免疫球蛋白超家族成员I z u m o 是精卵融合的必要蛋白1
Naokazu Inoue, Masahito Ikawa, Ayako Isotani & Masaru Okabe 2
陈凌 译、江一平 校
作为构建人体的60万亿细胞的代表，精子和卵子相遇、互相识别并融合形成新一代生命。精卵膜融合即受精是非常重要的事件，人们长期致力于寻找与该事件相关的因子[1]。最近，已发现CD9是卵膜上与精卵融合相关的基本因子[2-4]，但精子方面与卵膜融合相关的因子尚未找到。本文报道，运用抑制融合的单克隆抗体[5]和基因克隆技术，我们找到了精子的融合相关抗原，并发现该抗原是免疫球蛋白超家族的一个新蛋白。我们将该基因命名为Izumo 并培育了该基因缺陷的小鼠品系。Izumo -/-小鼠是健康的，但其雄性不育。雄性的Izumo -/-小鼠能产生外观正常且能结合并穿透透明带的精子，但这些精子却不能与卵膜融合。人精子也含有Izumo ，而且抗人Izumo 抗体能阻止人精子与去透明带的金黄地鼠卵融合。 为了寻找人精子中与卵膜融合的关键因子，我们利用2-D 电泳分离小鼠精子粗提蛋白，然后用能特异性阻断精卵融合的抗精子单克隆抗体OBF13[5]进行免疫标识，分离到一种精子跨膜蛋白成分，我们以日语中的婚姻之神 “Izumo ”① 为之命名。通过液相串联质谱（LC-MS/MS ）分析发现，该蛋白中的10条短肽段与小鼠蛋白质数据库中一段名为RIKEN 的注册序列的部分肽段完全匹配（NCBI 登录号：XM_133424）。利用该注册序列设计引物，我们成功地利用RT-PCR 从小鼠睾丸总RNA 中分离到该蛋白的编码序列。同时，从人类基因组数据库中我们还查到了该蛋白的人类同源物的编码序列（NCBI 登录号：BC034769），该序列编码一种特殊的免疫球蛋白超家族（IgSF ），是一种I 型跨膜蛋白，其胞外部分为免疫球蛋白结构域，并可能含有一个糖基化位点（图1，a ，b ）。利用重组Izumo 蛋白制备的多克隆抗体进行免疫标识，我们发现，小鼠Izumo 蛋白大小为56.4KD ，并只在小鼠睾丸组织中表达（图1，c ），而人类Izumo 蛋白大小
1
Inoue N, Ikawa M, Isotani A, Okabe M. The immunoglobulin superfamily protein Izumo is
required for sperm to fuse with eggs. Nature 2005 Mar 10;434(7030):234-8.
2 Naokazu Inoue1, Masahito Ikawa2, Ayako Isotani1,
3 & Masaru Okabe1,2,3* 1.Genome Information Research Center, 2.Research Institute forMicrobial Diseases,3.Faculty of Pharmaceutical Sciences, Osaka University, Yamadaoka 3-1, Suita,Osaka 565-0871, Japan; *Correspondence and requests for materials should be addressed to M.O.(e-mail: okabe@gen-info.osaka-u.ac.jp). Sequences have been deposited with GenBank under accession numbers AB195681 for mouse Izumo, AB195682 for human Izumo and AB195683 for
rat Izumo.
图1. Izumo 基因的鉴定：a ，小鼠（上方）以及人类（下方）Izumo 的氨基酸序列的同源性比对，同源部分用星号表示，通过LC-MS/MS 确认的肽段用红色标记，橘红色、蓝色和绿色分别标记Izumo 的信号肽、跨膜结构域以及免疫球蛋白样结构域，短箭头表示参与形成二硫键的Cys 残基；b ，Izumo 是一类典型的I 型跨膜糖蛋白，具有一个免疫球蛋白样结构域以及一个N-糖基化位点（Asn204）；c ，Izumo 蛋白在睾丸组织中特异性表达，图为各种组织中Izumo 的免疫印记结构，从左到右依次为脑、心脏、胸腺、脾、肺、肝脏、肌肉、肾、卵巢、睾丸以及精子，可溶性蛋白的上样量为30μg/Lane ，用1μg/ml 的抗鼠Izumo 抗体检测。箭头所指为鼠Izumo 蛋白。d ，人类精子Izumo 蛋白的免疫印记，箭头所指为人类Izumo 蛋白。e ，利用精子顶体特异性表达EGFP 的转基因小鼠进行Izumo 的免疫染色，在顶体完整的精子中不能检测到Izumo 蛋白(顶体完整的精子其顶体部位有绿色荧光，为绿色箭头所示)，而只有在发生顶体反应后，才能检测到Izumo 蛋白（被抗鼠Izumo 多克隆抗体标记为红色，为白色箭头所示，此时顶体被破坏，绿色荧光消失）。f ，用抗人Izumo 多克隆抗体标记人类精子，发生顶体反应的精子能被抗体标记为红色（发生顶体反应的精子被CD-46抗体标记为绿色），但是同样的抗体不能标记顶体完整的精子（顶体完整的精子不能被CD-46着色）。Bar ＝10μm 。
则为37.2KD （图1，d ）。在完整精子的质膜上并不能检测到Izumo ，这与精卵融合过程发生于顶体反应之后而不是在射精之后的事实是相吻合的。无论是人类还是小鼠，在顶体反应之后，都能在精子表面检测到Izumo 蛋白（图1，e ，f ），这可能是因为Izumo 不是定位在完
整精子的质膜上，而是隐藏在质膜的下方，顶体反应后才通过某种途径暴露于精子表面。这与小鼠精子膜蛋白CD46的行为十分相似[6]。
为了分析Izumo 在体内的生理功能，我们设计基因打靶载体，利用同源重组技术将
Izumo 基因的2～10号外显子替换为Neo 基因（图2，a ），然后通过ES 细胞系（D3）制备出了Izumo 基因缺陷小鼠模型，利用Southern-blot 筛选鉴定中靶细胞及其生殖系传递小鼠（图2，b ），在纯合突变小鼠个体中未检测到Izumo 的mRNA 和Izumo 蛋白的表达（图2，c ，d ）。考虑到Izumo 基因的剔除有可能造成相关基因表达水平的升高或降低[7]，我们检测了ADAM2[8]、CD147[9]、sp56[10]等一些目前认为与精卵互作有关的基因的表达水平，结果表明在Izumo 基因缺陷小鼠中，这些基因的表达水平与野生型小鼠并无显著差异（图2，d ）。
F1代杂合子小鼠（Izumo+/-）自交，产生43只野生型小鼠（Izumo+/+）；92只杂合体小鼠（Izumo+/-）以及47只突变纯合体小鼠（Izumo-/-），符合孟德尔的基因分离规律。Izumo-/-小鼠身体健康，没有明显的发育异常，雌性Izumo-/-小鼠表现出正常的生育能力（图3，a ），而雄性Izumo-/-小鼠尽管能与雌性Izumo+/+小鼠发生正常的交配、射精行为以及形成阴栓，但却不能生育（图3，a ）。在观察到28次阴栓的情况下，9对Izumo-/-雄性小鼠连续饲养4个月也没有观察到妊娠；雄性Izumo+/-小鼠仍然表现出正常的生育能力（图3，a ）。目前对基因剔除小鼠的研究表明，至少有4个基因的剔除会造成雄性小鼠的不育，而这4个基因无一例外的都是通过破坏精子与透明带的结合能力从而造成雄性不育的，而且这些不育小鼠的精子活动能力受到影响，不能迁移至输卵管部位[7,8,11,12]。然而，我们的实验结果表明，Izumo 基因
图2. 小鼠Izumo 基因剔除。a ，野生型小鼠Izumo 基因结构、打靶载体以
及突变体基因结构，分别用垂直的柱状和水平的线条来表示外显子和内含子，Neo 基因由磷酸甘油酸激酶（PGK ）启动子启动表达，白喉毒素A 链由MC1启动表达（DT ）；b ，基因剔除结果的Southern-blot 分析，基因组DNA 样品经EcoR I 酶切，用3’端探针杂交检测出1.5kb （野生型）和6.9kb （突变型）片段；c ，野生（+/+）、杂合（+/-）以及突变纯合（-/-）雄性小鼠睾丸总RNA （20μg ）的Northern-blot 杂交分析，GAPDH 为阳性对照。d ，Western-blot 结果显示突变纯合（-/-）小鼠精子没有表达Izumo 蛋白，而野生（+/+）、杂合（+/-）型小鼠均有该蛋白的表达，突变纯合小鼠精子中的ADAM2、CD147以及SP56均正常表达。
图3. Izumo 基因缺陷导致小鼠雄性不育，a ， Izumo-/-、Izumo+/-雄性小鼠
及Izumo-/-雌性小鼠的生育力分析，下方数字为亲本的数量（交配数量），b 、c ，Izumo-/-及Izumo+/-精子的体外受精实验，Izumo-/-精子能够穿越透明带到达卵子质膜，但不能与卵子融合，从而聚集在透明带卵周隙中，而Izumo+/-精子则能与卵子发生融合，d ，上图：许多 Izumo-/-精子聚集在卵子的卵周隙中，下图：用精子特异性的单克隆抗体MN9对这些聚集的精子进行标记，结果显示这些位于卵周隙的精子已发生了顶体反应。e ，体外受精2h 、6h 后与单个卵子发生融合的平均精子个数，f ，与卵子发生融合的精子被Hoechst33342特异性标记，箭头所指为融合的精子。
的剔除并不妨碍精子迁移至输卵管壶腹部（结果未显示。精子的活动力用计算机软件分析 (CASA ；mean ±s.e.m.＝81.7±7.7% in Izumo+/- sperm and 77±8.9% in Izumo-/- sperm)，表明精子活动率并不降低）。Izumo-/-小鼠的不育特性通过体外受精实验证明（图3b 、c 和附件电影1），Izumo 基因对小鼠的受精过程的某一阶段发生影响，这一阶段毫无疑问是继精子穿过透明带之后，因为我们的实验结果表明小鼠大部分的精子都顺利通过了透明带，却大量聚集在卵子质膜外侧的卵周隙之中（图3 d ）。
通常，配子的融合分为两个阶段：首先是精卵质膜的结合，然后才是二者的真正融合。不论是Izumo+/-还是Izumo-/-精子都可以与用机械法去除透明带的卵子的质膜顺利结合[13]（图 3 e ，f ），利用此系统让Izumo+/-或Izumo-/-精子和卵子分别孵育2h 或6h 后，发现与单个卵子发生融合的精子数目，Izumo+/-者分别为4.5和6个；而Izumo-/-者并未发生融合。
精子只有在发生顶体反应之后才能与卵子融合[14]，为了确证Izumo-/- 精子顶体的状态，我们利用MN9单克隆抗体（MN9只能与已发生顶体反应精子的赤道段结合[15]）来标记聚集在卵周隙中的精子。标记结果显示，Izumo-/-精子已发生了顶体反应，但却不能与卵子融合。
因为Izumo-/-雄性小鼠没有子代，所以，我们不能确定Izumo 基因缺陷是否会对融合之后的其他发育事件产生影响。为了解答上述问题，我们采用单精子胞浆注射法（ICSI ），跨越精卵融合的障碍[16]，将Izumo-/-精子直接注射入Izumo+/+卵子的胞质中，注射后的卵子被正常激活，将受精卵移植入假孕鼠的输卵管，所得鼠
胚的比例与Izumo+/-精子对照组比例大致相当（表1）。
通常，精卵融合的特异性不如精子透明带互作的特异性强。例如，人类精子不能与穿透仓鼠卵子的透明带，但却能与去透明带的仓鼠卵子发生融合。利用这一实验模型（去透明带的仓鼠卵子的精子穿透实验）可估计人类精子的生育力[17]。利用该实验模型，我们首先分析了小鼠的Izumo 基因对精卵融合的影响。图4，a 的结果表明，无论是小鼠精卵之间的同源融合还是与去透明带仓鼠卵子之间的异源融合，小鼠Izumo 都是必须的；无独有偶，如果将抗人类Izumo 的多克隆抗体加入到人类精子与去透明带仓鼠卵子的孵育液中，则不能观察到精卵的融合现象，而如果加入作为对照的IgG ，则可以观察到精卵的融合现象（平均每个卵子与5.9±0.7个精子发生融合，总观察卵数分别为23和29，n=3）。这些结果显示人类Izumo 基因参与了与去透明带仓鼠卵子融合的过程（图4，b ），但是，还需要更进一步的实验来证明人类Izumo 基因在人类精卵融合中的作用。
考虑到基因剔除小鼠的表型有时也会由于靶基因旁序列的破坏而造成[18]，为了验证Izumo-/-精子的表型缺陷是否直接由Izumo 的缺失所引起，我们设计了一个挽救实验（rescue experiment ），将Izumo-/-小鼠与睾丸特异性calmegin 启动子驱动表达Izumo 的转基因小鼠品系杂交。结果表明，通过转基因Izumo 表达的恢复，Izumo-/-小鼠精子的生育表型得以恢复（附件图1）。
目前的研究结果表明，有若干候选基因，其表达产物是与精卵融合过程密切相关的精子膜蛋白，例如DE [19]、CD46[20]、equatorin [15]、sperad [21]以及SAMP32[22]
等均有见报道。其中，
表1. Izumo-/-精子ICSI 后卵的发育。
图4. Izumo 参与异源精卵的融合，a，
去透明带的仓鼠卵子分别与Izumo-/-及Izumo+/-精子体外孵育6h 后，用Hoechst33342标记；b，加入抗人类Izumo 抗体的人类精子与去透明带的仓鼠卵子共同孵育，结果没有发生精卵融合。箭头所指为被Hoechst33342标记的膨胀的已发生融合的精子头部。IgG 为对照实验。
ADAM蛋白家族由于其具有潜在的融合肽加工位点（ADAM1）以及具有去整合素（disintegrin）结构域（ADAM2、ADAM3）[23]而备受关注。虽然在ADAM1a、ADAM2、ADAM3的基因缺陷小鼠中并没有发现明显的精卵融合的障碍[7,8,24]，但精子与透明带的结合能力均肯定受到损害。与此相似，CD46的基因剔除小鼠也没有融合缺陷[6]。另外，从卵子的角度来看，卵子的膜蛋白CD9是精卵融合所必须的[2-4]，一些实验结果提示，精子可能通过以整合素与CD9的结合来参与精卵融合过程，其中整合素α6、整合素β1被认为是最有可能参与精卵融合过程的候选基因。然而，对基因剔除模型的研究表明，上述两个基因的缺陷并未对精卵融合发生实质性的影响[25]。于是，流行多年的关于受精机制的一个个假说，不断地被基因缺陷实验的结果所推翻。这就启发我们，对某一个候选基因，只有通过观察其基因缺陷小鼠的表型变化后，才能对该基因的本质加以判断。从这个意义上说， Izumo是第一个真正显示出在精卵融合中具有本质作用的精子膜蛋白。但是目前还不能肯定Izumo是否能与CD9发生相互作用，就像胎盘的IgSF蛋白PSG17一样[26]；我们也不知道为什么顶体反应后，Izumo蛋白的定位并不局限于精卵融合的初始部位——精子赤道段。我们所能预料的是，对Izumo蛋白的进一步研究，毫无疑问会让我们对精卵融合甚至是其它体细胞（如肌细胞和滋养层细胞等）的融合过程的理解更加深刻、全面。
此发现不仅让我们得以洞见精卵融合过程中，那谜一般的融合机制，而且对不育症的临床治疗和新的避孕措施的开发提供了潜在的效益。
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①Izumo（日语“出云”）日本岛根县一城市名，也是日本古代“出云国”名。“出云”一词为纪念日本开国母神伊邪那美而
创。现在日本有著名的Izumo游戏软件——Izumo、Izumo-2 和Izumo-0三代版本。
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
蛋白质相互作用的研究方法 摘要过去15年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重 要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。本文综述了当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括酵母双杂交技术，GST pull-down技术，免疫共沉淀技术和串联亲和纯化技术等多种研究方法，总结了各种研究方法的原理及应用。 关键词：蛋白质，相互作用，研究方法 1 酵母双杂交技术(two hybrid system) 1.1基本原理真核生物细胞转录激活因子一般都含有2个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-bindingdomain, BD)和DNA转录激活结构域(transcription activation domain, AD)。这两个结构域相互独立但功能上又相互依赖,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的活性。将拟研究的编码“猎物”蛋白的基因与AD序列结合,编码“诱饵”蛋白的基因与BD序列结合,形成两段融合基因,并在同一菌株核内表达,若“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白在核内存在相互作用,就可以重新形成完整的有活性的转录因子,从而激活报告基因的转录。因此根据报告基因的表达与否,即可判断“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间是否具有相互作用。 1.2应用 Hurst等利用酵母双杂交的方法研究与乳腺癌转移抑制因子1（BRMS1）的相互作用蛋白，得到此蛋白为Hsp90伴侣蛋白。Reddi等利用酵母双杂交系统研究肝炎B病毒反式作用因子HBx蛋白的自我偶联作用，结果发现HBx蛋白在分子环境中可以通过其碳末端区域产生自我偶联作用。酵母双杂交技术也应用于大规模蛋白质相互作用网络的研究，Lim 等人利用此技术鉴定了770多个可能相互作用的蛋白，有75对蛋白质产生相互作用，其中有83%相互作用的蛋白质在哺乳动物细胞中得到验证。 1.3优点在检测蛋白质之间相互作用方面， 酵母双杂交系统具有非常高的灵敏度，尤其对蛋 白质间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因 的表达产物敏感地检测到。酵母双杂交技术研究 蛋白质相互作用是基于酵母细胞内的试验，不需 要经过提纯蛋白来研究蛋白的相互作用，避免了 提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物 活性的蛋白-蛋白相互作用，反映体内的真实的相 互作用情况。 1.4缺点（1）对相互作用蛋白在细胞内的定位 要求严格，酵母双杂交不能检测定位于胞浆内、 细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白而且融 合表达可能会影响目的蛋白修饰和折叠，尤其在 研究异源蛋白相互作用时，蛋白不一定能正确修 饰和折叠，从而影响蛋白的活性。 （2）由于某些蛋白质本身具有转录激活功，使"猎物"蛋白AD融合基因与“诱饵”
单链抗体及重组白介素-2双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测 2010-10-22 目的利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,并探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法采用聚合酶链式反应(PCR)将人工合成的`抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤单链抗体(scFv)基因5′端,其3′与白介素-2(IL-2)基因连接构成分泌型单链双功能抗体scFv- IL-2基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(scFv- IL-2)SN 在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/scFv-IL-2,以PCR,RT-PCR以及Western blotting 对scFv-IL-2基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定.在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件DNAssist和蛋白质分析软件ANTHEPROT V5分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果经酶切、PCR及Western blotting分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体 pL(scFv- IL-2)SN,并获得高滴度产毒细胞株C26,scFv-IL-2融合蛋白通过DNAssist和ANTHEPROT V5软件分析获得了融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据. 作者：史梦远王海涛张芳琳 SHI Meng-yu WANG Hai-tao ZHANG Fang- li 作者单位：第四军医大学基础部微生物教研室,陕西,西安,710032 刊名：新乡医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 25(2) 分类号：Q782 关键词：单链抗 体生物信息学资源融合蛋白
标签抗体 简介 标签抗体，别名为抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊区域或基团，是与抗体特异性结合的结构或序列。随着生物技术的发展，科研人员可以通过DNA重组技术，构建包含目的基因以及表位标记的融合蛋白，进而通过特异性标签抗体对其鉴定与纯化，以达到研究的需求。 主要类别 Flag抗体-抗Flag标签抗体 融合标签，如Flag、GST等标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。常用的标签包括myc、HA、Flag、His、GST等。其中Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等，相应的Flag标签抗体也被广泛应用。由于Flag标签系统的纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。Flag标签可以通过加入肠激酶处理去除，肠激酶专一识别该肽序列C末端的5个氨基酸残基。Flag抗体可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。 His抗体-抗His标签抗体 融合标签根据其相对分子质量大小可以分为两大类：大的蛋白质分子和小的多肽片段。融合标签的使用可以简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质固定的空间取向及方便检测、使体内生物事件可视化、提高重组蛋白质的产量、增强重组蛋白质的可溶性和稳定性等。His 标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化。由于分子量较小，并且较容易分离和纯化，His融合标签与其他标签相比有很多明显优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。利用His标签可以建立一个基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。His抗体可以用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等。 GST抗体-抗GST标签抗体 随着越来越多的新基因的发现，基因融合蛋白表达体系以其在新发现蛋白研究中的显著优势已得到广泛应用。其中GST标签体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及利于GST抗体制备等特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。GST融合蛋白可被位点特异性蛋白酶裂解，从而除去GST 蛋白。融合蛋白又是一个非常好的强免疫原，因此，很容易制备抗新蛋白的抗体。正是由于以上的优点，商品化的GST融合蛋白表达体系以及GST标签抗体系统至今仍被广泛应用。近年来在原核表达体系中，谷胱甘肽S转移酶GST表达纯化系统的应用更为普遍。用GST 融合表达系统表达外源基因时，对融合表达产物的检测和纯化非常重要，这里面就包括了GST标签抗体的应用。 GFP抗体-抗GFP标签抗体 常用的标签包括GFP、HA、Flag、His、GST等。其中绿色萤光蛋白（Green Fluorescent Protein），简称GFP，这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在一种学名Aequorea victoria 的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。GFP或其突变体EGFP等被广泛用于基因表达效率的检测，以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分布。一般来说，GFP抗体不仅可以检测GFP或其适当的突变体，也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或
注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白使用说明书 【药品名称】 通用名：注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 商品名：强克 英文名：Recombinant Human TNF Receptor-Ig Fusion Protein for Injection 汉语拼音：Zhusheyong Chongzu Ren Erxing Zhongliuhuaisiyinzi Shouti －Kangti Ronghedanbai 【性状】 本品为无菌白色冻干粉针剂。 【主要成分】 每瓶含重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25毫克，甘露醇40毫克，蔗糖10毫克，三羟甲基氨基甲烷1.2毫克。用1毫升灭菌注射用水溶解。【药理毒理】 1.药理重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白是一个二聚体的融合蛋白，包含人75KDa肿瘤坏死因子受体（TNFR）（p75）的细胞膜外配体结合部分与人IgG1的Fc片段，包含934个氨基酸，表观分子量约为150K道尔顿（KDa）。 TNF是机体自然产生的一种细胞因子，参与正常的炎症和免疫反应。在强直性脊柱炎关节病变的炎症反应中，TNF起着重要的作用。TNF存在55KDa蛋白（p55）和75KDa蛋白（p75）两类受体，它们均以单体的形式存在于细胞表面。TNF的生物学活性取决于它与细胞表面两类受体分子的结合。 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的作用机制是竞争性地与TNF 结合，阻止TNF与细胞表面TNF受体的结合，抑制TNF的生物学活性。 2.毒理小鼠急性毒性试验结果显示，静脉注射1.09g/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见毒性反应。猴长期毒性试验结果显示，每周2次连续皮下注射180天15.0 mg/kg剂量的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，未见有明显的毒性。 【药代动力学】
注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白Ⅰ期临床试验 邵威 【摘要】：注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白是一种由人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)胞外区和人免疫球蛋白G1(IgG1)修饰的Fc片段(铰链区、CH2和CH3区)相连接的融合蛋白。它是一种选择性共刺激调节剂,它与抗原提呈细胞上的B7分子的亲和力大大高于T细胞表面的CD28,可以封闭抗原提呈细胞上的B7,阻断CD28与之结合,从而阻断共刺激通路,抑制T细胞(T淋巴细胞)激活。T淋巴细胞的激活与类风湿关节炎(RA)的病理进程相关。在RA患者的关节腔滑液中可以找到激活的T淋巴细胞。根据我国药品食品监督管理局(SFDA)通过的《药品注册管理办法》,注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白属于生物制品7类,即已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的生物制品。目的: 建立酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定人血浆中重组人CTLA4-Ig浓度的方法,进行单次给药后重组人CTLA4-Ig在健康人体内的耐受性和药代动力学研究,为指导临床制定安全、合理的用药方案提供理论依据,为新药审批和临床用药提供试验依据,并为Ⅱ期临床研究提供参考依据。方法:本研究分以下三部分: 第一部分建立灵敏度高、专一性强、准确性好、重复性强的EL ISA法测定人血浆中rhCTLA4-Ig的分析方法学。测定步骤:将鼠抗人CTLA4单抗用包被缓冲液按比例稀释,包被96孔酶标板,4℃孵育18小时;加包被缓冲液室温封闭2小时;用洗涤液洗板;加入不同稀释浓度的标准品和稀释好的待测样品;加样后立即加入稀释好的生物素标记的二抗。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育2小时。加入按比例稀释好的HRP标记的链酶亲和素。酶标板置于摇床中连续振摇,室温孵育0.5小时。避光条件下加入HRP显色液,室温反应15分钟。加终止液,终止反应后0.5小时内酶标仪读取450 nm的吸光度(A)值,记录结果。每份样品重复测定,各药盒都设置标准校正曲线,用以计算未知样品浓度。第二部分考察单次静脉滴注rhCTLA4-Ig(1～20 mg·kg-1)在健康受试者体内的耐受性。随机选取27名健康志愿者,年龄、体重、身高均符合试验要求,常规体检、心电图检查,实验室检查包括血、尿常规,肝、肾功能等各项生化检查均无异常,无其它系统性疾病及药物过敏史。3个月内未参加过临床试验,试验前两周内及试验期间未服用其他任何药物。试验中随时观察受试者症状、体征以及各种不良反应,并定期进行实验室检查(血尿常规、肝肾功能、血液生化及血沉等)。综合评价rhCTLA4-Ig在健康人体内的耐受性,整个试验期间配备有经验的医师和护士监护。所有计量资料均采用Excel或SPSS软件进行计算,以?X±SD表示,并进行t检验或方差分析。第三部分研究单次静脉滴注rhCTLA 4-Ig(1～20 mg·kg-1)在健康受试者体内的药代动力学特征。27名健康受试者随机平行分为低、中、高3个单次给药剂量组。按实验设计要求,27名受试者于试验当日晨按分组分别静脉滴注重组人CTLA4-抗体融合蛋白1 mg·kg-1、10 mg·kg -1、20 mg·kg-1,输液在(60±5)分钟内完成,而后按设计的采血时间点采血。分别于静脉滴注前、滴注开始第30分钟,滴注结束后0、2、4、12、24小时、2、3、4、7、14、28、42、56、70和84天各取血2 ml,置于15 % EDTA抗凝的试管内, 3600 r·min-1离心分离血清至另一无菌试管中,-80℃保存,待测。本试验采用ELISA法测定血浆中rhCTLA4-Ig的浓度。采用DAS2.1软件计算主要药代动力学参数,Tmax、Cmax采用实测值,AUC用公式计算。所有的数据均用几何均数±标准差(?X±SD)表示,采用单因素ANOVA和Student’s t test进行统计学分析。结果: 1. 27名健康受试者,均完成试验。单次给药耐受性试验观察至84 d。试验期间,全部试验的27名受试者应用不同剂量药物后均未有明显的不良反应发生;呼吸、心率、血压、脉搏、体温等生命体征未见异常;心电图正常。注射药物局部未发现皮肤红肿、瘀斑或皮疹等刺激性反应,试验观察期间未出现不适反应和异常体征。2.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后观察至84 d。试验过程中共进行七次血液生化指标检查。27名健康受试者用药前后血沉检查未发现异常改变,经t检验,各指标试验前后比较均无显著差异。试验前后进行尿常规指标检测,所有健康受试者尿常规指标无异常改变。3.本试验采用ELISA法测定健康志愿者血浆中rhCTLA4-Ig浓度,最低检测限为0.4 ng·mL-1,线性范围为1.95～500 ng·mL-1。本药在此线性范围内重现性好,CV %均小于10 %,准确度在-5.3～-1.1 %之间;不同药盒的批间精密度CV %也均小于10 %,准确度在0.6～6.2 %之间。4.单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1、10和20 mg·kg-1后的药代动力学参数:T1/2ke分别为(15.13±2.62),(14.21±2.35) 和(11.77±1.24)d;MRT分别为(19.913±2.086)、(19.630±1.832)和(18.795±0.832)d;AUC(0-84d)分别为(170.64±27.75)、(1490. 26±231.23)和(2977.25±362.31)μg·d·mL-1;Tmax均为0.0416 d;Cmax分别为(18.39±1.57)(,186.91±24.70)和(416.84±34.40)μg·mL-1。结论: 1. ELISA的分析方法具有灵敏度较高,准确性好,专一性较强,操作简便快捷、可重复性强的特点。高、中、低三种浓度样品-80℃冻存一个月后,CTLA4-Ig稳定性良好,与未经冻存的样本相比,统计学无显著性差异。适用于人体血浆中rhCTLA4-Ig的定量分析。2.试验表明健康受试者单次静脉滴注国产rhCTLA4-Ig在1～20 mg·kg-1剂量范围内是安
Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性 分析 作者：薛茜，温伟红，孟艳玲，张勇，张巍，王涛，张瑞，杨安钢 【关键词】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9 【Abstract】 AIM: To construct R9/ScFv14/EGFP fusion genes and to analyze the binding activity of the fusion proteins after they were expressed in BL21. METHODS: A series of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the genes of ScFv14 and R9/ScFv14. The PCR products were cloned into pMD18T vector, followed by DNA sequencing. R9/ScFv14 gene and ScFv14 gene were ligated with EGFP gene respectively before they were rebined into the expression vector pET32a. After induced in BL21 by IPTG, the expressed fusion proteins named R9/ScFv14/EGFP and ScFv14/EGFP were detected by SDSPAGE and the binding activity of them were analyzed by indirect ELISA. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the two fusion genes were correctly constructed. SDSPAGE analysis showed that they were successfully expressed in BL21 and the percentages of them were 20% and 25% of total bacteria proteins respectively. Indirect ELISA confirmed that the expressed products had antigen specific binding activity. CONCLUSION: The two fusion genes were constructed successfully. And the products of them expressed in BL21 maintained the binding activity to HBsAg. 【Keywords】 hepatitis B; hepatitis B surface antigens; ScFv; Arg9 【摘要】目的：构建带有转膜结构域Arg9编码序列的 R9/ScFv14/EGFP融合基因，将其转化入大肠杆菌中进行表达，并分析表达产物与HBsAg的结合活性. 方法：设计引物，将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端，PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因，将PCR产物连入pMD18T载体，进行序列测定. 将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a，获得ScFv14/EGFP和 R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS，以IPTG诱导表达，对表达产物进行SDSPAGE分析，并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性. 结果：经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和
重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域, 特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将6个标签的功能初步介绍如下： (一) His 6 His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。 使用His-tag有下面优点： 1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； 2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； 3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； 4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体； 5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；
6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 (二) Flag Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。Flag 作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： 1. Flag 作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 2.融合Flag 的目的蛋白，可以直接通过Flag 进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 3. Flag 作为标签蛋白，其可以被抗Flag 的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有Flag 的融合蛋白进行检测、鉴定。 4.融合在N端的Flag ，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现Flag 标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。 (三) MBP MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE 基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。 纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM 麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白
抗体药物的研究现状和发展趋势 一、研究现状 1．抗体研究发展历程 抗体作为药物用于人类疾病的治疗拥有很长历史。但整个抗体药物的发展却并非一帆风顺，而是在曲折中前进。第一代抗体药物源于动物多价抗血清，主要用于一些细菌感染性疾病的早期被动免疫治疗。虽然具有一定的疗效，但异源性蛋白引起的较强的人体免疫反应限制了这类药物的应用，因而逐渐被抗生素类药物所代替。第二代抗体药物是利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在实验研究和疾病诊断中得到了广泛应用。 单抗最早被用于疾病治疗是在1982年，美国斯坦福医学中心Levy等人利用制备的抗独特型单抗治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者病情缓解，瘤体消失，这使人们对抗体药物产生了极大的期望。1986年，美国FDA批准了世界上第一个单抗治疗性药物——抗CD3单抗OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。此时抗体药物的研制和应用达到了顶点。随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显。同时一些抗肿瘤单抗未显示出理想效果。人们的热情开始下降。到20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症失败使得抗体药物的研究进入低谷。由于大多数单抗均为鼠源性，在人体内反复应用会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而降低疗效，甚至可引起过敏反应。因此，一方面在给药途径上改进，如使用片段抗体、交联同位素、局部用药等使鼠源性抗体用量减少，也增强了疗效；另一方面，积极发展基因工程抗体和人源抗体。 近年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA 重组技术开始用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造以消除抗体应用不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备各种形式的重组抗体。抗体药物的研发进入了第三代，即基因工程抗体时代。与第二代单抗相比，基因工程抗体具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②基因工程抗体的分子量较小，可以部分
2013——2014第一学期蛋白质组学试题 一名词解释（6分题，共30分） 1. 基因组：生物细胞中的全部基因。 蛋白质组：生物细胞中由全套基因编码控制的蛋白质 2. 基因组学：是研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。 蛋白质组学：研究蛋白质组中蛋白质表达与功能变化的科学。可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。 3. 质谱：被分析样品经离子化，成为分子离子及其碎片，后利用离子在电场或磁场中的运动性质，把离子按其质量与所带电荷比（m/z）的大小依次排列并记录下来成为质量波谱，称为质谱。 质谱分析：是通过对样品分子的离子质量和强度进行测定来分析样品成分和结构的一种分析方法。 4. MALDI与ESI MALDI：即基质辅助激光解吸电离，在波长为775-1250nm的真空紫外光辐射下光致电离和解吸作用使生物分子电离为分子离子和含有结构信息的碎片。 ESI：即电喷雾电离，采用强静电场（3-5kV），以喷雾形式使液体样品形成高度荷电的雾状小液滴，小液滴经过反复的溶剂挥发-
液滴分裂后，产生多种质子化离子。 两者均属于软电离技术。 5. SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠（SDS）构成SDS-PAGE系统用于分离蛋白质，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。 2-D：即双向凝胶电泳，根据蛋白质的等电点和分子质量的差异使之在二相平面上分开 是目前使用最广泛的蛋白质组学分离技术。 二简答题（6分题，共30分） 1 简述CHIP技术的原理 ICATS是一种蛋白质组学定量研究常见方法，ICAT试剂结构，包括3个部分，SH反应集团，biotin标签，同位素 其原理是来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT 试剂标记，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标