功能的重建.
随着脐带血造血功能研究的不断深入, 为体外培养和扩增脐带血干/ 祖细胞建立了切实可行的方法.
健康产妇于新生儿娩出后立即断脐, 用含抗凝剂的采血装置无菌采集正常足月顺产儿脐带血, 一般可采集50-80ml.
将脐带血用无钙、镁离子的PBS 稀释2-3 倍, 缓慢沿壁轻轻加入含Ficoll-Hypque 淋巴细胞分离液的离心管中, 注意加样时切勿冲破分层界面,2500r/min 离心25min.
收集单核- 淋巴细胞层细胞, 先用PBS 洗2 遍, 再用培养基洗 1 次, 活细胞计数, 存活率应大于90% 以上.
将分离获得的脐带血单个核细胞（MNC ）, 浓度109 个/L, 用含5%AB 型血清（或10% 脐带血）的RPMI1640 培养基, 外加10mg/ml 干细胞因子（SCF ）、10ng/mlIL-6 和IL-3 、2U/mlEPO 、10ng/ml 的G-CSF 和GM-CSF, 置于37 ℃、5%CO2 下进行培养.
每周半量换液一次, 共培养 5 周.10 天左右可传代培养, 不断使脐带血中的单个核下拨进行扩增, 培养 5 周, 可使单个核细胞数增加252 倍, 同时了检测造血干细胞中CD34+ 细胞的比例, 经检测,CD34+ 细胞增加250 倍. 一般脐带血中MNC 体外扩增 2 周即可满足一个成人造血干细胞移植的需求.
若在分离获得的脐带血单个核细胞中, 用含20% 小牛血清的ROMI1640 培养基外加二羟基维生素D3 、地塞米松、维生素C 等刺激物, 培养1-2 周后, 可见有贴壁基质细胞的生长形态（呈梭形、多角形）, 说明脐带血中基质细胞可支持造血干细胞生长. （四）巨噬细胞分离培养：
巨噬细胞有多种功能, 是免疫应答中重要的抗原递呈细胞, 是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象. 该细胞易获得, 便于培养. 人巨噬细胞难以长期生长, 多用作初代培养. 目前所建立的无限细胞系大多来自小鼠, 如P388D-1 、J774A-1 、RA W309 、Cr-1 等均以恶性化, 但仍保留原有形态和吞噬功能, 易于传代和脱壁分离.
巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等, 实验动物多从血液、肺、脾和胸腔、腹腔获取, 通常预先注入刺激物后再采集, 以小鼠腹腔取材法最为实用, 方法如下. 实验前 3 天向每只小鼠腹腔注入肉汤培养基1ml.
引颈杀死小鼠, 手提尾将全鼠浸入70% 酒精中浸泡3-5s.
置动物于解剖台上, 用针头固定四肢, 剪开腹部毛皮, 双手用镊子撕开皮肤拉向两侧, 暴露出腹膜, 切勿撕破腹膜.
用70% 酒精棉球擦洗腹膜后, 用注射器吸10mlEagle 液注入腹腔中, 同时从两侧用手指揉压腹膜壁, 使液体在腹腔内充分流动.
用针头轻轻挑起腹壁, 将动物微倾向一侧, 是腹腔中液体集中于针头下吸入针管内.
小心拔出头, 将液体注入离心管中,1500r/min 离心10min 去上清, 加10mlEagle MEM 培养基洗2-3 次后计数.
每只小鼠可产生（2-3 ）x10^7 个细胞, 其中90% 为巨噬细胞, 以2.5x109 个/L 接种培养.
为纯化巨噬细胞, 去除其他白细胞, 接种数小时后, 待巨噬细胞预先充分贴壁, 此
时去除原培养基, 并用Eagle 液洗瓶壁1-2 次, 再加入新Eagle MEM 培养基, 置37 ℃、5%CO2 温箱中培养.
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
发放号： 1. 目的：规范单采血小板采集程序，保护血细胞分离机的性能，保障献血者的健康，确保血液 质量。 2. 职责：操作人员负责单采血小板的采集和对献血者单采全过程的监护。 3. 适用范围：适用于血小板单采过程。 4. 工作程序： 4.1分离机准备： 4.1.1接通电源，打开设备开关，设备启动并自检。 4.1.2在Trima献血者信息/装载系统主屏幕上，触按"献血者信息”按钮，进入献血者信息 屏幕，根据界面信息提示，分别输入献血者的性别、身高、体重并触按“确认信息”确认，进入下界面。 4.1.3根据界面提示，分别输入献血者的血型、血比积、血小板计数值，按“确认信息”确认。触按“确 认信息”，进入程序选择界面。 4.1.4根据预期产品量选择最优收集程序，触按“确认程序” 。 4.2装载耗材： 4.2.1触按“装载系统”，根据界面提示，悬挂空袋，插入卡匣，装载环形血道，关闭离心机门顺序装载 管路。 4.2.2触按“继续”按钮，系统自动放低卡匣，装载所有的泵、阀门以及传感器。 4.2.3根据界面提示，关闭采血管路以及样品袋管路上的白色夹子，触按“继续”按钮。 4.3初始化： 4.3.1根据界面提示，将ACD抗凝剂袋连接到抗凝管路上。挤压滴液室，使滴液室灌注到刻度线位置。 上下拉动抗凝管，使抗凝管道卡入抗凝传感器内，注意滴液室应在传感器下方。 4.3.2触按“继续”按钮，自动进行管路ACD抗凝剂灌注。 4.3.3灌注结束后，界面提示“开始献血者准备”后，开始进行献血者准备。 4.4嘱咐献血者找到舒适位置平躺于采血床上，伸展双臂。 4.5采血针管排空后，按《采血操作规程》选择合适静脉进行穿刺，确定采血针在静脉内后用胶带纸加 以固定，打开滑轮夹。 4.6采集： 4.6.1触按“开始抽取按钮”，进行收集产品。 4.6.2收集完成时，系统将发出“哗哗”的提示音，自动进入回输过程，回输完成，仪器会发出嘟嘟的提 示音，系统状态行显示“运行完成”的消息。 4.7触按“继续”按钮。系统提示您密封及去除所有的产品袋以及AC袋。关闭进血管路上的白
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
外周血白细胞的分离：（细胞分离液有市售，有各种型号：白细胞、单核细胞淋巴细胞等分离液） 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp 管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。 即得白细胞 可以试试红细胞裂解液 提供我的配方： 氯化铵82.9克；重碳酸钾10.0克；EDTA0.37克；用三蒸水配成1升 所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则 2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也 比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清 3.细节： a.淋巴细胞分离液要避光保存 b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的 c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀 d.所有操作都应在无菌环境进行 e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心 就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本 祝您好运了！
.参考方法： 人外周血, 肝素抗凝(100U ?m l) , 等量无血清培养液（或者PBS等缓冲液）稀释。按1∶2 的体积比缓置于比重1. 077 g/m l 的淋巴细胞分离液, 1000 ×g 离心 30 m in, 收集培养液2分离液界面上的单个核细胞。于无血清培养液, 400×g 离心10 m in, 洗涤2次。用培养液重新悬浮细胞并计数 我也是最近要做所以查了一下，仅供分享，呵呵！ 一外周血白细胞的分离 1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合））液面上，1500r/min离心20 min。（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上） 2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。 3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp管中。 4> 3000r/min离心20 min，弃上清。 即得白细胞 二自然沉降法 本法是利用血細胞自然沉降率的分離法，採集血液後應及時抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min後，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞，輕輕吸取即得富含白細胞的細胞群，離心洗滌後加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。
临床级干细胞分离培养等产业化关键技术研发 一、项目背景和意义： 作为生物技术最新的研究领域，干细胞的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段，为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光，必将引起一场医学的革命。干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位，因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程，预期在未来几年内会有更大的飞跃。尤其是近年来，干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称，干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点，蕴含着巨大的利润空间，是21世纪最有前景的朝阳产业。 临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗？这就需要建立一个临床级干细胞的标准，它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。目前干细胞治疗研究中开展最广泛的两类细胞是造血干细胞和间充质干细胞。对于造血干细胞，目前全世界已经建立了很多脐带血库来保存造血干细胞，并已得到广泛的应用。而间充质干细胞的建库和临床应用才刚刚起步，目前已初步应用于治疗血液病（与造血干细胞共移植）、心脏病、脊髓损伤和多种自身免疫性疾病等，并取得了一定进展。在间充质干细胞治疗同种异基因造血干细胞移植后发生
的GVHD方面，美国Osiris公司已完成了III期临床试验。间充质干细胞具有广泛的应用前景，但是，迄今为止仍没有一个国际公认的能够用于分离和鉴定间充质干细胞的表面标志，这造成了制剂细胞成分不均匀、质量难以控制等困难。 因此，开发特异性分离间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。按照临床应用的标准开发骨髓、脂肪、脐带等间充质干细胞的特异性分离纯化工艺，建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序对于间充质干细胞的未来应用具有重大的推动作用。 二、项目目标 1. 总体目标： 建立临床级干细胞标准、开发临床级干细胞分离与培养工艺以及建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序等。 2.具体技术指标： 建立1项成体干细胞的临床级分离纯化的关键技术、标准化操作程序和质控标准，实现间充质干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行，质量达到临床应用标准。 三、主要研究内容： 针对干细胞临床应用中所面临的分离、培养、扩增等关键问题，重点确定与国际接轨的临床级干细胞的标准，建立多种临床级干细胞的分离纯化和培养新技术，为实现干细胞产业化奠定基础。
家兔BMSC分离培养步骤 1.麻醉、备皮、消毒、铺巾：取1只4-5周龄新西兰幼兔，速眠新肌肉注 射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰卧固定于操作台上，褪毛，备皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)。 2. 在双侧踝关节处环形剪开皮肤，再纵行剪开皮肤至骶尾部，分离肌肉、 筋膜等软组织至见骨膜，电锯离断踝关节、膝关节及髋关节，获取家兔股骨和胫骨（桡骨）,置于装有PBS液的无菌盒内。（亦可从髂前上棘穿刺抽取骨髓） 3．用PBS液体清洗骨组织3-4遍，去除杂物、血迹后，在超净工作台上，无菌条件下剥离骨周围的肌肉软组织，用眼科剪从股骨和胫骨的干骺端打开骨髓腔，用含有适量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液约 6 ～ 8 mL。吸管反复吹打后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入 DMEM 培养基重悬，将上述细胞重悬液按照1∶ 1 的比例缓慢滴加到密度为 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分离液中，1 500 r / min 离心 20 min。离心后管内容物分为 3 层，收集中间乳白色云雾状的单个核细胞层，加入 DMEM 培养液稀释混匀，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪细胞及组织液。用含双抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，以 2. 0 × 10^5个/cm2的细胞密度接种于25cm^2培养瓶中，置于37 ℃，5%、饱和湿度的孵箱中培养。 4. 48小时后首次半量换液，去除浮物及其它非贴壁细胞（如造血干细胞），后每隔3天换液一次。 5. 7-10天后，待细胞融合长满至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代。 经过第一次传代后，骨髓间充质干细胞大约能占60%左右，并且呈漩涡状生长；一般经过3次左右传代后，骨髓间充质干细胞大约能占90%左右。
人表皮干细胞的分离培养 【摘要】目的探索人表皮干细胞原代培养方法。方法将皮肤标本进行分离，用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后，重悬细胞，接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。结果倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好，表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P＜0.05）。结论采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。 【Abstract】Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ，the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted，epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes （P＜0.05）.Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells. 【Key words】Epidermal stem cell；Culture；Identification 表皮干细胞具有无限增殖的能力，在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂DMEM培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），单克隆抗体β1整合素，单克隆抗体CK19，Ⅳ型胶原，DispaseⅡ酶，胎牛血清（FBS），表皮细胞生长因子，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）。 1. 2 实验设备CO2恒温培养箱，无菌超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜。 1. 3 方法 1. 3. 1 原代培养严格无菌操作，切取5×5 mm2左右的皮肤标本，标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮，切取前分离皮下组织，将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次，切成小皮块后置于含 2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜，培养基中含有青霉素（100 U/ml）及链霉素（100 μg/ml），第二天分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37℃条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15 min，胎牛血清终止消化，轻轻吹打，200目
血浆置换(plasma exchange, PE，即血浆单采术)是一种特殊的体外血液净化技术，利用血浆分离器或离心的方法将患者的血浆与血细胞分离，弃掉含有致病物质的血浆，并同时补充等量的置换液，从而达到治疗疾病的目的。 血浆置换比药物治疗更快、更有效地去除致病因子，为原发病的治疗创造了有力条件。血浆置换可以去除血浆中的致病的大分子物质，如：免疫球蛋白、免疫复合物、抗体、类风湿因子、内毒素及炎性介质、胆红素、LDL、病毒等。 血浆置换的治疗模式 1.单重血浆置换：血浆分离器分离患者的血浆和血细胞，弃掉含有含有致病因子的全部血浆，然后补充相同体积新鲜冰冻血浆（FFP）或白蛋白溶液。 目前还有两种更高级的方法可以选择性地去除血浆有害物质，而保留其他的有益物质。 2.二次膜式分离（double filtration plasmapheresis,DFPP）
首先是用一级血浆分离器分离患者的血浆和血细胞，然后再用孔径较小的二级滤器分离出大分子致病物质（如：球蛋白和免疫复合物），而保留宝贵的白蛋白等中分子物质。 3.血浆吸附（plasma adsorption,PA） 血浆分离器分离患者的血浆和血细胞，然后血浆再经过吸附柱，选择性地去除有害物质分。 血浆置换的临床应用 目前血浆置换可应用于临床上多种疾病，具体如下： 1.肾脏风湿疾病：
抗肾小球基底膜病（抗GBM病）、血栓性血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、ANCA相关性小血管炎、肾移植后超急性或急性抗体介导的排异反应、肾移植后FSGS复发、噻氯匹定/氯吡格雷相关的血栓性微血管病、SLE及狼疮性肾炎、类风湿关节炎，溶血性尿毒症综合征等。 2.脓毒血症和多器官功能障碍综合征 3.神经系统疾病： 格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、儿童自身免疫性神经精神障碍合并链球菌感染、IgG/IgA相关脱髓鞘多发性神经病，急性播散性脑脊髓膜炎、多发性硬化。 4.代谢性疾病： 家族性高胆固醇血症、甲亢危象、淀粉样变性。 5.血液系统疾病： 纯红细胞再生障碍性贫血，自身免疫性溶血性贫血，多发性骨髓瘤，血友病。 6.结缔组织病： （灾难性）抗磷脂抗体综合征、重症系统性红斑狼疮。 7.皮肤疾病： 重型药疹、天疱疮、类天疱疮、重症银屑病、妊娠疱疹、迟发性皮肤卟啉病等。 8.药物、毒物中毒性疾病： 三环类药物、地高辛、茶碱、维拉帕米、地尔硫卓、毒蘑菇、对硫磷中毒，原因不明的“致死性”中毒等 9.其他疾病：
人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640
Wo 名词缩写解释 HF Hemofiltration 血液滤过HDF Hemodiafiltration 血液滤透4008选件 BPM血压监测器 BTM血温监测器 BVM血容量监测器 OCM在线清除率监测 SN-Double Pump单针泵 DIASAFE plus Filter细菌过滤器 ONLINE plus在线血滤系统 Bibag(Standard)干粉 CDS中央供液系统 模组空间 Blood Pump血泵 Heparin Pump肝素泵 Level Detector空气监测器 Bibag/Conc.干粉
T1测试描述，包含错误信息 附注错误说明指定的数值是程序中使用的精确数值 具体数值和公差如下: 1. Arterial pressure 动脉压 3 mmHg/digit 和测定值的± 1位 2. Venous pressure 动脉压 3 mmHg/digit 和测定值的±1位 3. Dialysate Pressure 透析液压 粗略 6.0 mmHg/digit 和测定值的±1位 优良0.5 mmHg/digit 和测定值的±1位 4. CD resolution 0.06 mS/digit 和精确值的± 1位 5. T emperature 温度0.05 °C/digit和精确值的± 1位开始和运行测试的先决条件 错误信息描述 Power failure测试进行中的电源失败. Dialines not conn透析液管路没有插入到冲洗桥中. Shunt Cover open冲洗桥打开状态. Connect Conc.Line Wrong conc. Supply A液连接器在冲洗腔中或者完全没有连接. 该错误信息取决于中央供液系统预选中的设置菜单. Blood Sensed by OD光学探测器检测到系统中有血液. Flow alarm进或出透析器的线路打结, 故障发生在水路中. Water alarm供水中断. 单独测试步骤的描述 Bypass test (旁路测试)........................................................................ ........................................ . (6) Optical detector test (光学探测器测试)................................................................................ (8) Blood system test (血系统测试).............................................................................................. . (10) Venous pressure system test (静脉压系统测试)................................................................. . (13) Air detector test (空气探测器测试) (15) Display test (显示测试) (18) Arterial pressure system test (动脉压系统测试) (20) Battery test (蓄电池测试) (21) Blood leak test (漏血测试) (23) Temperature test (温度测试).................................................................................................... . (25) Negative pressure holding test (负压保持测试) (27) Positive pressure holding test (正压保持测试) (29) UF function test (超滤功能测试) (34) Conductivity test (电导率测试) (37) Diasafe/HDF filter test (细菌过滤器/血液滤透过滤器测试) (39)
ES 细胞培养 A.FBS的灭活与分装 1.化冻 将血清（Fetal Bovine Serum，Hyclone）从－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜；也可室温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存； 2.灭活 （1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准）； （2）当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短（比如：不超过5分钟），则仍可使用； 若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养； （2）取出，自然冷却至室温（约需1－3小时），可分装或－20℃继续冻存； 3.分装 （1）转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下）；标好批号和日期； （2）放入－20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。 B. 配制DMEM血清培养基 1.提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻； 2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入4℃冰箱保存。 配制比例如下：
C.原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备 1. 取1 2.5-1 3.5dpc孕鼠，断颈处死； 2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中； 3. 把平皿转入超净台； 4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）； 5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次； 6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）； 7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积； 8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置； 9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。 10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）； 11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养； 12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。 饲养层细胞（Feeder）的制备 注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem） 1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）； 2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）； 3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止； 4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）； 24. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。 ES细胞培养基 DMEM+15%FBS
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001