for a PDF version of this protocol click here
cDNA/AFLP
A tool for transcriptome analysis
12th June 2002
CWB BACHEM
1.RNA Isolation
1.1.Plant tissue material is harvested and immediately frozen in liquid N
2. The material is
then ground to a fine powder in a pre-cooled pestle and mortar under liquid N2. (This material can be stored at -80°C indefinitely). To proceed with extraction, transfer around 1g of powdered material into pre-cooled 50 ml plastic tubes (usually around 5 ml volume).
1.2.Transfer 10 ml of a hot (80°C) 1:1 mixture of RNA extraction buffer and phenol (base
volume: 5 ml) into the tube containing plant material. Be sure that no liquid N2
remains in the sample when adding the extraction buffer. Vortex or manually shake the samples vigorously for at least 30 seconds.
1.3.To the mixture add a base volume of chloroform (5 ml) and shake vigorously. To
separate the phases, centrifuge the samples for 20 minutes (3500 rpm in a large swing-
out rotor). Repeat chloroform extraction with one base volume (5ml) until no inter-phase can be detected (at least twice).
1.4.Transfer resultant cleared aqueous phase to a new 50 ml tube (ca. 5.5 ml; this material
can be stored frozen for 24 h). Add 1/3 volume of ice cold 8M LiCl and precipitate for at least 3 h at 0°C (or over night). Centrifuge RNA at 0°C for 20 minutes (3500 rpm) and resuspend in 500 μl H2O after extensive washing of the pellet with 75% Ethanol (ice cold). Take a small aliquot of this sample or determine concentration, integrity and purity of the RNA (1μl for agarose gel and 1μl for spectrophotometer).
1.5.Precipitate RNA in 2 volumes 96% Ethanol in the presence of 1/10 volume 3 M Na
Acetate pH 5.3 for 1h and centrifuge. Resuspend the RNA pellet thoroughly in H2O (heat for 5 minutes at 65°C to help resuspension if necessary) to obtain a 1 μg/μl RNA solution.
2.Bead preparation (poly d[T]25V beads)(Dynabeads M-280 streptavidin, Dynal Biotech)
https://www.doczj.com/doc/5f12792621.html,e 0.5 mg (50 μl) of bead suspension per 50 μg total-RNA. Wash the beads twice in an
equal volume of STEX buffer. Resuspend the beads in 2 vol. of 2x-STEX buffer (100 μl).
2.2.Add 2 vol (100 μl) of biotinylated d[T]25V oligonucleotide (Oligo00) [10ng/μl] (20 ng
oligo00/μl beads). 1 mg of streptavidine beads binds 200 pM of biotinylated d[T]25V oligonucleotide (Oligo00) thus, 2000 ng of Oligo00 gives 1.5 excess. Incubate at room temperature for 30’.
2.3.Wash the beads three times with 2 vol of STEX buffer (100 μl) to eliminate unbound
Oligo0. After the last wash, resuspend beads in 1 vol (50 μl) of 2x-STEX buffer.
3.1Poly-A+RNA enrichment and cDNA synthesis
3.3.Take 50 μg of total RNA [1 μg/μl] and add to the 50 μl beads prepared previously.
Incubate at room temperature for 10’and subsequently on ice for 5’.
3.4.Wash bead / RNA mixture 3 times in STEX buffer (100 μl). Eliminate all traces of
STEX buffer by centrifugation after the last wash. Finally, resuspend the beads in 20 μl of H2O.
3.5.Incubate beads at 65°C for 5 min and immediately place in MPC and transfer the 20μl
poly-A+ solution into a new tube. (Usually < 20 μl). (Alternatively, two elutions with 10 μl H2O at 65oC can be done instead).
1Poly-A+ RNA isolation is not required for the procedure, especially when isolating RNA from small amounts of tissue. However, when total RNA is used for template preparation, DNaseI treatment is required.
3.6.Prepare the following first strand cDNA synthesis reaction mix:
20.00 μl Poly A+ RNA
1.00 μl primer d[T]25V (from 100 ng/μl stock)
6.00 μl 5 x cDNA I buffer (Superscript II buffer)
1.00 μl dNTPs (25 mM)
1.00 μl Reverse transcriptase (200 U, Invitrogen SuperScript II)
2.00 μl DTT (100 mM)
----------
31.00 μl Incubate for 1 h at 42°C
3.7.To the first strand mix add the following:
15.00 μl 10 x cDNA II buffer
3.50 μl DNA Polymerase I (10U/μl) (Invitrogen)
1.50 μl RNase H (2U/μl) (Invitrogen)
1.00 μl dNTPs (25 mM)
98.00 μl H2O
----------
150.00 μl Incubate for 2 h at 16°C.
https://www.doczj.com/doc/5f12792621.html,e a 5μl aliquot of this sample and check on an agarose gel: a clear DNA-smear
between 500-4000 bp should be visible (see figure). Phenol-Chloroform extract the rest of the cDNA sample (145μl) and precipitate with 0.6 vol. isopropanol.
3.9.Resuspend the cDNA in 40μl H2O. Half this amount can then be used for template
preparation and half stored for future use.
Single and double stranded cDNA;
4.Template preparation
4.3.Mix the following restriction digests:
20.00 μl cDNA
1.00 μl Enzyme (1) – Taq I (10U)
8.00 μl R/L buffer (5 x)
11.00 μl H2O
----------
40.00 μl
Incubate at the temperature appropriate for the Enzyme (1) for 1 h. (65°C).
4.4.To the first digest mix add the following:
1.00 μl R/L buffer (5 x)
2.00 μl Enzyme (2) - Ase I (10U)
7.00 μl H2O (add 10 μl / tube)
----------
50.00 μl Incubate at 37°C for 1 h.
4.5.Anchor (adapter) preparation: Take 25 μg of the top strand oligo (61) and 22 μg of the
bottom strand oligo (62) (1 μg/μl stocks) and increase volume to 100 μl H2O. This gives
a 50 pM stock of Taq I anchor.
Oligo61(T-top)/Oligo62 (T-bottom) 5’-GACGATGAGTCCTGAC
TACTCAGGACTGGC- 5’ Take 2.6 μg of the top strand oligo (41) and 2.0 μg of the bottom strand oligo (42) (1μg/μl stocks) and increase volume to 100 μl H2O. This gives a 5 pM stock of Ase I anchor.
Oligo41(A-top)/Oligo42 (A-bottom) 5’-CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGAT- 5’
4.6.For the ligation of the anchors add the following:
1.00 μl anchor (1) (50 pM: Taq I)
1.00 μl anchor (2) (5 pM: Ase I)
1.00 μl 10 mM ATP
0.50 μl 1,4 All buffer (10 x)
1.00 μl T4 DNA ligase (1U/μl)
0.50 μl H2O (add 5 μl / tube)
--------
55.00 μl Incubate for 2 h at 37°C.
The ligation product is termed primary template and is used directly for pre-amplification.
5.Pre-amplification of the template
10.00 μl 10 x dilution Primary template
1.00 μl Primer 1 (oligo43/A00, 100 ng/μl stock)
1.00 μl Primer 2 (oligo63/T00, 100 ng/μl stock)
5.00 μl PCR buffer (10x Superbuffer, SphaeroQ)
0.50 μl dNTPs (25 mM)
0.25 μl Taq-Pol (SuperTaq 5U/μl)
32.25 μl
----------
50.00 μl
Cycle: [94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 60 sec] x 25 cycles
Check the products on an agarose gel and estimate the concentration. The material should appear as a smear between 50-700 bp (see Panel II below). There should be no visible smearing above 2 kb and no residue around the well (as in Panel I below). At this stage, products of abundant transcripts may be visible as prominent bands in the smear.
Dilute the material to a concentration of about 1ng/μl (usually 20 - 50 x dilution). This material (secondary template) is used as a template in the active PCR using the AFLP protocol (see Gel Sheet below).
Notes:
- Quality control for first-time users:
1) Check the total RNA for integrity and concentration (all samples). rRNAs should be clear and no
degradation products visible.
2) Check presence of poly A+ RNA on gel controlling size distribution and enrichment level (some
rRNA always remains).
3) Double stranded cDNA should show a size distribution between about 0.5 - 5KB with the bulk of the
smear around 1.5 KB. Some tissues produce prominent transcripts that appear as bands in the cDNA.
4) Complete restriction enzyme digestion can be monitored using control DNA.
5) Ligation of anchors (adaptors) can be best monitored by PCR of the primary template (ligation mix)
and should yield a strong smear between 600 bp - 50 bp.
- Apart from the total-RNA that should also be checked photospectrometrically, the assessment of the material can be done on agarose gel electrophoresis. Although these checks are a good idea in the beginning later, only an analysis of the "pre-amp" is necessary (the amplification of the primary template with primers lacking selective extensions).
- Another restriction enzyme pair (REP) commonly used with good results is Eco RI/Mse I. Data from our lab and others indicates that a wide range of REPs yield similar fingerprints in terms of quality and fragment numbers.
- To obtain just one TDF per transcript a restriction enzyme with a 5-bp recognition sequence can be used.
The protocol involves cutting with the 5-bp cutter and then capturing the 3’-ends of the cDNAs on magnetic beads. After elimination of the free 5’-fragments TDFs can be released from the beads with the frequent cutter. This method can also achieve a higher transcript visualisation level.
- Protocols for verification of band identity are available (see Ron van der Hulst or Bart Brugmans) and should be used where TDFs are to be isolated from gels.
- Very small quantities of RNA can be successfully used as a starting point for cDNA-AFLP. The amounts mentioned in the protocol should however be proportionally scaled down. Scaling down the procedure also allows the use of micro-titre pate (96 well) format making high throughput applications possible.
- All glassware, disposables and solutions that come into contact with RNA should be RNase free.
Autoclaving usually gives enough protection and DEPC treatment or use of RNase inhibitors is unnecessary.
6. Buffers:
– 2 x STEX (autoclave) 2.0 M NaCl
20.0 mM Tris-HCl
2.0 mM EDTA
0.2 % Triton X-100 pH 8.0
–RNA extraction buffer (autoclave) 100.0 mM Tris-HCl
100.0 mM LiCl
10.0 mM EDTA
1.0 % SDS pH 8.0
–10 x cDNA II buffer (use sterile components; filter sterilise) 200.0 mM Tris-HCl
750.0 mM KCl
100.0 mM (NH4)2SO4
50.0 mM MgCl2
10.0 mM DTT pH 7.5
–R/L buffer (x5) (10x)-“One-For-All” buffer 500 μl
BSA purified (10mg/ml) 25 μl
DTT (1M) 25 μl
μl
Milli-Q
450
7. Selective amplification with IRD 700 / 800 labelled primers
IRD 700
IRD 800
20x / 50x dilution secondary template 5.00 μl 5.00 μl Labelled-Primer 1 (Ase I (+2), 1 pmol /μl stock)
0.5 μl 0.6 μl Primer 2 (Taq I (+2), 50 ng/μl stock) 0.3 μl 0.3 μl 10x PCR buffer (Superbuffer, SphaeroQ) 1.0 μl 1.00 μl dNTPs (5 mM) 0.40 μl 0.40 μl
Taq-Pol (SuperTaq 5U/μl; SphaeroQ) 0.04 μl 0.04 μl H 2O 2.80 μl 2.70 μl ---------- ----------
10.00 μl
10.00 μl
Touch-down profile: (94oC, 30 sec; 65 – 56oC (decrease 0.7oC each cycle), 30 sec; 72oC, 60sec) x 12
Continue with :
(94oC, 30 sec; 56oC, 30 sec; 72oC, 60 sec) x 24
8. Protocol for preparing LI-COR gels (follow manufacturer’s instructions)
8.1. 6% Long Ranger gel (7M Urea/1.2x TBE):
252 g Urea
72 ml Long Ranger 50% gel solution 72 ml 10x TBE
Add distilled water to a target weigh of 675 g
Use 20 ml/gel (248 x 254 mm plates, 0.25 mm spacers). Polymerise with 150 μl 10% APS and 15 μl TEMED.
8.2. To the selective amplification product add an equal vol (10μl) of formamide loading
buffer (98% formamide, 10 mM EDTA pH8.0 and 0.1% Bromophenol blue). Vortex and
centrifuge for 3 minutes at 1000 rpm. Denature the samples by heating 5 minutes at 94°C. The samples are placed on ice until loaded.
8.3.Pre-warm the gel to 45°C. Load 0.5-0.8 μl sample.
9.Preparation of the IRD 700 / 800 labelled SEQUAMARK? 10 bp ladder
29 μl Milli Q
10 μl Circumvent polymerase buffer (10x, NEB)
48 μl dNTP/ddTTP mix (720μM ddTTP; 30μM dATP; 100μM dCTP; 100μM dGTP; 33μM dTTP)
5 μl Vent (exo-)DNA polymerase (NEB)
5 μl IRD700 or IRD800 primer (2 pmol/μl)
Subdivide in 4 PCR tubes
PCR: 94oC, 5 min.; [94oC, 30 sec; 56oC, 30 sec; 72oC, 30 sec] x 35 cycles; 72oC, 7 min
10.Selective amplification with radioactively labelled primers
20x / 50x dilution secondary template 5.00 μl
μl
* 0.25
+2)
Labelled-Primer 1 (Ase I
Primer 2 (Taq I (+2), 50 ng/μl stock) 0.3 μl
10x PCR buffer (Superbuffer, SphaeroQ) 1.0 μl
0.40
μl
mM)
(5
dNTPs
0.04
μl
5U/μl))
(SuperTaq
Taq-Pol
H2O 3.01 μl
----------
10.00 μl
Touch-down profile:
(94oC, 30 sec; 65 – 56oC (decrease 0.7oC each cycle), 30 sec; 72oC, 60sec) x 12 Continue with :
(94oC, 30 sec; 56oC, 30 sec; 72oC, 60 sec) x 24
* Labelling of the primer: 0.05 μl γ33P label (10μCi/μl γ33P-ATP)
ng/μl)
primer
(50
0.05
μl
T4 Kinase (10U/μl)
0.01
μl
T4 Kinase buffer
0.025
μl 10x
μl H2O
0.115
----------
0.25μl
Incubate for 60 min. at 37oC. Terminate the reaction by heating at 70oC for 10 min.
11.Protocol for preparing cDNA/AFLP polyacrylamide gels (BRL S2 system)
11.1.New glass plates are treated with 10 M NaOH to remove all dirt. The treatment is
completed when the liquid stays as a film on the glass, and does no longer break into droplets. The short glass plate is siliconized or treated with Rain-X.
11.2.Clean both glass plates tap water, brush and soap. Rinse thoroughly and dry with tissue.
Make sure that the water will stay as a film on long plate; the water should pearl on the short plate. When repeated cleaning with water and soap cannot achieve film or pearls respectively, then the NaOH or Rain-X treatment should be repeated. Clean with ethanol.
11.3.Put the spacers (thickness 0.4 mm) between the clean glass plates with the cushions
against the edge of the shorter glass plate. Attach the clamps. Place the comb with the teeth upward and test it is neither tight nor loose.
11.4.Seal both sides with yellow tape (Scotch electrical tape). Press the tape firmly on the
glass. Seal the bottom of the plates and make straight folds around the corners.
11.5.BRL S2 sequencing gels need approximately 80 ml of 5% polyacrilamide gel solution,
to which 400 μl of 10% APS (w/v) and 80μl of TEMED is added. Store monthly fresh made APS and TEMED in refrigerator. Gel solution from the refrigerator will not polymerise as fast as gel solution at room temperature. Crystallisation of Urea will re-
dissolve already after slightly increasing the temperature.
11.6.Pour the 5% acrylamide gel and place the comb (shark tooth) with the teeth upwards, to
create a straight `running` front. The depth of the placement of the comb will determine the sample volume that can be loaded. It is recommended to align the edge of the holes
in the comb with the edge of the glass (holes outside). Check the front, because irregularities will disturb the banding pattern. Put extra clamps to squeeze the comb between the glass, because the slightest amounts of acrylamide between glass and comb will remain as rubble in the wells.Allow the gel to polymerise for at least two hours.
Wrap the gel with Saran against drying in case of o/n polymerisation.
11.7.Remove the comb and rinse the glass with tap water to remove with a soft brush all
spilled acrylamide from of the glass and well. Mount the gel on the apparatus. Pre-run for approximately 1/2 hour with 1xTBE as running buffer. The 1x TBE buffer in the lower compartment is supplemented with 0.5 M NaAc, creating a salt gradient. This will slow down the small fragments in the lower part of the gel while improving the separation of the larger fragments in the upper part of the gel. This mimics a gradient gel electrophoresis.
11.8.After the pre-run rinse the well from acrylamide rubble and diffused Urea with a beam
of liquid (buffer) using a syringe. Place the comb with the teeth downwards (just on top of the gel surface; teeth just for 0.5 mm in the gel).
11.9. To the 10 μl active PCR product add 20 μl formamide dye (98% formamide, 10 mM
EDTA, 0.025% bromophenol blue and 0.025% xylene cyanol FF). Denature the samples with the formamide dye by heating them for 5 min. at 92oC. Place samples on ice and load 2 to 5 μl. Leakage from the end wells can be prevented by loading a counterweight of loading buffer in the adjacent wells.
11.10.Electrophoresis is performed at constant power of 80 Watt per gel to give a constant
heat development during running of the samples. The temperature should be 55oC. After
2.5 hours of running (The Bromophenol Blue is compressing at the bottom or just
running off. The Xylene Cyanol is at approx. 10 to 15 cm of the bottom) the run will be stopped and dismount the gel.
11.11.Remove the tape from both sides, and use a wedge to open the glass. The gel is
covered by a Whatmann 3MM paper and attached to the paper it is removed from the glass. The other side of the gel is covered with Saran Wrap. Work fast because the Whatmann will swell from water, which will cause rims in the paper during drying on a standard slab dryer at 80 C for two hours. Use several sheets of filter paper to keep the gel dryer support plate free from activity.
11.12.Place the dry gels are placed on X-ray films (Kodak X-omat LS); make marks on the
gel and film so that you will be able to align them afterwards, and developed after an appropriate exposure (1-3 days).
12.2Protocol for the isolation of amplified fragments from poly-acrylamide gels
12.1.Mark the film and the gel to orientate it while in the cassette. Develop the film normally.
12.2.Place the dried film onto the gel, lining up the orientation marks and identify the bands to
be isolated (usually done best by placing film and gel on a light box and pencil marking band positions on the Whatman paper. Cut out the band and monitor the activity.
12.3.Incubate in 200 μl TE buffer for 2h at room temperature. Use 5 μl for direct PCR using
same primers and conditions as in the pre-amplification.
Alternatively:
12.3.Cut out pieces of Whatman DE81 paper to the size of the gel fragments and insert both
into incisions in a 2% agarose gel. Electro-elute at 100 V for 15 min.
12.4.Take out DE81 paper and remove excess TEA buffer on Whatman 3MM (do not dry out).
Monitor activity on both gel fragment and DE81 paper - 90% of the activity should now be on the DEAE paper.
12.5.If necessary trim off excess paper and place in a 500 μl tube with a small hole punched in
the base. Insert tube into a 1.5 ml eppendorf tube. Spin off remaining TEA buffer and wash twice with 100 μl LSB.
12.6.Elute DNA with 50 μl HSB at R/T for 15 min (for fragments larger that 500 bp, heat to
56°C for 10 min). Spin down supernatant into a new eppendorf tube. Check activity on the remaining paper. If activity is left on the paper, repeat elution.
12.7.Precipitate the DNA with 2.5 volumes of ethanol.
2Since fragment isolation from PAGE can give rise to various artefacts, it is important to verify band identity using the appropriate protocols.
https://www.doczj.com/doc/5f12792621.html,ing the same PCR conditions and primers re-amplify fragment for ca. 25 cycles - more
cycles may be necessary for weak or small fragments.
12.9.The amplified fragment may be purified after separation on a 1.2% agarose gel or cloned
directly.
LSB Buffer 10.0 mM TRIS pH 7.5
1.0 mM EDTA
100.0 mM LiCl
HSB Buffer 10.0 mM TRIS pH 7.5
1.0 mM EDTA
1.0 M LiCl
20.0 % Ethanol
13.Ase I/Taq I PCR primers used for cDNA-AFLP
POLY D[T]25V, BIOTINYLATION AT 5' END
5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV
Total number of bases is: 26.
DNA sequence composition: 0 A; 0 C; 0 G; 25 T; 1 OTHER; Sequence name: OLIGO00
-----------------------------------------
TOP STRAND ADAPTOR - ASEI
5’- CTCGTAGACTGCGTACC
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 3 A; 6 C; 4 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO41/ A-Top
-----------------------------------------
ADAPTOR BOTTOM STRAND - ASEI
5’- TAGGTACGCAGTC
Total number of bases is: 13.
DNA sequence composition: 3 A; 3 C; 4 G; 3 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO42 / A-bottom
-----------------------------------------
ASEI - + 0
5’- CTCGTAGACTGCGTACCTAAT
Total number of bases is: 21.
DNA sequence composition: 5 A; 6 C; 4 G; 6 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO43 / A00
-----------------------------------------
ASEI, + 2 – AA
5’- GACTGCGTACCTAATAA
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 6 A; 4 C; 3 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO44 / A11
-----------------------------------------
5’- GACTGCGTACCTAATAC
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 5 A; 5 C; 3 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO45 / A12
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - AG
5’- GACTGCGTACCTAATAG
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 5 A; 4 C; 4 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO46 / A13
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - AT
5’- GACTGCGTACCTAATAT
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 5 A; 4 C; 3 G; 5 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO47 / A14
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - CA
5’- GACTGCGTACCTAATCA
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 5 A; 5 C; 3 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO48 / A15
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - CC
5’- GACTGCGTACCTAATCC
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 6 C; 3 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO49 /A16
-----------------------------------------
5’- GACTGCGTACCTAATCG
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 5 C; 4 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO50 / A17
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - CT
5’- GACTGCGTACCTAATCT
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 5 C; 3 G; 5 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO51 / A18
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - GA
5’- GACTGCGTACCTAATGA
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 5 A; 4 C; 4 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO52 / A19
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - GC
5’- GACTGCGTACCTAATGC
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 5 C; 4 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO53 / A20
-----------------------------------------
ASEI, + 2 – GG
5’- GACTGCGTACCTAATGG
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 4 C; 5 G; 4 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO54 / A21
-----------------------------------------
5’- GACTGCGTACCTAATGT
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 4 C; 4 G; 5 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO55 / A22
-----------------------------------------
ASEI, +2 - TA
5’- GACTGCGTACCTAATTA
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 5 A; 4 C; 3 G; 5 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO56 / A23
-----------------------------------------
ASEI, +2 - TC
5’- GACTGCGTACCTAATTC
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 5 C; 3 G; 5 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO57 / A24
-----------------------------------------
ASEI, +2 - TG
5’- GACTGCGTACCTAATTG
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 4 C; 4 G; 5 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO58 / A25
-----------------------------------------
ASEI, + 2 - TT
5’- GACTGCGTACCTAATTT
Total number of bases is: 17.
DNA sequence composition: 4 A; 4 C; 3 G; 6 T; 0 OTHER; Sequence name: OLIGO59 / A26
-----------------------------------------
对翻译中异化法与归化法的正确认识 班级：外语学院、075班 学号：074050143 姓名：张学美 摘要：运用异化与归化翻译方法,不仅是为了让读者了解作品的内容,也能让读者通过阅读译作,了解另一种全新的文化,因为进行文化交流才是翻译的根本任务。从文化的角度考虑,采用异化法与归化法,不仅能使译文更加完美,更能使不懂外语的人们通过阅读译文,了解另一种文化,促进各民族人们之间的交流与理解。翻译不仅是语言符号的转换,更是跨文化的交流。有时,从语言的角度所作出的译文可能远不及从文化的角度所作出的译文完美。本文从翻译策略的角度，分别从不同时期来说明人们对异化法与归化法的认识和运用。 关键词:文学翻译；翻译策略；异化；归化；辩证统一 一直以来,无论是在我国还是在西方,直译(literal translation)与意译(liberal translation)是两种在实践中运用最多,也是被讨论研究最多的方法。1995年,美籍意大利学者劳伦斯-韦努蒂(Lawrence Venuti)提出了归化(domestication)与异化(foreignization)之说,将有关直译与意译的争辩转向了对于归化与异化的思考。归化与异化之争是直译与意译之争的延伸,是两对不能等同的概念。直译和意译主要集中于语言层面,而异化和归化则突破语言的范畴,将视野扩展到语言、文化、思维、美学等更多更广阔的领域。 一、归化翻译法 Lawrwnce Venuti对归化的定义是,遵守译入语语言文化和当前的主流价值观,对原文采用保守的同化手段,使其迎合本土的典律,出版潮流和政治潮流。采用归化方法就是尽可能不去打扰读者,而让作者向读者靠拢(the translator leaves the reader in peace, as much as possible, and moves the author towards him)。归化翻译法的目的在于向读者传递原作的基本精神和语义内容,不在于语言形式或个别细节的一一再现。它的优点在于其流利通顺的语言易为读者所接受,译文不会对读者造成理解上的障碍,其缺点则是译作往往仅停留在内容、情节或主要精神意旨方面,而无法进入沉淀在语言内核的文化本质深处。 有时归化翻译法的采用也是出于一种不得已,翻译活动不是在真空中进行的,它受源语文化和译语文化两种不同文化语境的制约,还要考虑到两种文化之间的
蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
细胞周期检测（PI法） 一、实验方法原理 细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。 细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
Instruction Manual ProBond TM Purification System For purification of polyhistidine-containing recombinant proteins Catalog nos. K850-01, K851-01, K852-01, K853-01, K854-01, R801-01, R801-15 Version K 2 September2004 25-0006
ii
Table of Contents Kit Contents and Storage (iv) Accessory Products (vi) Introduction (1) Overview (1) Methods (2) Preparing Cell Lysates (2) Purification Procedure—Native Conditions (7) Purification Procedure—Denaturing Conditions (11) Purification Procedure—Hybrid Conditions (13) Troubleshooting (15) Appendix (17) Additional Protocols (17) Recipes (18) Frequently Asked Questions (21) References (22) Technical Service (23) iii
Kit Contents and Storage Types of Products This manual is supplied with the following products: Product Catalog No. ProBond? Purification System K850-01 ProBond? Purification System with Antibody with Anti-Xpress? Antibody K851-01 with Anti-myc-HRP Antibody K852-01 with Anti-His(C-term)-HRP Antibody K853-01 with Anti-V5-HRP Antibody K854-01 ProBond? Nickel-Chelating Resin (50 ml) R801-01 ProBond? Nickel Chelating Resin (150 ml) R801-15 ProBond?Purification System Components The ProBond? Purification System includes enough resin, reagents, and columns for six purifications. The components are listed below. See next page for resin specifications. Component Composition Quantity ProBond? Resin 50% slurry in 20% ethanol 12 ml 5X Native Purification Buffer 250 mM NaH2 PO4, pH 8.0 2.5 M NaCl 1 × 125 ml bottle Guanidinium Lysis Buffer 6 M Guanidine HCl 20 mM sodium phosphate, pH 7.8 500 mM NaCl 1 × 60 ml bottle Denaturing Binding Buffer 8 M Urea 20 mM sodium phosphate, pH 7.8 500 mM NaCl 2 × 125 ml bottles Denaturing Wash Buffer 8 M Urea 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 500 mM NaCl 2 × 125 ml bottles Denaturing Elution Buffer 8 M Urea 20 mM NaH2PO4, pH 4.0 500 mM NaCl 1 × 60 ml bottle 3 M Imidazole, 20 mM sodium phosphate, pH 6.0 500 mM NaCl 1 × 8 ml bottle Purification Columns 10 ml columns 6 Continued on next page iv
“异化”与“归化”之间的关系并评述 1、什么是归化与异化 归化”与“异化”是翻译中常面临的两种选择。钱锺书相应地称这两种情形叫“汉化”与“欧化”。A．归化 所谓“归化”（domestication 或target-language-orientedness），是指在翻译过程中尽可能用本民族的方式去表现外来的作品；归化翻译法旨在尽量减少译文中的异国情调，为目的语读者提供一种自然流畅的译文。Venuti 认为，归化法源于这一著名翻译论说，“尽量不干扰读者，请作者向读者靠近” 归化翻译法通常包含以下几个步骤：（1）谨慎地选择适合于归化翻译的文本；（2）有意识地采取一种自然流畅的目的语文体；（3）把译文调整成目的语篇体裁；（4）插入解释性资料；（5）删去原文中的实观材料；（6）调协译文和原文中的观念与特征。 B．“异化”（foreignization或source-language-orientedness）则相反，认为既然是翻译，就得译出外国的味儿。异化是根据既定的语法规则按字面意思将和源语文化紧密相连的短语或句子译成目标语。例如，将“九牛二虎之力”译为“the strength of nine bulls and two tigers”。异化能够很好地保留和传递原文的文化内涵，使译文具有异国情调，有利于各国文化的交流。但对于不熟悉源语及其文化的读者来说，存在一定的理解困难。随着各国文化交流愈来愈紧密，原先对于目标语读者很陌生的词句也会变得越来越普遍，即异化的程度会逐步降低。 Rome was not built in a day. 归化:冰冻三尺,非一日之寒. 异化:罗马不是一天建成的. 冰冻三尺,非一日之寒 异化:Rome was not built in a day. 归化:the thick ice is not formed in a day. 2、归化异化与直译意译 归化和异化，一个要求“接近读者”，一个要求“接近作者”，具有较强的界定性；相比之下，直译和意译则比较偏重“形式”上的自由与不自由。有的文中把归化等同于意译，异化等同于直译，这样做其实不够科学。归化和异化其实是在忠实地传达原作“说了什么”的基础之上，对是否尽可能展示原作是“怎么说”，是否最大限度地再现原作在语言文化上的特有风味上采取的不同态度。两对术语相比，归化和异化更多地是有关文化的问题，即是否要保持原作洋味的问题。 3、不同层面上的归化与异化 1、句式 翻译中“归化”表现在把原文的句式（syntactical structure）按照中文的习惯句式译出。
细胞周期的表示方法 1．圆形图法 D ）例：右图表示细胞有丝分裂一个细胞周期所用的时间,下列说法正确的是（ ①A→B的过程表示分裂间期②B→A的过程表示分裂期③A→A 可表示一个细胞周期④B→B可表示一个细胞周期 A．①②③B．①②④C．③D．④ 2．直线图法 例：右图所示，a～d表示连续分裂的两个细胞周期，下列叙述正确的是 （C） A．若此图中a、c时长相等，b、d时长相等，则a＋b和b＋c都可表示一 个细胞周期 B．对同一种生物的同一种细胞来说，a、c时长必相等，b、d时长必相等C．在有丝分 裂过程中，b、d时期发生过染色体数目暂时加倍的变化 D．a、c阶段完成后，细胞中染色体和DNA的数目都加倍 3．曲线图法 DNA含量变化的曲线。下列有关的叙 例1：下图表示人体内的细胞有丝分裂过程中每条染色体 述，正确的是（ D ） A.ef 时期的细胞都含有两个染色体组 B. 赤道板和纺锤体都出现于de时期 例2．在生命科学研究中，“放射性同位素示踪法”是经常使用的 研究方法，放射性同位素自显影技术被用于研 究细胞有丝分裂过程中DNA和RNA的变化。如图表示洋 葱根尖细胞处于有丝分裂各阶段中DNA和信使RNA含量 的变化。有关叙述错误的是(D) A．在放射性同位素标记研究中，为区别DNA和RNA，最 好选择标记的物质依次是胸腺嘧啶脱氧核苷酸、尿嘧啶核苷酸 B．处于分裂期的细胞中mRNA含量较低的最可能原因是分裂期细胞中的染色体高度螺旋化，不能解旋并转录成mRNA C．依据图示，细胞中核糖体活动旺盛的时期可能是a、cD．图中e 时期，细胞核内DNA和染色体的比例为2∶14．柱形图法 例：洋葱是生物学实验的常用材料之一，现有已经培养一段时 间后的洋葱根尖进行观察实验。观察根尖分生区，在统计的600个细胞中， 测定每个细胞的DNA含量，统计结果如图。 ⑴图示B、C、D中，处于S期的是 C ，处于G2和M期的 是D，处于G1B 。 ⑵若统计的600个细胞中，处于M期细胞的数目是30个，则 处于S期的细胞数是150 个，处于G2的细胞数是120个。 ⑶若该植物细胞的细胞周期为20小时，则该细胞完成分裂期和间期的时间分别是1小时 和19小时。
万方数据
万方数据
万方数据
万方数据
翻译的归化与异化 作者：熊启煦 作者单位：西南民族大学,四川,成都,610041 刊名： 西南民族大学学报（人文社科版） 英文刊名：JOURNAL OF SOUTHWEST UNIVERSITY FOR NATIONALITIES（HUMANITIES AND SOCIAL SCIENCE） 年，卷(期)：2005,26(8) 被引用次数：14次 参考文献(3条) 1.鲁迅且介亭杂文二集·题未定草 2.刘英凯归化--翻译的歧路 3.钱钟书林纾的翻译 引证文献(15条) 1.郭锋一小议英语翻译当中的信达雅[期刊论文]-青春岁月 2011(4) 2.许丽红论汉英语言中的文化差异与翻译策略[期刊论文]-考试周刊 2010(7) 3.王笑东浅谈汉英语言中的差异与翻译方法[期刊论文]-中国校外教育（理论） 2010(6) 4.王宁中西语言中的文化差异与翻译[期刊论文]-中国科技纵横 2010(12) 5.鲍勤.陈利平英语隐喻类型及翻译策略[期刊论文]-云南农业大学学报(社会科学版) 2010(2) 6.罗琴.宋海林浅谈汉英语言中的文化差异及翻译策略[期刊论文]-内江师范学院学报 2010(z2) 7.白蓝跨文化视野下文学作品的英译策略[期刊论文]-湖南社会科学 2009(5) 8.王梦颖探析汉英语言中的文化差异与翻译策略[期刊论文]-中国校外教育（理论） 2009(8) 9.常晖英汉成语跨文化翻译策略[期刊论文]-河北理工大学学报（社会科学版） 2009(1) 10.常晖对翻译文化建构的几点思考[期刊论文]-牡丹江师范学院学报（哲学社会科学版） 2009(4) 11.常晖认知——功能视角下隐喻的汉译策略[期刊论文]-外语与外语教学 2008(11) 12.赵勇刚汉英语言中的文化差异与翻译策略[期刊论文]-时代文学 2008(6) 13.常晖.胡渝镛从文化角度看文学作品的翻译[期刊论文]-重庆工学院学报(社会科学版) 2008(7) 14.曾凤英从文化认知的视角谈英语隐喻的翻译[期刊论文]-各界 2007(6) 15.罗琴.宋海林浅谈汉英语言中的文化差异及翻译策略[期刊论文]-内江师范学院学报 2010(z2) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/5f12792621.html,/Periodical_xnmzxyxb-zxshkxb200508090.aspx
细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂 活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大 量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周 期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步 化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺 嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成， 而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: TdＲ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S 期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易 产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、 氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常 用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成， 将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不 明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时 相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成G1/G0 期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析. 连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周 期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次 有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真 核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成 后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) , 又称D期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间 期(即G1→S→G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相 对而言M期最短，S期较长。流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管 中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单 细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中 单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出 其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞 仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放射性
翻译作业10 Nov 15 一、请按归化法(Domestication)翻译下列习语。 Kill two birds with one stone a wolf in sheep’s clothing strike while the iron is hot. go through fire and water add fuel to the flames / pour oil on the flames spring up like mushrooms every dog has his day keep one’s head above water live a dog’s life as poor as a church mouse a lucky dog an ass in a lion’s skin a wolf in sheep’s clothing Love me, love my dog. a lion in the way lick one’s boots as timid as a hare at a stone’s throw as stupid as a goose wet like a drown rat as dumb as an oyster lead a dog’s life talk horse One boy is a boy, two boys half a boy, and three boys nobody. Man proposes, God disposes. Cry up wine and sell vinegar (cry up, to praise; extol: to cry up one's profession) Once bitten, twice shy. An hour in the morning is worth two in the evening． New booms sweep clean. take French leave seek a hare in a hen’s nest have an old head on young shoulder Justice has long arms You can’t teach an old dog Rome was not built in a day. He that lives with cripples learns to limp. Everybody’s business is nobody’s business. The more you get, the more you want. 二、请按异化法(foreignization)翻译下列习语。 Kill two birds with one stone a wolf in sheep’s clothing
Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g
o a b c d e f 图1 o a b c d e f 图2 o a b c d e f 图3 o a b c d e f 图4 细胞周期 1．下表数据为实验测得体外培养的某种细胞的细胞周期各阶段时间（单位：小时） 周期 G 1 S G 2 M 合计 时长（h ） 10 7 3.5 1.5 22 根据上表及相关信息，以下说法错误的是 A ．在周期中，细胞核的消失与出现都发生在M 期 B ．在周期中，G 1期主要完成有丝分裂所需蛋白质的合成 C ．若在上述细胞的培养液中加入一定量的DNA 合成抑制剂，处于S 期的细胞会被抑制 D ．若在上述细胞的培养液中加入一定量DNA 合成抑制剂，加入后15小时，除原S 期细胞外其他细胞都被抑制在G 1、S 期交界处 2．若在肿瘤细胞培养液中加入用3 H 标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，短暂培养一段时间后，洗去3 H 标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。使在该段时间内已处于DNA 复制期不同阶段的全部细胞中DNA 被3H 标记，而当时处于其它时期的细胞则不带标记。不同时间取样做细胞放射性自显影，找出正处于有丝分裂的分裂期细胞，计算其中带3 H 标记的细胞占有丝分裂细胞的百分数。得到下图（图1～图4中横轴为时间，纵轴为带标记细胞占总细胞数的百分数），下列叙述错误的是 A ．图2中a 点开始检测到带3H 标记分裂期细胞，则o-a 为G 2期时间 B ．图2中b 点带3 H 标记分裂期细胞数开始达到最大值，则a-b 段表示分裂期时间 C ．图3中c 点时，带标记的细胞百分数开始下降，则a-c 段表示S 和分裂期时间 D ．ae 可表示一个完整的细胞周期时间 3．细胞周期包括分裂间期（分为G 1期、S 期和G 2期）和分裂期（M 期）。下图标注了甲动物（体细胞染色体数为12）肠上皮细胞的细胞周期各阶段的时长及DNA 含量。请回答下列问题： （1）若用含放射性同位素的胸苷（DNA 复制的原料之一）短期培养甲动物肠上皮细胞后，处于S 期的细胞都会被标记。洗脱含放射性同位素的胸苷，换用无放射性的新鲜培养液培养，定期检测。预计最快约________h 后会检测到被标记的M 期细胞。 （2）从被标记的M 期细胞开始出现到其所占M 期细胞总数的比例达到最大值时，所经历的时间为________期的时间，处于该期的一个细胞中染色体数目的变化情况是 。 （3）若向甲动物肠上皮细胞培养液中加入过量胸苷，处于S 期的细胞立刻被抑制，而处于其他时期的细胞不受影响。预计加入过量胸苷约________h 后，细胞都将停留在S 期。
制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。
细胞周期同步化常用的方法 在一般培养条件下，群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，常需采取一些方法使细胞处于细胞周期的同一时相，这就是细胞同步化技术。 细胞同步化的方法有选择同步化和诱导同步化，其中，选择同步化常用的方法有有丝分裂选择法和细胞沉降分离法。 选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成而不影响其他细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1/S期交界处；一些抑制微管聚合的药物，因抑制有丝分裂装置的形成和功能行使，可将细胞阻断在有丝分裂中期，即使细胞同步于M期。 一、M期同步化方法 1．振荡收集法 该法利用M期细胞变圆易脱落的特点，将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡，使M期细胞脱落，逐步收集培养基，并补充新的培养基。收集的细胞放4℃冰箱中保存，离心沉淀后即获得M期细胞。 2．秋水仙素阻抑法 （1）将细胞传代培养至指数生长期。 （2）加入秋水仙胺，使最终浓度为0.05－0.1μg/mL培养基，作用6－7 h。如使用秋水仙素，使用浓度应加大5～10倍。 （3）振荡收集细胞，800 r/min离心5－10 min，弃上清，收集的沉淀细胞即为M期细胞。加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中或直接进行离体实验。由于秋水仙素或秋水仙胺对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活，因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。 3．N2阻断法此方法较秋水仙素阻抑法好 （1）将细胞传代培养至指数生长期。 （2）将培养瓶置于N2罐中通入适量CO2（约相当于罐中体积的5％）。 （3）关闭好N2罐，接上N2管子及压力表，缓缓向罐中充气一直到压力为80-90磅/英寸2为止。 （4）将N2装置放在37℃培养箱中10－16 h（通常过夜）。次日从培养箱中取出，然后缓缓将N2放出（最好放出窗外）。 （5）取出细胞在镜下观察同步化效果，用振荡法收集细胞于离心管中。 （6）800 r/min离心10 min收集细胞。 二、S期同步化方法 胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法：该法利用过量TdR能阻碍DNA合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次TdR阻断法，即双阻断法。第1次阻断时间相当于G2、M 和G1期时间的总和或稍长，释放时间不短于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1/S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第2次阻断时间同第1次，再释放。 现以HeLa细胞为例加以说明（HeLa细胞周期时间为21 h，其中G1期为10 h，S期为7 h，G2期为3 h，M期为1 h）。 1．将细胞培养至指数生长期的早期。 2．加入含2 mmol/L TdR的培养基（2－2.5 mmol/L用于肿瘤细胞的同步化培养），作用16 h。3．弃掉TdR培养基，用Hanks液洗2－3次，再换上新鲜培养基继续温浴9 h。 4．重新加入TdR培养基（浓度同上）进行第2次阻断，作用16 h。 5．再弃掉TdR培养基，Hanks液洗2－3次后换上普通培养基。第2次TdR释放0 h时取样
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和
归化和异化这对翻译术语是由美国著名翻译理论学家劳伦斯韦努蒂（Lawrence Venuti）于1995年在《译者的隐身》中提出来的。 归化：是要把源语本土化，以目标语或译文读者为归宿，采取目标语读者所习惯的表达方式来传达原文的内容。归化翻译要求译者向目的语的读者靠拢，译者必须像本国作者那样说话，原作者要想和读者直接对话，译作必须变成地道的本国语言。归化翻译有助于读者更好地理解译文，增强译文的可读性和欣赏性。 异化：是“译者尽可能不去打扰作者，让读者向作者靠拢”。在翻译上就是迁就外来文化的语言特点，吸纳外语表达方式，要求译者向作者靠拢，采取相应于作者所使用的源语表达方式，来传达原文的内容，即以目的语文化为归宿。使用异化策略的目的在于考虑民族文化的差异性、保存和反映异域民族特征和语言风格特色，为译文读者保留异国情调。 作为两种翻译策略，归化和异化是对立统一，相辅相成的，绝对的归化和绝对的异化都是不存在的。在广告翻译实践中译者应根据具体的广告语言特点、广告的目的、源语和目的语语言特点、民族文化等恰当运用两种策略，已达到具体的、动态的统一。 归化、异化、意译、直译 从历史上看，异化和归化可以视为直译和意译的概念延伸，但又不完全等同于直译和意译。直译和意译所关注的核心问题是如何在语言层面处理形式和意义，而异化和归化则突破了语言因素的局限，将视野扩展到语言、文化和美学等因素。按韦努蒂（Venuti）的说法，归化法是“把原作者带入译入语文化”，而异化法则是“接受外语文本的语言及文化差异，把读者带入外国情景”。（Venuti，1995:20）由此可见，直译和意译主要是局限于语言层面的价值取向，异化和归化则是立足于文化大语境下的价值取向，两者之间的差异是显而易见的，不能混为一谈。 归化和异化并用互补、辩证统一 有些学者认为归化和异化，无论采取哪一种都必须坚持到底，不能将二者混淆使用。然而我们在实际的翻译中，是无法做到这么纯粹的。翻译要求我们忠实地再现原文作者的思想和风格，而这些都是带有浓厚的异国情调的，因此采用异化法是必然；同时译文又要考虑到读者的理解及原文的流畅，因此采用归化法也是必然。选取一个策略而完全排除另一种策略的做法是不可取的，也是不现实的。它们各有优势，也各有缺陷，因此顾此失彼不能达到最终翻译的目的。 我们在翻译中，始终面临着异化与归化的选择，通过选择使译文在接近读者和接近作者之间找一个“融会点”。这个“融会点”不是一成不变的“居中点”，它有时距离作者近些，有时距离读者近些，但无论接近哪