抑制AMPK活性对小鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及CytC、AIF表达的影响
研究生王展波
指导教师朱沂副教授
专业学科领域神经病学
研究方向脑血管病
2014年03月
The Effects of Inhibition of AMPK Activity on neuron apoptosis and expression of CytC,AIF after Cerebral Ischemia reperfusion Injury in Mice
ＡDissertation Submitted to
Xinjiang Medical University
In Partial Fullfillment of the Requirements
for the Degree of
Master of Medicine
By
Wang Zhanbo
Neurology
Dissertation Supervisor: Prof. Zhu Yi
March,2014
论文独创性说明
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目录
摘要……………………………………………………………………………………
1 ABSTRACT (2)
前言……………………………………………………………………………………
3研究内容与方法………………………………………………………………………
5
1.实验材料 (5)
1.1 主要仪器设备……………………………………………………………
5
1.2化学试剂和药品 (5)
1.3 主要试剂的配制…………………………………………………………
6
2 实验方法………………………………………………………………………
6
2.1 给药时间及方式 (6)
2.2短暂性MCAO模型制作………………………………………………
6
2.3神经功能缺损评分 (7)
2.4 脑梗死体积测定 (8)
2.5 脑组织标本的取材及切片的制备 (8)
2.5.1 灌注固定取脑……………………………………………………
8
2.5.2 脱水及冰冻切片的制备 (8)
2.6脑组织切片的苏木素-伊红染色………………………………………
6
2.7 免疫组化法检测CytC、AIF表达 (9)
3 统计方法 (9)
4 技术路线图 (10)
结果 (11)
讨论 (17)
小结 (31)
致谢 (32)
参考文献 (33)
综述 (38)
攻读硕士学位期间发表的学术论文 (48)
导师评阅表 (49)
抑制AMPK活性对小鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及CytC、AIF表达的影响
研究生：王展波导师：朱沂副教授/主任医师
摘要
目的:观察抑制AMPK活性对小鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及CytC、AIF表达的影响，探讨抑制AMPK活性的神经保护作用机制。方法: 采用雄性3月龄C57BL/6小鼠72只，按随机数字表法随机分成假手术组、盐水对照组及药物干预组，每组24只。后两组按线栓法建立短暂性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）小鼠动物模型，其中药物干预组小鼠插入线栓时即腹腔注射Compound C（20mg/kg），盐水对照组于同等时间给予等量的生理盐水。在小鼠脑缺血再灌注损伤24h时，采用Longa神经功能评分法评定各组小鼠的神经功能缺损评分，TTC染色法观察各组小鼠脑梗死体积大小，HE染色观察各组小鼠脑组织病理改变，免疫组化法观察各组小鼠CytC、AIF表达，TUNEL法观察各组小鼠神经细胞凋亡。结果:在小鼠脑缺血再灌注损伤后24h，与盐水对照组比较，（1）药物干预组脑梗死体积减小（P<0.01），神经功能缺损评分改善（P<0.05），皮质病理损伤减轻；（2）药物干预组皮质及海马神经细胞凋亡和CytC、AIF表达数均减少（P<0.05）。结论: 利用Compound C抑制AMPK活性，对小鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用。其机制与下调脑缺血再灌注损伤后CytC、AIF表达及减少神经细胞凋亡相关。
关键词：磷酸腺苷活化蛋白激酶；脑缺血再灌注损伤模型；细胞色素C；凋亡诱导因子；神经保护作用
The Effects of Inhibition of AMPK Activity on neuron apoptosis and expression of CytC,AIF after Cerebral Ischemia reperfusion Injury in Mice
Postgraduate:Wang Zhanbo Supervisor: Prof.ZhuYi
Abstract
Objective: To observe the effects of Compound C, an AMPK inhibition, on neuron apoptosis and expression of CytC,AIF after cerebral ischemia reperfusion injury in mice, to explore the neuroprotection mechanism of inhibiting AMPK activity. Methods:Seventy-two 3-month-old male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups(n=24):sham group, saline group and drug-treated group.Mice models of middle cerebral artery occlusion(MCAO)were established by insertion of a thread through internal carotid artery. AMPK inhibitor Compound C was injected intraperitoneally in the mice ischemia reperfusion therapy group when the thread was inserted, the same volume of saline was given ischemia reperfusion group at the same time.Twenty-four h after ischemia reperfusion,neurological deficits were observed by Longa method; infarct volumes were measured by TTC staining,the pathology variety was observed by HE staining,the expression of CytC and AIF was detected by immunohistochemistry,neuron apoptosis was observed by TUNEL.Result:Twenty-four h after ischemia reperfusion,compared with the saline group,(1)infarct volume and neurological deficits were both decreased in the drug-treated group (P<0.01,P<0.05,respectively),cortical pathological damage were reduced;(2)ischemia reperfusion drug-treated group cortex and hippocampus on neuron apoptosis and expression of CytC and AIF were reduced(P<0.05). Conclusion: Compound C could have neuroprotection effects in cerebral ischemia reperfusion mice by inhibition AMPK activity. Its mechanism may be related to inhibit CytC and AIF expression,reduce neuron apoptosis.
Key words: AMPK；Ischemia reperfusion；CytC；AIF；Neuroprotection
前言
依据我国第3次死因抽样调查报告，脑血管病已居于我国国民死因顺位的第一位[1]，也是首位成人致残的病因。WHO统计，我国脑血管病发病率的速度高达8.7%的年增长，比美国高一倍，脑血管病例每年新增加约130万，近100万人死亡，幸存者中约3/4的人遗留不同程度的肢体或语言功能障碍，部分病人丧失劳动能力和生活能力，给社会带来的经济损失高达400多亿元。另一项研究显示，全球脑卒中死亡的人中发展中国家占了近70％，而我国又占了发展中国家的40％，脑血管病已成为我国社会主要的疾病负担[2]。脑血管病给社会、家庭及患者带来沉重的经济负担及精神压力，因而寻求新的治疗理论及靶标意义重大。
脑血管病发生时，由于供应脑部的血管发生急性闭塞，导致葡萄糖、氧气等能量必须物质运输障碍，缺血区细胞外离子稳态破坏，大量谷氨酸释放及电压门控钙通道开放，引起兴奋性氨基酸毒性（excitatory amino acid,EAA），随后的再灌注过程中氧化应激反应和炎症反应及大量自由基产生的级联瀑布放大反应，启动细胞凋亡（poptosis），从而进一步加重缺血性脑损伤，随着时间的推移最终更大范围的不可逆的细胞死亡发生。脑缺血再灌注损伤的病理生理学机制目前尚未完全阐述清楚，能够确定的是多种病理生理学机制涉及其中，囊括了细胞凋亡在内的多种损伤机制[3]，并且这些损伤机制之间的级联和网络关系尚未明确，致使脑卒中后的神经保护异常艰难。
缺血性脑损伤首先发生的是局部脑血流量的缺乏，但最终决定缺血细胞命运的不仅仅是缺血，更重要的是脑缺血再灌注损伤后的缺血瀑布，即氧化应激、细胞凋亡等一系列级联瀑布放大反应。而缺血性脑损伤从形态及结构上可分为受损最为严重的缺血核心及核心周围较大范围的缺血半暗带，因此，其内神经细胞死亡的程度和分子机制也不尽完全相同。尽管缺血半暗带脑细胞的电活动消失，但其离子仍然保持平衡状态，脑细胞结构亦完整，随着脑血流的逐渐回流，缺血区的神经细胞功能最终有望恢复。凋亡是细胞的一种能量依赖性死亡方式，其主要发生在缺血缺氧性损伤造成的“缺血半暗带”，其发生的过程伴随众多基因转录和蛋白质的合成，在凝胶电泳上可见特征性的DNA阶梯，形态学特征主要表现为细胞核皱缩、细胞膜起泡、DNA碎裂及凋亡小体的形成。凋亡的发生及发展是一种受多个环节及多个过程调控的较为常见的病理生理学过程，而对凋亡过程中的各个环节进行有针对性的干预，及时“抢救”缺血半暗带的细胞，是缺血性脑损伤后神经细胞能否存活的关键步骤。
脑缺血发生时，各种不同的病理生理学机制相互交错，彼此促进，最终导致细
胞不可逆性的死亡，其分子机制涉及多条信号通路。研究显示，内源性凋亡通路是缺血性脑损伤后神经细胞凋亡的主要通路。其中，细胞色素C（Cytochrome c,CytC）及凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）是内源性凋亡通路的关键分子。CytC 是第一个被鉴定的线粒体促凋亡蛋白，对凋亡信号具有传导和放大作用，从而可对凋亡进行调控。CytC在生理情况时位于线粒体内膜的外侧，不能通过外膜，在线粒体呼吸链中传递电子，对线粒体能量代谢起到了重要的调节作用。而AIF是位于线粒体膜间隙的一种氧化还原酶，具有氧化还原酶及诱导细胞凋亡的重要特性。CytC 及AIF在受到缺血性脑损伤引起的谷氨酸受体过度激活、细胞内Ca2+超载、线粒体及DNA损伤等刺激时，线粒体膜通透性改变，其二者均漏出到细胞核内，诱导细胞凋亡，并且CytC能够诱导胱天蛋白酶（caspase）依赖性细胞凋亡，AIF诱导非caspase 依赖性细胞凋亡。研究显示，缺血性脑损伤后抑制CytC、AIF漏出，能够有效的抑制神经细胞凋亡。因此，CytC、AIF已成为脑缺血后的治疗性靶标。
磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-actives protein kinase,AMPK）作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的代谢和应激感受器[4]。AMPK蛋白激酶的主要功能是维持细胞的能量平衡，其活性受到等多种因素的调控，包括能量崩溃、缺血缺氧等情况，活化的AMPK能够通过各种途径增加ATP同时减少ATP消耗[5]。而缺血性脑损伤作为一种能量衰竭始发的能量代谢性疾病，研究调控AMPK活性对脑缺血再灌注损伤后的神经保护具有重要价值[6]。目前国内外仅有研究显示，调控AMPK 活性能够抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护作用[7]。然而，脑缺血再灌注损伤后，调控AMPK活性对神经细胞凋亡及CytC、AIF表达的研究国内外尚未见报道。
基于以上原因，本次研究通过对大量国内外相关文献的查阅，综合对比各种脑缺血动物模型，在参照Longa线栓法的基础上并对其进行了关键性的改进，成功复制小鼠脑缺血再灌注损伤模型。根据文献报道，我们应用AMPK特异性抑制剂Compound C（6-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazol-o[1,5-a]pyrimidine）直接抑制其活性，由于Compound C能够直接抑制磷酸化的AMPK水平，以及本实验室前期研究进行了对磷酸化的AMPK水平的检测，故在本次试验中，我们不再检测注射Compound C后24h时AMPK的水平。本次试验中，我们从多个水平研究调控AMPK蛋白激酶活性参与脑缺再灌注损伤后的神经保护作用机制，在整体水平上研究抑制AMPK活性对脑梗塞体积及神经功能缺损评分的影响，在细胞分子水平上研究抑制AMPK活性对神经细胞凋亡及CytC、AIF表达的影响，以期阐明利用外源性抑制剂抑制AMPK活性是否能够通过下调脑缺血后CytC、AIF表达，达到抑制细胞凋亡通路的效果，为脑缺血再灌注损伤后的治疗提供新的思路及方向。
研究内容与方法
1 实验材料
1.1 主要仪器设备
-20℃低温冰箱（青岛海尔公司）
4℃低温冰箱（青岛海尔公司）
-80℃低温冰箱（日本SANYO公司）
65℃电热三用水箱（北京市医疗设备厂）
pH检测仪（美国Thermo电子公司）
光学显微镜照相机（深圳市科视威光学仪器有限公司）
激光共聚焦显微镜（苏州梅曼激光设备有限公司）
计算机图像分析系统（日本奥林巴斯公司）
恒温培养箱（上海精宏设备有限公司）
冻存管（海门市天龙实验器材厂）
医用超净工作台（河北省石家庄奥祥医药机械有限公司）移动紫外消毒车（上海跃进医用光学）
电子天平（上海升徽电子有限公司）
超纯水设备（上海奥力原环境科技有限公司）
制冰机（广州夏之雪电器有限公司）
台式手术显微镜（成都科奥达光电技术有限公司）
显微手术器械（新疆维吾尔自治区人民医院提供）
硅胶线栓（北京沙东生物技术有限公司）
冰冻切片机（美国thermo公司）
微量移液器（日本NICHIRYO公司）
1.2 化学试剂和药品
Compound C （德国SIGMA公司）
MCAO栓线（北京沙东生物公司）
兔抗小鼠CytC 及AIF单克隆抗体（美国Abcam公司）
免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）DAB显色液（天津哈德逊生物技术有限责任公司）4%甲醛溶液（宜昌市银海化学试剂厂）
无水乙醇（青岛嘉华化工产品有限公司）
二甲苯（淄博丰仓化工有限公司）
多聚甲醛（上海联硕生物科技有限公司）
小牛血清白蛋白（北京联立信生物技术有限公司）
5%戊巴比妥钠（美国进口分装，湖北鸿运隆科技有限公司）TritonX-100 （北京索莱宝科技有限公司）
1.3 主要试剂的配制
（1）配制Compound C：25mg的Compound C溶于12.5mL蒸馏水中，摇匀即得2mg/mL溶液。
（2）DAB显色液：DAB底物浓缩液50.0μl，DAB底物缓冲液1.0ml，需现用现配，并且在暗室内配置。
（3）3%双氧水（即用即配制）：30%的双氧水3ml中加入27ml0.9%的生理盐水中配制而成。
（4）配制TTC：100ml生理盐水中溶入0.8g TTC粉剂，现用现配。
（5）配制梯度酒精：无水乙醇75mL内加入1‰DEPC去离子水25mL，使用玻璃棒混合均匀，即为75‰梯度酒精，依次类推，置入于-20℃冰箱保存备用。
（6）0.3%TritonX-100：用移液枪取0.3ml TritonX-100融入9.7ml PBS液体，注意防止起泡产生。
1.4 实验动物及分组
本次实验中，我们选用清洁级雄性健康C57BL/6小鼠72只，3月龄，体质量（25±3）g，由新疆实验动物研究中心提供（许可证号：SCXK新2003-0002）。饲养环境：动物房温度控制在20-22℃，相对湿度50-70%，日常饲以60Co照射消毒的小鼠颗粒全价饲料，饮用灭菌酸化水，光照为12 h明暗周期。按照随机数字表法对小鼠进行分组，共分为3组，即假手术组、盐水对照组与药物干预组，每组24只。每组中6只小鼠用于神经功能评分和TTC染色测量脑梗死体积，6只小鼠用于免疫组化检测CytC表达，6只小鼠用于免疫组化检测AIF表达，6只小鼠用于脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）染色法检测神经细胞凋亡情况。于小鼠尾巴上用记号笔标记分组情况。
2 实验方法
2.1 给药时间及方式
根据相关文献[8]，药物干预组在插入线栓时腹腔注射药物，即Compound C （6-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazol-o[1,5-a]pyrimidine,20mg/k g），该药物直接抑制磷酸化的AMPK水平；盐水对照组于同等时间给予腹腔注射等量生理盐水；假手术组仅分离颈部大血管，但不阻断血流，亦不插入线栓，更不给予药物即不注射Compound C。
2.2短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery
occlusion,tMCAO）模型的制作
采用改良的Longa[9]线栓法制作。选取静养1周，3月龄，电子天平调零称重，体质量（25±3）g的雄性健康C57BL/6小鼠，术前禁食8h，可以自由饮水。按小鼠体重计算给予相应量1.5%戊巴比妥钠腹腔注射，待小鼠麻醉成功后，以仰卧位将小鼠门齿及上下肢固定于手术台，注意将其舌头拉向一侧，防止堵塞气道而窒息死亡。小鼠颈部手术区域备皮，酒精常规消毒，从颈部正中线纵向剪开约2厘米，钝性分离皮肤及皮下组织等结构，暴露并分离右侧颈总动脉（common carotid artery,CCA）、颈外动脉（external carotid artery,ECA）与颈内动脉（internal carotid artery,ICA）。血管夹暂时小心夹闭ICA，以防止夹断ICA，在CCA近心端打一活结，电凝离断ECA。在ECA上剪一斜切口，将直径0.22mm的硅胶线栓从剪口处缓慢插入，松开ICA的血管夹，推进约10mm左右至感到有轻微阻力时停止进入。结扎线栓与血管，松开CCA活结并开始记录缺血时间，消毒并逐层缝合皮肤。阻断血流1h后，拔出线栓恢复血流，逐层缝合伤口，造模完成。假手术组仅分离CCA、ECA及ICA，但不插入线栓。整个手术过程中，采用白炽头灯使小鼠肛温控制在37±0.5℃（小鼠脑血管解剖及手术路径见图1），术后正常饮食水，单笼饲养。造模成功的标志：模型动物清醒后出现霍纳（Horner’s）氏征、提尾右前肢屈曲或者爬行向左侧转圈者。纳入标准：模型动物清醒后出现追尾现象及提尾时左前肢内收屈曲。排除标准：蛛网膜下腔出血、脑出血及死亡的小鼠，随机补充并保持每组24只。
在模型制作过程中，药物干预组1只小鼠因麻醉过量于再灌注24h内死亡，2只小鼠在取脑时发现脑出血；盐水对照组1只小鼠在取脑时发现脑出血，均予以排除。
图1 小鼠脑血管解剖及MCAO手术路径图
Fig.1 mice brain vascular anatomy and MCAO surgical roadmap
2.3神经功能缺损评分
按照Longa[7]评分法对小鼠脑缺血再灌注损伤后24h时的神经功能行为进行严格评分，标准如下：无神经功能损伤症状或体征者，评为0分；缺血对侧前肢内收者，提示轻度神经功能缺陷，评为1分；行走时向缺血对侧转圈者，提示中度神经功能缺陷，2分；行走时向缺血对侧倾倒者，提示重度神经功能缺损，评为3分；不能自
发行走或意识丧失或死亡者，评为4分。评分越高提示神经功能缺损越严重，评分为1～3分者为模型复制成功标准，评分0分、4分及出现癫痫发作、取材时发现脑出血或蛛网膜下腔出血者均剔除出组并随机补充，保证每组有24只小鼠。
2.4 脑梗死体积测定
神经功能缺损评分结束后，采用颈椎脱臼法迅速处死小鼠。于冰盒上快速断头取脑，-20℃冰箱冷冻10分钟，于距额极2毫米向后连续等距离切取5个冠状位脑片，间距为2mm。随后将脑组织切片放入1% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）磷酸盐缓冲液中，放入37℃恒温箱孵育染色30分钟。染色后可见正常脑组织染成深红色；而缺血侧脑组织则染为白色并且肿胀明显，梗死组织与非梗死组织边界清晰可见。生理盐水冲洗脑片3次，4%多聚甲醛中固定过夜。将固定好的脑组织取出按切片时顺序排列整齐，吸水纸吸取表面的甲醛溶液，数码相机拍照。采用Image pro plus6.0软件测量各脑区梗死面积及对侧非梗死面积。依据公式V=Σ（S1+S2）×d/2计算梗死灶体积。公式中V为总体积，S1和S2分别表示切片头侧和尾侧面积，d为切片厚度。
2.5 脑组织标本的取材及切片的制备
2.5.1 灌注固定取脑
小鼠脑缺血灌注损伤后24h时，电子天平调零称重，按小鼠体重计算给予相应量5%戊巴比妥钠腹腔注射，一次性深度麻醉小鼠后打开腹腔及胸腔，暴露心脏，再于右心耳上扎一小口，迅速将9号圆针头经左心室插至主动脉起始部，快速灌注生理盐水500ml冲洗至右心耳内流出液体清澈为止，接着再快速用4％多聚甲醛250ml 灌注。至小鼠四肢变硬，尾巴竖起，呈角弓反张，肝脏变硬发白，标志灌注成功，取出的脑组织较未灌注固定者更白更硬。于冰盒上迅速剪开头背部皮肤剪断颈髓，去除颅骨后小心的取出脑组织，同时务必注意避免因破坏硬脑膜而划伤脑组织，再并将脑组织置于4℃4％多聚甲醛中固定过夜。
2.5.2 脱水及冰冻切片的制备
将固定后的脑组织依次浸入20％、30％蔗糖液中脱水，两次均需见到脑组织沉底。取出脑组织，对其不需要的脑组织如低位脑干等部位进行切修，涂抹上一定量的耦合剂，待粘合稳固后置于-20℃冰冻切片机内，于海马区连续冠状位切片，片厚5μm，用毛笔小心将脑片扫入标记过的冻存管中，置于-80℃冰箱保存备用。
2.6脑组织切片的苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色
选取不同组脑片标本各6张进行实验。于-80℃冻存管中用毛笔将脑片小心取出，放入6孔板，并标记，待30分钟后脑片达到室温后PBS洗5分钟×5次，苏木素滴入并完全侵没脑片，染色1分钟，再PBS洗5分钟×3次，贴于载玻片上，于1%盐酸酒精分化，40-60℃温水反蓝，依次分别梯度酒精脱水，梯度酒精的浓度依次为
75％、80％、95％、100％、100％，浸泡时间依次递减，二甲苯透明半分钟，中性树胶封片，尽量使脑片在一完整的盖玻片下，避免形成气泡影响切片的观察，光镜下观察小鼠大脑皮质组织结构及细胞形态的变化。
2.7免疫组化法检测CytC、AIF表达
MCAO模型制作成功后，每组分别随机选取6只小鼠用于免疫组化法检测CytC、AIF表达。脑组织灌注固定取材切片同前。于-80℃冻存管中用毛笔将脑片小心取出，放入6孔板，PBS洗5分钟×3次，3%H2O2避光封闭15分钟，再PBS洗5分钟×3次，加入现配制的3%小牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；用0.3%TritonX-100-HCL配制，pH值7.5）室温孵育40分钟，分别滴加一抗（1：200稀释的小鼠CytC单克隆抗体，货号ab13575；1：300稀释的兔AIF单克隆抗体，货号ab32516）至淹没脑片，4℃冰箱湿盒过夜，PBS洗5分钟×5次，加二抗室温孵育1h，PBS洗5分钟×5次，二氨基联苯胺（DAB）显色，在PBS洗5分钟×3次，贴片，1%盐酸酒精分化30秒，40-50℃温水反蓝，梯度酒精依次脱水，二甲苯透明，滴中性树胶，盖玻片封片，光学显微镜采集图片。每只小鼠随机选取缺血侧大脑皮质及海马区5个高倍视野（×400），应用Image pro plus 5.0 软件计数小鼠脑组织皮质及海马区CytC和AIF阳性细胞，取其平均值作为最终结果。
2.8 TUNEL法检测神经细胞凋亡
每组6只小鼠，应用TUNEL染色法法检测神经细胞凋亡情况。脑组织取材同前，将固定脱水后的脑组织前卤后2-5mm之间连续冠状切片，片厚5μm，附于多聚赖氨酸包被的载玻片备用。严格按照TUNEL试剂盒和二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒说明书进行试验操作，染色体浓聚、细胞核变形或破碎染色呈棕黄色或深棕色、核膜完整、胞质染色阴性者为凋亡细胞，高倍镜（×400）下每片选10个独立阳性视野，大脑皮质和海马各5个，计数阳性细胞数，重复3次取平均值。
3 统计方法
全部资料采用SPSS18.0统计软件包进行处理。计量资料以均数±标准差（±）表示，多组间比较采用单因素方差分析，各组计量资料用均值±标准差表示，组间进一步两两比较采用LSD法。P＜0.05为有统计学意义。
4 技术路线图
结果
1 各组实验小鼠神经功能缺损评分比较
在各组小鼠脑缺血再灌注损伤24h后，应用Longa神经功能评分法观察神经功能缺损情况。假手术组小鼠没有出现神经功能缺损症状，偶见右侧眼睑下垂，四肢活动正常，提起小鼠尾巴时四肢无任何活动障碍，评分分值为0；盐水对照组小鼠可见明显神经功能缺损症状，小鼠出现霍纳（Horner’s）氏征，即缺血侧眼裂变小，瞳孔缩小，眼球内陷，运动障碍，活动减少，缺血对侧前肢无力及行走时身体向缺血对侧旋转，甚至向缺血对侧跌倒或不能行走，提尾时缺血对侧前肢屈曲，评分分值为（2.10±0.24）分；药物干预组小鼠的神经功能缺损症状轻微，表现为不能充分伸展缺血对侧前爪或爬行过程中向缺血对侧歪斜，评分分值为（1.58±0.22）分。与盐水对照组比较，药物干预组小鼠的神经功能缺损评分改善，具有统计学意义（P＜0.05）（见图2及表1）。
2各组小鼠脑梗死体积对比
假手术组小鼠脑组织全部红染，未见明显肿胀，组织结构清晰，无肉眼可见梗死灶；盐水对照组及药物干预组小鼠可见手术侧脑组织出现大片白色梗死灶，脑组织肿胀明显，主要包括皮质、海马和部分中脑（图3），经软件计算脑梗死体积比分别为（43.10±11.50）%与（24.84±12.53）%。与盐水对照组相比，药物干预组小鼠脑梗死体积减小（P﹤0.01）（见图3及表2）。
图2 各组小鼠神经功能缺损评分比较
Fig.2 Comparison of the neurological deficits between each group of mice (Mean±SD)
表1各组实验小鼠神经功能缺损评分比较（±，分）Table 1 Comparison of the neurological deficits between each group of mice (Mean±SD)
分组神经功能缺损评分（分）
假手术组0
盐水对照组 2.10±0.24
药物干预组 1.58±0.22*
F值9.823
P值0.007
注：*与盐水对照组相比P<0.05
注：*与盐水对照组相比P<0.01
图3 各组小鼠脑组织TTC染色及脑梗死体积比较
Fig.3 Comparison of the infarct volumes between each group of mice (Mean±SD)
表2 各组小鼠脑梗死体积比较（±，%）
Table 2 Comparison of the infarct volumes between each group of mice
分组脑梗死体积比（梗死体积/对侧非梗死体积）
假手术组0
盐水对照组43.10±11.50
药物干预组24.84±12.53*
F值 5.650
P值0.045
注：*与盐水对照组相比P<0.01
3 各组实验小鼠脑皮质病理学改变
各组小鼠梗死侧大脑皮质HE染色。假手术组小鼠脑组织结构正常，排列整齐，
细胞形态正常，偶见坏死及凋亡细胞；盐水对照组小鼠皮质脑组织结构疏松，排列紊乱，细胞空泡样变性，胞浆颜色加深，可见较多神经细胞呈现三角形，部分细胞核固缩，细胞坏死或凋亡；药物干预组小鼠皮质脑组织结构较规整，细胞排列较整齐，与盐水对照组比较可见神经细胞坏死、凋亡及空泡样变性改善（见图4）。
图4 各组小鼠皮质HE染色（×400）
Fig.4 HE staining of the cortex in each group of mice(×400)
4 CytC免疫组化
CytC阳性细胞表现为胞浆染色，呈圆形深棕色。假手术组小鼠脑皮质及海马偶见或未见CytC阳性细胞表达，盐水对照组小鼠皮质（28.86±9.65个/HP）及海马区（13.33±2.75个/HP）深棕色的CytC阳性细胞数较假手术组增多（P<0.05）；药物干预组小鼠皮质（58.86±9.65个/HP）及海马区（43.33±3.79个/HP）CytC阳性细胞数较盐水对照组均减少（P<0.05）（见图5，图6）。
注：#，*与盐水对照组比较P <0.05
图5 各组小鼠皮质及海马CytC阳性细胞数比较
Fig.5 Comparison of the Cortex and hippocampus CytC positive cells between each group of mice
(Mean±SD)
图6 各组小鼠CytC免疫组化染色(×400倍)
A：假手术组（皮质）；B：盐水对照组（皮质）；C：药物干预组（皮质）；
D：假手术组（海马）；E：盐水对照组（海马）；F：药物干预组（海马）
Fig.6 Immunohistochemical staining CytC in each group of mice(×400)
5 AIF免疫组化
AIF阳性细胞表现为胞浆染色，呈深棕色。假手术组小鼠脑皮质及海马未见AIF 阳性细胞表达，盐水对照组小鼠脑皮质（46.70±3.45个/HP）及海马区（17.35±3.67个/HP）深棕色的阳性AIF细胞数较假手术组增多（P<0.05）；药物干预组小鼠大脑皮质（32.16±2.35个/HP）及海马区（13.17±3.91个/HP）阳性AIF细胞数较盐水对照组均减少（P<0.05）（见图7、图8）。
注：#，*与盐水对照组比较P <0.05
什么是脑缺血?脑的短暂性血液供应不足并出现症状就叫做短暂性脑缺血发作，是一种 常见的急性脑血管病。病人突然发病，类似脑出血或脑梗塞的表现，一般在24小时内完全 恢复正常，常使家人虚惊一场，但可以反复发作。短暂性脑缺血发作病人一般在1～5年内 可能发生脑梗塞。而脑梗塞的病人中的1/3～2/3曾经发生过短暂性脑缺血发作脑缺血 - 再 灌注也可造成脑功能严重受损。脑缺血时脑细胞生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一 定时间后再灌注，慢波持续并加重。颞叶组织内神经递质性氨基酸代谢发生明显变化，即兴 奋性氨基酸(谷氨酸和天门冬氨酸)随缺血 - 再灌注时间延长而逐渐降低，抑制性氨基酸(丙 氨酸、γ- 氨基丁酸、牛黄酸和甘氨酸)在缺血 - 再灌注早期明显升高。缺血再灌注损伤 时间越长，兴奋性递质含量越低，脑组织超微结构改变越明显：线粒体肿胀，有钙盐沉积， 并可见线粒体嵴断裂、核染色质凝集、内质网高度肿胀，结构明显破坏、星型细胞肿胀， Nissl 体完整性破坏、胶质细胞、血管内皮细胞肿胀，周围间隙增大并有淡红色水肿液、白质纤维 间隙疏松，血管内由微血栓、髓鞘分层变性，呈现不可逆损伤。 多数情况下，缺血后再灌注可使组织器官功能得到恢复，损伤的结构得到修复，患者病情好转康复；但有时缺血后再灌注．不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。这种在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤(ischemi-a-reperfusion injury)。 缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注，确能收到良好的治疗效果。但在一定条件下（取决于缺血时间）再灌注反而引起更加严重的后果。这不仅见于临床，而且也为不同种属（兔、大鼠、豚鼠、狗、猪等）的大量动物实验所证明。这是一种反常（paradox）现象，称之为再灌注损伤（reperfusion injury）。
关于脑缺血再灌注损伤机制及治疗 脑缺血再灌注损伤（CIRI）是一种复杂的病理、生理过程。它由多种机制共同参与，如炎性反应，钙离子超载，自由基的过度形成，兴奋性氨基酸的毒性作用等。各个环节，多种因素共同作用，促进CIRI后脑梗死灶的形成及神经功能的破坏。本文，我们将从CIRI发病机制及药物治疗两方面进行阐述。 标签：CIRI；发病机制；药物研究 脑血管疾病是中老年人常见的致残原因。缺血性脑血管病（ICVD），它在脑血管病中的发病概率最高。患者脑缺血持续一段时间后，虽然供血量恢复，但功能尚未恢复，且并发严重的脑机能障碍，称为CIRI。CIRI具有发病机制复杂，病因多样等特点。CIRI不仅危害患者生命及健康，还会给社会及患者家庭带来巨大的精神及经济负担。现今，该病尚缺乏有效的治疗药物[1，2]。故而，研究及探讨疾病的病因及药物治疗方法具有重要意义。本文将就此进行综述。 1疾病的发病机制 1.1自由基自由基损伤脑组织多发于缺血再灌注期[3]。①氧自由基氧自由基过多，可造成核酸、蛋白质及脂质的过氧化，破坏机体膜结构，增加膜结构的通透性，促进核酸断裂、线粒体变性及蛋白质降解。氧自由基过多，还可诱导RNA，DNA，氨基酸等物质交联，减低物质活性。缺血时，机体内源性的抗氧化系统常无显著改变，而脂质过氧化物将显著上升，致使机体氧化、过氧化失衡。再灌注时，产生大量氧自由基，促使脂质过氧化过程继续，加重细胞的损伤。②NO自由基它在CIRI发病中，具有神经保护作用及神经毒性。过量的NO自由基可与超氧阴离子结合，促进DNA氧化，抑制其修复，损伤线粒体，促进机体细胞凋亡。 1.2兴奋性氨基酸的毒性作用（EAA）EAA是重要的兴奋性神经递质[4，5]。脑缺血时，EAA对脑细胞产生毒性作用。EAA是CIRI的重要环节。EAA 包括天冬氨酸及谷氨酸等。脑缺血时，谷氨酸起主要作用。大量谷氨酸激活AMPA 谷氨酸受体，继而激活了磷脂酰肌醇（与Gq蛋白耦联）的信号转导系统，致使细胞的通透性改变，Cl-和Na+大量进入脑细胞，随之，水也被动性的进入细胞，造成脑水肿，最终诱导脑细胞凋亡。 1.3钙离子超载脑缺血时，脑细胞能量代谢障碍，细胞内缺乏ATP，钙离子泵功能失调，钙离子外流减低。谷氨酸大量释放，NMDA受体被激活，致使钙离子内流。细胞无氧代谢，使产H+增加，促进Na+内流，细胞内高浓度的Na+，激活Ca2+/ Na+交换蛋白，进一步加重钙离子内流。细胞内离子的不均衡分布，将破坏脑细胞防御体系[6，7]。①细胞内Ca2+浓度过高，Ca2+积聚于线粒体，损伤线粒体膜，抑制ATP的合成，继而导致能量合成障碍。②Ca2+可激活C和A2，促进磷脂分解，产生白三烯、前列腺素等，对脑细胞产生毒性作用。③Ca2+含量过高，使钙调蛋白含量增加，继而促进弹性蛋白酶、5-羟色胺释放，致使脑
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７，２７（４） ｍｉＲ－２８９与ＣａＭＫⅡ ｍＲＮＡ的ＣａＭＫⅡ ３＇非编码区的序列碱基配对，抑制了ＣａＭＫⅡ ｍＲＮＡ在运输过程中的表达。该抑制作用一直持续到在突触的神经刺激下ＲＩＳＣ组分在蛋白酶体作用下降解。ｍｉＲＮＡ还参与了树突棘发育过程的调控［１７］。一个特定的ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ－１３４，抑制了Ｌｉｍｋ１蛋白ｍＲＮＡ的表达；Ｌｉｍｋ蛋白可调控树突棘的发育，而ＦＭＲＰ的缺失导致树突棘形态异常，两者的关系目前未明。３． 问题与展望 一直以来，Ｘ脆性综合征的研究重点是了解ＦＭＲＰ的功能。在不同的发育时期、不同的细胞内位置，ＦＭＲＰ执行的功能是不同的。这主要由于与ＦＭＲＰ结合的蛋白质分子及ＲＮＡ分子的不同［６，１０］，其中包括非编码ＲＮＡ。这些非编码ＲＮＡ引起了越来越多研究者的重视，可以预计将有更多的与Ｘ脆性综合征及ＦＭＲＰ相关的非编码ＲＮＡ会被发现。非编码ＲＮＡ与ＦＭＲＰ相互作用机制的问题也有待解决，如ＲＭＲＰ与ｍｉＲＮＡ之间的关系，是ＦＭＲＰ利用ｍｉＲＮＡ作为指向靶ｍＲＮＡ的工具，还是ＦＭＲＰ作为ＲＩＳＣ的组分参与了ｍｉＲＮＡ的翻译抑制，抑或二者都有？另有研究表 明，非编码ＲＮＡ可调控蛋白质功能［２］，我们猜想是否存在能调控ＦＭＲＰ的非编码ＲＮＡ呢？这些问题的解决将加深我们对Ｘ脆性综合征发病机制的理解，进而找出基因治疗的方法。 参 考 文 献 ［１］Ｏ＇ｏｎｎｅｌｌ ＷＴ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２５： ３１５－３８［２］Ｃａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，２９： ７７－１０３［３］Ｈａｎｄａ Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００３，３１（２１）： ６２４３－６２４８［４］Ｖｅｒｄｅｌ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０３（３０）： ６７２－６７６［５］Ｊｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００４，６（１１）： １０４８－１０５３［６］Ｂａｇｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００５，６（５）： ３７６－３８７［７］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００３，１１２（３）： ３１７－３２７ ［８］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００５，２８０（３９）： ３３４０３－３３４１０［９］Ｇａｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００４，３２（８）： ２１２９－２１３７［１０］Ｚａｌｆａ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２００６，１６： ２６５－２６９［１１］Ｗａｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００２，２２： １０２３２－１０２４１［１２］Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００４，１１６（２）： ２８１－２９７ ［１３］Ｃａｕｄｙ ＡＡ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００２，１６（１９）： ２４９１－２４９６［１４］Ｉｓｈｉｚｕｋａ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００２，１６（１９）： ２４９７－２５０８［１５］Ｊｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，７（２）： １１３－１１７［１６］Ａｓｈｒａｆ ＳＩ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ，２００６，１２４（１）： １９１－２０５［１７］Ｓｃｈｒａｔｔ ＧＭ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４３９（７０７４）： ２８３－２８９ 文章编号： １０００－１３３６（２００７）０４－０３０７－０３ 阿尔茨海默病的脑神经元凋亡机制 杨小慧 戴雪伶 姜招峰１ （ 首都师范大学生命科学学院，北京 １０００３７；１ 北京联合大学应用文理学院，北京 １０００８３ ） 摘要 ：阿尔茨海默病（ＡＤ）是一种中枢神经系统退行性疾病，临床主要表现为认知功能障碍、行为异常及日常生活能力下降，主要神经病理改变有神经元变性、丢失引起的脑萎缩，细胞外的老年斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ，ＳＰ）和细胞内的神经元纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅ，ＮＦＴ）。细胞凋亡与ＡＤ有密切的关系，β淀粉样蛋白（Ａβ）在此过程中可能有重要的作用。近年来的研究还指出，细胞周期的异常可能是ＡＤ发生的较早期事件，这种异常的细胞周期也可导致细胞的凋亡，最终引发ＡＤ。该文介绍细胞周期异常和Ａβ介导的细胞凋亡机制作一综述。 关键词：阿尔茨海默病；细胞周期；细胞凋亡；Ａβ；神经元中图分类号：Ｑ５１ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种中老年常见的中枢神经系统病变，有三大病理特征：淀粉样斑块沉积（ＳＰ）、神经元纤维缠结（ＮＦＴ）和神经元大量丢失。本文重点讨论可能引发神经元丢失的机制。神经细胞的凋亡在神经退行性疾病中起着主导性的作用。神经细胞是一种长期存活、不可复原和已停 收稿日期：２００７－０３－０２ 北京市教委科技发展重点项目和北京市自然科学基金重点项目（ＫＺ２００３１１４１７０１５） 作者简介 ：杨小慧（１９８３－），男，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｘｈ８３８１７＠１６３．ｃｏｍ；戴雪伶（１９８２－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｌｄａｉ２００４＠１２６．ｃｏｍ；姜招峰（１９５６－），男，博士，教授，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｆｅｎｇ＠ｂｕｕ．ｃｏｍ．ｃｎ
第二十三讲缺血再灌注 损伤概论 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
第二十三章缺血－再灌注损伤 一、基本要求 1. 掌握自由基、活性氧、缺血－再灌注损伤、氧反常、钙反常、pH反常、钙超载、无复流现象和呼吸爆发的概念, 重点掌握缺血－再灌注损伤的发生机制。 2. 熟悉缺血－再灌注损伤的原因和条件, 熟悉缺血－再灌注损伤时机体的功能和代谢变化。 3. 了解防治缺血－再灌注损伤的病理生理基础。 二、知识点纲要 （一）缺血－再灌注损伤的概念 各种原因造成组织血液灌流量减少，可使细胞发生缺血性损伤。再灌注具有两重性，多数情况使缺血组织和器官的功能结构得以修复，患者病情得到控制。但是，部分患者或动物缺血后再灌注，不仅没使组织器官功能恢复，反而使缺血所致功能代谢障碍和结构破坏进一步加重，这种现象称为缺血－再灌注损伤。与之密切相关的概念，还有氧反常、钙反常和pH反常。缺血－再灌注损伤在不同种属和各种组织器官均可发生，具有普遍性。 ( 二 ) 缺血－再灌注损伤的原因和条件 再灌注损伤取决于缺血时间、侧支循环、需氧程度以及电解质浓度。 ( 三 ) 缺血－再灌注损伤的发生机制 1. 自由基的作用 (1) 自由基的概念、特性、类型、体内代谢和生物学意义 (熟悉和了解) (2) 缺血－再灌注时氧自由基生成增多的机制 (掌握) 1) 黄嘌呤氧化酶形成增多； 2) 中性粒细胞的呼吸爆发；3) 线粒体损伤，氧分子单电子还原增多；4) 儿茶酚胺增加，自氧化增强。 (2) 自由基的损伤作用(掌握) 1) 生物膜脂质过氧化增强导致①膜结构破坏──膜的液态性和流动性减弱，通透性增强；②抑制膜蛋白功能──离子泵失灵和细胞内信号传递障碍；③线粒体功能受损──ATP 生成减少。 2) 细胞内Ca2+超载源于自由基引起细胞膜通透性增强，膜上Na+-K+-ATP酶失活和线粒体功能障碍。 3) DNA 断裂和染色体畸变外面无组蛋白保护的线粒体DNA对氧化应激敏感。 4) 蛋白质变性和酶活性降低自由基可引起蛋白质分子肽链断裂，使酶的巯基氧化。 5) 诱导炎症介质产生自由基可导致脂质过氧化和胞内游离钙增加，激活磷脂酶，脂加氧酶及环加氧酶。 2. 钙超载 (1) .细胞内钙稳态调节 (熟悉和了解) (2) 再灌注时细胞内钙超载的机制 (掌握) 1) Na+－Ca2+交换异常；2) 细胞膜通透性增高；3) 线粒体功能障碍；4) 儿茶酚胺增多。 (3) 钙超载引起再灌注损伤的机制 (掌握)
·综 述· [收稿日期]2007-11-16;[修回日期]2008-01-03 [基金项目]河北省博士基金(06547008D -7);中国人事部留学人员科技活动项目择优资助基金(2007-17) [作者简介]赵雅宁(1974-),女,河北唐山人,华北煤炭医学院主管护师,医学硕士研究生,从事脑损伤与脑保护研究。 ＊通讯作者 ERK1/2信号通路与脑创伤后神经细胞凋亡的 研究新进展 赵雅宁(综述),高俊玲＊(审校) (华北煤炭医学院护理系,河北唐山063000) 【关键词】 信号传导;脑损伤;细胞凋亡;综述文献 【中图分类号】 R651.15 【文献标识码】 A 【文章编号】 1007-3205(2008)06-0953-03 细胞外信号调节激酶1/2(ex tracellular -sig nal regulated kinase ,ERK1/2)是广泛存在于真核细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属丝裂原活化蛋白激酶(mitogen -activated protein kinase ,M APK )家族成员。从信号转导角度看,活化后的E RK1/2作用于胞浆或胞核内的底物蛋白,引起特定蛋白的表达或活化,调控细胞的增殖、分化、凋亡等。关于ERK1/2信号通路与中枢神经系统疾病关系的研究,目前集中在脑缺血的资料,而在脑创伤方面尚处在起步阶段。研究显示,ERK1/2信号通路在脑创伤后的继发病理过程中发挥关键作用,有可能成为脑创伤后治疗的新靶点。本文对ERK1/2信号通路在脑创伤后神经细胞凋亡中的作用机制进行综述。 1 ERK1/2信号通路与脑创伤后的细胞凋亡 1994年,Wieloch 等[1]首次提出脑缺血损伤中有ERK1/2和其他M APK 活化。此后的10多年间,ERK1/2信号通路在中枢神经系统损伤中的作用逐渐为人们重视。大鼠脑缺血后ERK1/2迅速激活,抑制剂PD98059(2′-amino -3′-methoxy -flavo ne )预处理封闭ERK 磷酸化,可减少22h 后局部梗死面积的55%,且这种保护作用呈剂量依赖性[2]。Mo ri 等[3]应用控制性皮质冲击伤模型同时研究了体内和体外激活E RK1/2的表达情况,结果显示脑创伤后ERK1/2活性显著增高,抑制剂PD98059可明显减少神经细胞死亡数目,减小脑创 伤后7d 皮质的损伤体积,并改善了损伤后的神经 功能。这些研究都说明ERK1/2信号通路的活化与脑创伤后神经细胞凋亡密切相关。最近,Clausen [4]在闭合性脑创伤模型,应用激光共聚焦显微镜观测到损伤中心及周边区磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosph o ry lated ERK /2,p -ERK1/2)与末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记(terminal deo xy -nucleo tidy l transfe rase -media ted dUTP nick end labelling ,TUN EL )阳性细胞共同定位,这为脑创伤后ERK1/2通路活化可导致神经细胞凋亡提供了最为直观的证据。2 ER K1/2信号通路介导细胞凋亡的分子机制2.1 ERK1/2与内源性细胞凋亡通路:内源性细胞凋亡通路以线粒体通透性增加、细胞色素C (cy tochrome C ,Cy tc )释放、caspase -3激活为主要特征。离体的研究证实激活的E RK1/2信号通路中,细胞凋亡伴随线粒体跨膜电位和线粒体质量的降低,因此有学者认为E RK1/2活化是线粒体膜去极化、Cy tc 释放、caspase -3活化、细胞凋亡的必要前提条件。大鼠短暂性脑缺血损伤10m in ～3h 时间内,p -ERK1/2活性显著增高,与此同时,Cy tc 在胞浆中大量表达,免疫荧光法检测p -ERK1/2与Cy tc 共同定位同一神经细胞[5,6] 。陈万欣等[7] 的研究发现大鼠重度弥漫性脑创伤后,大脑皮质损伤中心p -ERK1/2呈明显持续激活状态,高峰表达持续至伤后24h ,重要的是研究者在相邻切片作了p -ERK1/2和caspase -3双重标记,发现p -ERK1/2的分布情况与caspase -3标记有很大程度的重叠性,且两者的阳性细胞形态出现极大的相似性,提示脑创伤后ERK1/2通路的激活参与了线粒体受损启动的内源性细胞凋亡通路。 近年来,ERK1/2通路与细胞凋亡的关系引起人们的广泛关注,但对E RK1/2介导细胞凋亡的机 · 953·第29卷第6期2008年11月 河北医科大学学报JO U RN A L O F H EBEI M EDICA L UN IV ERSIT Y V ol .29 N o .6 No v . 2008
脑缺血再灌注损伤治疗的研究进展 向军 同济大学医学院，上海（200433） E-mail: Chelsea_JX@https://www.doczj.com/doc/5f12619679.html, 摘要：缺血性脑血管是现代社会致死致残的最主要疾病之一，其治疗原则及时恢复缺血区的血液再灌注，而随之而来的再灌注损伤又成为一大难题。笔者对近年来脑缺血再灌注损伤的治疗研究综述如下。 关键词：脑缺血再灌注损伤；治疗；进展 缺血性脑血管病是现代社会致死、致残的最主要疾病之一，其治疗原则是及时的恢复缺血区的血液灌注。然而在某些情况下缺血后再灌注不仅没有使组织功能恢复，反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，这种现象即缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury），抑制再灌注损伤已成为缺血性中风治疗的重要环节。近年来针对脑缺血再灌注损伤的治疗研究取得一定成果，现将其综述如下。 1．自由基研究 自由基（free radical）是外层轨道上有单个不配对价电子的原子、原子团和分子的总称，其化学性质极为活波，可与各种细胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）发生反应，导致细胞功能障碍和结构破坏。在脑缺血再灌注时，机体的自由基产生和清除系统遭到破坏，导致大量自由基的存在，造成脑组织损伤和功能障碍。由于再灌注治疗窗十分短暂(仅1-3小时)，因此清除自由基应在再灌注前或者再灌注早期即开始。 自由基的清除主要靠自由基清除剂，包括酶性自由基清除剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、Prion蛋白（PrPc）等;低分子自由基清除剂，如维生素C、维生素E、谷胱甘肽等；其他如甘露醇、糖皮质激素等。 有研究表明，褪黑素（Melatonin MT）能够清除羟自由基、过氧亚氮阴离子、降低单线态氧毒性和自由基引起的脂质过氧化反应，是有效的自由基清除剂和间接抗氧化剂，具有较好的神经元保护作用[1-2]。Cesario等[3]通过体内外实验观察发现，褪黑素的减轻脑缺血再灌注损伤作用，还与其对胶质细胞的保护作用有关，且胶质细胞对治疗比神经元更敏感。别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过阻止次黄嘌领转化为黄嘌呤，进而阻断自由基的产生。Allport等[4]的实验证明别嘌呤醇能够减少大鼠脑缺血再灌注模型的梗死面积和比率，对脑缺血和再灌注引起的脑损伤都具有保护作用。EGB761是银杏叶提取物的标准制剂，其主要活性物质是24%黄酮苷和6%萜烯内酯，具有较好的抗氧化作用。A. Ur′?kov等[5]的实验证明EGB761能够抑制脑缺血再灌注时的脂质过氧化反应，减轻自由基氧化作用对大鼠前脑的损害。 2．钙超载研究 脑缺血再灌注时，ATP供应不足、N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体过渡兴奋介导与其偶联的钙通道开放、细胞膜通透性增大以及Na- Ca2＋交换异常等因素导致细胞内游离钙（[Ca2＋]i）浓度升高。细胞内钙超载一方面使血管收缩，进一步加重脑缺血缺氧；另一方面引起细胞结构和功能的破坏，导致细胞死亡。[Ca2＋]i浓度升高既是脑损伤的后果，同时又是
大鼠四血管阻断全脑缺血模型探讨 作者：blue_snowlotus 近年来，利用啮齿类动物复制全脑缺血模型，在缺血性脑损伤的研究中，特别是在海马缺血选择性易损性的研究等方面应用较为广泛。该模型的共同特点是缺血能暂时广泛的影响各个脑区，但病理改变多发生在选择性易损区域，这在治疗药物的开发研究上应用较多。我做的是大鼠四血管阻断法全脑缺血模型，因此在此主要探讨大鼠四血管阻断全脑缺血模型。 大鼠四血管阻断全脑缺血模型：即双侧椎动脉和双侧颈总动脉阻断，方法有很多，比较公认的是Pulsinelli法，适用于脑缺血的急性和慢性实验研究。该方法需要做两步手术，具体方法是：大鼠10%水合氯醛（300mg/kg,ip）麻醉后，俯卧位固定，在枕骨后切开皮肤，暴露第一颈椎两侧的翼小孔，用尖端直径为0.5mm的电凝器插入翼孔，烧灼双侧的椎动脉，造成永久性闭塞。待动物适应24h 后，在颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，用动脉夹夹闭阻断，10-15min后松开动脉夹可恢复血流，进行再灌注实验，以大脑皮层、纹状体和海马缺血最为明显。 模型制作的关键步骤是凝断双侧椎动脉，有些大鼠翼孔很小，电凝器根本插不进去，可以用牙科微型小磨钻，将翼孔扩大，直视下用电凝器凝断双侧椎动脉，用磨钻扩大翼孔也要注意，容易损伤椎动脉造成出血。另外，电凝针插入翼孔的角度也要掌握好，向外下（约于大鼠脊柱正中线呈50度角）插入翼孔，不然容易损伤脊髓。 高血糖可加重脑损伤，增加梗塞面积1.4倍，所以做手术前大鼠禁食12h.还可以防止麻醉过程中呕吐物窒息呼吸道。另外在实验过程中需注意控制脑温，因为脑温每降低10℃，大脑代谢率可降低50％。一般控制在37℃±0.3℃。 判断模型成功的标准很多，最客观的指标应该是多普勒血流检测仪，探头安置于右侧顶叶皮质，深度l mm，监测局部脑血流，一般夹闭颈总动脉后脑血流降低大于5O为模型成功。国内多用的指标是脑电图的检测，银制电极固定于前囟后，中线旁2mm，参考电极可置于对侧对称部位，夹闭颈总动脉30s后脑电图即有变化，逐渐变为等电位线，以脑电图变为等电位线为模型成功标准。另外还有行为学上的成功标准：1min后呼吸加快，动物无反应，意识丧失；翻正反射
缺血再灌注损伤机制及保护综述 脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科 710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIR)。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即 +脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体(包括NMDA 、AMPA和KA 2+2+2+受体)致使细胞膜上的Ca通道开放，引起Ca超载，高Ca可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和 2+DNA的损伤;Ca还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND 常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下: 1(基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
脑缺血再灌注损伤主要发病机制的研究进展 脑血管疾病是一种严重危害人类身体健康的疾病，其具有死亡率、致残率高和难以预见的特点，一直受到国内外医学界的广泛关注[1]。其中，缺血性脑损伤疾病占脑血管疾病的绝大部分，缺血后及时的恢复血流再灌注对于恢复缺血区脑组织血氧供应、维持受损脑组织的正常形态与功能具有重要的意义。但当脑组织缺血时间较长时，再给予恢复血流再灌注的处理会进一步加重脑组织的损伤程度，此即为脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤的发病机制是一个快速的级联反应,这个级联反应包括许多环节[2]。主要环节有细胞内钙稳态失调、脑组织中氨基酸含量失稳态、自由基生成、炎症反应、凋亡基因激活及能量障碍等。这些机制彼此重叠,相互联系,形成恶性循环,最终引起细胞凋亡或坏死，导致缺血区脑组织不可逆的损伤[3]。 脑缺血早期，由于阻断血流使相关脑区能量（葡萄糖、O2、ATP等）迅速耗尽而导致能量危机，大脑神经元内钙离子超载，氧自由基增多以及兴奋性氨基酸的过度释放，引发了细胞内的毒性反应，引起神经元的过度凋亡和一系列的炎症反应；长时间的脑缺血恢复再灌注后，存活的脑组织中过氧化物堆积，可加剧脑组织损伤，在缺血区可见坏死、凋亡的细胞并伴随明显的炎症症状，引起脑组织坏死，且坏死区域会随着时间和空间扩大，进一步加重脑损伤程度[4]： 1.Ca2+超载与脑缺血再灌注损伤 钙离子参与细胞膜电位和细胞内的生化反应过程,对于维持神经细胞的正常功能起到关键性的调节作用[5],钙离子在脑缺血再灌注损伤的作用主要包括:（1）脑缺血再灌注后，细胞内Na+/Ca2+交换蛋白迅速激活，Na+向细胞外转运，同时将大量Ca2+转入细胞内，造成细胞内Ca2+超载,触发线粒体摄取Ca2+,使Ca2+聚集在线粒体内,过量的Ca2+可抑制ATP合成,使能量生成障碍；（2）Ca2+活化能激活线粒体上的磷脂酶, 促进膜磷脂分解产生对细胞有毒害作用的游离脂肪酸、前列腺素、白三烯和溶血磷脂等，改变其通透性,引起线粒体膜损伤。另外
Update Series l,2003,209 6 关长群,张玉忠,李爰娟,等.囊性肾癌的CT 诊断(附9例分析).中 国医学影像学杂志,1999,7(1):14 7 苑任,韩萍,史河水.囊性肾癌的CT 诊断.放射学实践,2001,16(6): 400 8 佐藤良延,大矢晃,高桥康之他.多房性囊泡状肾细胞癌の1例.临床 泌尿器科,1993,47(6):400 9 葛立,肖国文,何青.囊性肾癌1例.中华放射学杂志,1998,32(6): 431 10房世保,路晓东,王振虹.双侧囊性肾癌1例.中华放射学杂志, 1998,32(9):592 11陈宏伟,王德杭,夏晓,等.肾细胞癌边缘部CT 征象与病理对照研 究.临床放射学杂志,1999,18(6):354 12陈炽贤主编.实用放射学.北京:人民卫生出版社,2001,721 (2006211214收稿 2007201225修回) 急性脑缺血再灌注D W I 及P W I 的实验研究 刘国红1 李良顺1 周强1 刘阳1 游江林 2 【摘要】 目的:评价DW I 及P W I 判定急性脑梗死诊断及缺血半暗带的作用。材料和方法:40只S D 大鼠随机均分4组,A 组作假手术对照;B 、D 组分别栓塞2h 、6h,均再灌注2h 、24h;C 组栓塞2h 再灌注24h 、7d 。B 、C 、D 组于各自栓塞及再灌注时间点行DW I 、P W I 及常规序列扫描;后处理获得表观扩散系数(ADC )、脑血容量(C BV )、脑血流量(C BF )、平均通过时间(MTT )形态图。并将结果与四氮唑红(TT C )染色和病理作比较。结果:A 组DW I 、P W I 、TT C 染色及病理观察均无异常;B 、C 组栓塞时均可见右大脑中动脉供血区DW I 呈高信号,D 组异常信号区面积明显大于B 组,病理电镜表现为细胞内水肿。B 、D 组再灌注24h DW I 异常信号区面积与灌注前相比,B 组无明显变化,D 组较前增大;C 组再灌注 7d 6只大鼠DW I 见高信号,但ADC 图均正常。B 、D 组栓塞时右大脑中动脉供血区P W I 灌注缺损区面积相似。B 组P W I 异常信号面积大于DW I 异常信号区;D 组P W I 与DW I 异常信号面积无明显差别。结论:DW I 能灵敏反映急性期缺 血脑组织损伤情况,P W I 能灵敏反映组织血流灌注情况。DW I 、P W I 联合应用有可能判定缺血半暗带。关键词 急性脑缺血;灌注加权成像;扩散加权成像;缺血半暗带;再灌注;大鼠中国图书资料分类法分类号 R 445.2 D i ffusi on and Perfusi on M R I mag i n g of Acute Cerebra l Ischem i a w ith Reperfusi on: A Exper i m en t i n Ra ts L I U Guo 2hong,L I L iang 2shun,ZHOU Q iang,L I U Yang,YOU J iang 2lin (I m aging Cen ter ,Taizhou Puji Hospital,M ed 2ical College of Yang Z hou U niversity,Taizhou 225300) 【Abstract 】 Purpose:T o assess the value of DW I and P W I in evaluating penu mbra of acute cerebral ischem ia .M a ter i a ls and M ethods: A t otal of 40S D rats were random ly divided int o four gr oup s .Gr oup A was sha m 2operated for contr ol study,Gr oup B,D were occluded f or 2,6hours and reperfused for 2,24hours res pectively .Gr oup C was occluded f or 2hours and reperfused f or 24hours,7days .DW I,P W I,T1W I,T2W Iwere perf or med bef ore and 2,24hours,7days after reperfusi on .ADC,CBV,CBF,M TT t opographical map s were reconstruc 2ted at the work stati on .The outcomes of serialMR Iwere compared with TTC stain and pathol ogical findings .Results:I n gr oup A,neither abnor mal signal of DW I,P W I nor pathol ogical changes were f ound .I n gr oup B,C,D hyper 2intensity signal occurred on DW I in the territ ory of m iddle cerebral artery after occlusi on .The regi on of abnor mal signal intensity on DW Iwas larger in gr oup D when compared with gr oup B,which corres ponding intracellular ede ma revealed by electr on m icr oscopy .T wenty 2four hours after reperfusi on,the area of hyper 2intensity in DW I was same as that before occlusi on in gr oup B and larger in gr oup D.Seven days after reperfusi on in gr oup C,DW I showed abnor mal in six rats but AD C returned t o nor mal in all the 10cases .Perfusi on deficitmaintained on P W I both in gr oup B and D during occlusi on,but the area was larger than that of DW I in gr oup B and equal in gr oup D.Conclusi on:DW I can detect ischem ic lesi on sensitively and P W I can mo 2nit or he modyna m ics change sensitively,s o that combined DW I and P W Imay define ische m ic penu mbra . Key words acute cerebral ische m ia;perfusi on 2weighted i m aging;diffusi on 2weighted i m aging;cerebral ische m ia reperfusi on;penu mbra;rats 作者单位 1.225300 泰州 扬州大学医学院附属普济医院影像中心 2.221000 徐州 徐州医学院附属医院影像科 脑梗死是常见病、多发病。目前对急性脑梗死的 治疗主要采用溶栓治疗使栓塞的脑供血动脉再通,使
[论文]缺血再灌注损伤机制及保护综述脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科 710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIR)。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即 +脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体(包括NMDA 、AMPA和KA 2+2+2+受体)致使细胞膜上的Ca通道开放，引起Ca超载，高Ca可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和 2+DNA的损伤;Ca还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND 常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下: 1(基因活化
脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到 72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2(兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3(自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为:? 作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。? 诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。? 促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4(热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的蛋白大家族，但研究的较多的是HSP70，有报道称CA1区神经细胞能表达大量的Hsp70mRNA，而
脑缺血损伤的病理生理机制 柳挺，尹金鹏 （南阳医学高等专科学校基础医学部） 【摘要】 缺血性脑血管病是临床常见病、多发病，50以上的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重负担。本文从缺血后脑内免疫反应、基因表达、血管活性因子等方面综述了缺血性脑血管病发生发展的病理生理机制，为临床防治缺血性脑血管病提供一定的理论依据。 【关键词】脑缺血；病理生理 高血压引起的脑小动脉硬化，高血脂引起的颈动脉和脑内动脉粥样硬化，高血糖引起的脑的微循环障碍，都可造成脑供血不足，导致脑缺血的发生与发展，使脑产生不同程度的病理损伤，使认知功能下降，痴呆产生。缺血性脑血管病一直是临床和基础研究的重要课题，多年来人们对脑缺血的病理生理进行了深入研究，并提出了多种学说为解释脑缺血机制奠定了基础。 1.脑组织病理学改变 脑缺血组织病理学的改变包括皮质萎缩、皮质和海马神经元变性、白质疏松、胶质细胞增生和毛细血管床的改变等。NiJW等[1]报道，双侧颈总动脉永久性结扎(2-vessel occlusion，2VO)后1个月，除部分大鼠皮质和纹状体有一些小梗死灶外，皮质和海马并无大体结构和光镜下神经元脱失改变；4个月时，可见海马CAI区神经元变性，伴胶质细胞活化；7个月后，可观察到明显的神经元脱失和广泛的变性和皮质萎缩。有报道认为[2]，神经元的脱失与细胞凋亡有关，白质的变化包括小胶质细胞和星形细胞增生活化，少突胶质细胞减少和白质疏松等。Bennett SA 等[3]用 Western印迹法观察到，永久性结扎大鼠双侧颈总动脉，术后25周，皮质和海马AB物质沉积增加，且与淀粉样前体蛋白(APP)由神经元向胞外转移有关，说明在无其他致病因子存在时，慢性脑缺血本身即可引发APP 裂解成AB片段，导致细胞外淀粉样蛋白沉积，从而产生一些类似老年性痴呆(Alzheimer disease,AD)的病理改变。 2. 与脑内免疫反应的关系 刘之荣等[4]研究了2VO模型对脑内免疫细胞活动的影响，结果表明，2个月缺血区内，小胶质细胞被广泛活化，形态多异，白细胞和T细胞大量入侵缺血区脑实质。这些细胞的活动以皮层明显；海马和白质次之；在血管周围和梗死区显著；在缺血区半暗带，这些细胞高度集聚，说明这些细胞的活动与慢性脑灌注不足致脑损害高度相关。李露斯等 [5]观察，2VO术后1个月，皮层、海马和白质有白细胞和T细胞的浸润；2～4月，浸润的白细胞和T细胞减少，认为慢性脑灌注不足，引起免疫细胞的活动，从而促进认知功能障碍的发生发展。 3. 脑缺血后基因表达[6] 灌注梯度不仅决定半暗带，还决定脑缺血后基因表达的方式，即灌注水平不同。基因表达的方式也不一样。分析原位杂交放射自显影法检测到的基因表达、放射自显影法LCBF及组织梗死三者之间的关系显示，缺血的程度决定基因表达的时间、空间分布运用DNA微对列技术，筛查了缺血后数千基因的表达方式。MCAO 2h，再灌注3h后，有两大类基因表达：已知受缺血缺氧调节的基因和最近认为可能与缺血缺氧有关的基因缺血缺氧反应性基因中，有28种表达上调，6种下调，包括有即早期基因、热体克蛋白(heat shock proteins．HSP)、抗氧化酶、营养因子及介导RNA代谢、炎症、细胞信号的基因。新的缺氧缺血相关基因中，