微生物发酵过程简介文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应过程。根据微生物的种类不同（好氧、厌氧、兼性厌氧），可以分为好氧性发酵和厌氧性发酵两大类。（1）好氧性发酵在发酵过程中需要不断地通人一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸发酵、利用棒状杆菌进行谷氨酸发酵、利用黄单抱菌进行多糖发酵等等。（2）厌氧性发酵在发酵时不需要供给空气，如乳酸杆菌引起的乳酸发酵、梭状芽抱杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。（3）兼性发酵酵母菌是兼性厌氧微生物，它在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧即通气条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞。按照设备来分，发酵又可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。一般敞口发酵应用于繁殖快并进行好氧发酵的类型，如酵母生产，由于其菌体迅速而大量繁殖，可抑制其他杂菌生长。所以敞口发酵设备要求简单。相反，密闭发酵是在密闭的设备内进行，所以设备要求严格，工艺也较复杂。浅盘发酵（表面培养法）是利用浅盘仅装一薄层培养液，接人菌种后进行表面培养，在液体上面形成一层菌膜。在缺乏通气设备时，对一些繁殖快的好氧性微生物可利用此法。深层发酵法是指在液体培养基内部（不仅仅在表面）进行的微生物培养过程。液体深层发酵是在青霉素等抗生素的生产中发展起来的技术。同其他发酵方法相比，它具有很多优点： 1.液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境。 2.在液体中，菌体及营养物、产物（包括热量）易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模。 3.液体输送方便，易于机械化操作。 4.厂房面
积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定。 5.产品易于提取、精制等。因而液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用。 4.2.1工业生产常用微生物微生物资源非常丰富，广布于土壤、水和空气中，尤以土壤中为最多。有的微生物从自然界中分离出来就能够被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介人，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。其他微生物有担子菌、藻类。
4.2.2培养基培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。培养基的成分和配比，对微生物的生长、发育、代谢及产物积累，甚至对发酵工业的生产工艺都有很大的影响。依据其在生产中的用途，可将培养基分成抱子培养基、种子培养基和发酵培养基等。（1）抱子培养基抱于培养基是供制备泡子用的。（2）种于培养基种子培养基是供抱子发芽和菌体生长繁殖用的。（3）发酵培养基发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。发酵培养基的组成和配比由于菌种不同。设备和工艺不同以及原料来源和质量不同而有所差别。因此，需要根据不同要求考虑所用培养基的成分与配比。但是综合所用培养基的营养成分，不外乎是碳源（包括用作消泡剂的油类）、氮源、无机盐类（包括微量元素）、生长因子、水、产物形成的诱导物、前体和促进剂等几类。
4.2.3 发酵的一般过程生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种制备、种子培养、发酵和提取精制等下游处理几个过程。以下以霉菌发酵为例加以说明。 4..2.3.1菌种在进行发酵生产之前，公先必须从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，并经分离、纯化及选育后或是经基因工程改造后的"工程菌"．才能供给发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产菌株，还需要定期进行菌种纯化和育种，筛选出高产量和高质录的优良菌株。种子扩大培养是指将保存在砂上管。冷冻干燥管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种，接入试管斜面活化后，再经过茄子瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。发酵产物的产量与成品的质量，与菌种性能以及抱于和种子的制备情况密切相关。先将贮存的菌种进行生长繁殖，以获得良好的抱子，再用所得的抱子制备足够量的菌丝体，供发酵罐发酵使用。种子制备有不同的方式，有的从摇瓶培养开始，将所得摇瓶种于液接入到种子罐进行逐级扩大培养，称为菌丝进罐培养；有的将泡了百接接人种子罐进行扩大培养，称为抱子进罐培养。采用哪种方式和多少培养级数，取决于菌种的性质。生产规模的人小和生产厂艺的特点，种于制备一般使用种于罐，扩人培养级数通常为二级。对于不产孢子的菌种，经试管培养直接得到菌体，再经摇瓶培养后即可作为种子罐种子。发酵是微生物合成大量产物的过程，是整个发酵工程的中心环节。它是在无菌状态下进行纯种培养的过程。因此，所用的培养基和培养设备都必须经过灭菌，通人的空气或中途的补料都是无菌的，转移种子也要采用无菌接种技术。通常
利用饱和蒸汽对培养基进行灭菌，灭菌条件是在120℃（约0.1Mpa表压）维持20~30min。空气除菌则采用介质过滤的方法，可用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物，从而制得无菌空气。发酵罐内部的代谢变化（菌丝形态、菌浓、糖、氮含量、pH值，溶氧浓度和产物浓度等）是比较复杂的，特别是次级代谢产物发酵就更为复杂，它受许多因素控制。发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成合乎要求的成品。
摘要：1、营养琼脂（普通琼脂）成份：牛肉浸液（或其它浸液，消化液或肉膏汤）100毫升琼脂（视天气，琼脂质量而定）制法：将上物加热溶解，补足水，调ph至7．6，过滤分装121℃，高压灭菌15分钟。用途：作普通琼脂平皿。2、血琼脂平板（BA）制法：取营养琼脂（PH7．6），加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养 1、营养琼脂（普通琼脂) 成份：牛肉浸液（或其它浸液，消化液或肉膏汤) 100毫升 琼脂（视天气，琼脂质量而定) 制法：将上物加热溶解，补足水，调ph至7．6，过滤分装121℃，高压灭菌15分钟。 用途：作普通琼脂平皿。 2、血琼脂平板（BA) 制法：取营养琼脂（PH7．6)，加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀，立即倾注于平板或分装试管，制成斜面备用。 用途：1．一般棉拭子均接种此培养基。 2．尿液，脓液 3．分离细菌标本用。 3、基础培养基（肉膏汤BB) 成份：蛋白胨10克牛肉膏5克 氯化钠5克水1000毫升 制法：将以上各物称好，加水煮沸溶解，用1NNOH校正PH至7．6，过滤分瓶，121℃高压灭菌，20分钟备用。 用途：1 作耐药试验，增菌用分装小管。 2 作普通琼脂斜面。 4、血液培养基（大管肉汤培养基) 成份：1 新鲜牛肉浸液1000毫升 2 PABA（对氨基苯甲酸〔相当于10mg/毫升〕) 1g% 1毫升 3 MgSO 4 [相当于0．493/100毫升] 49．3% 1毫升 4 枸椽酸钠0．3g 制法：1 将1号，4号混合液，2号，3号液分装高压灭菌。
2 取灭菌1，4号混合液用无菌法加入PABA，MgSO4，再分管，行无菌试验三天方可使用。 用途：作血，骨髓培养用。 5、肠道杆菌培养基（伊红美兰琼脂) 成份：蛋白胨10克乳糖10克 氯化钠5克琼脂25（22)克 水1000毫升2%伊红溶液20毫升 0．5%美兰溶液20毫升 制法：将蛋白胨，氯化钠琼脂称好，加水1000毫升使溶解，校正PH7．4过滤，补足失水，加入2%伊红溶液20毫升，0．5%美兰溶液20毫升，（115℃高压20分钟)，冷却至50℃左右倾注平板，凝固后存冰箱备用。（高压以后方可再加乳糖) 用途：用作分离沙门氏，志贺氏菌属，也作菌群调查。 1 6、罗文斯坦培养基 成份：磷酸二氢钾2．4克硫酸镁0．24克 枸椽酸钠0．6克天门冬素3．6克 纯甘油（丙三醇) 12毫升水600毫升 马铃薯粉30克鸡蛋1000毫升（约3公斤) 2%孔雀绿水溶液20毫升 制法：1 除鸡蛋外（还有孔雀绿)。可将其它物品称好，放入大三角瓶包扎好，高压灭菌。 2 鸡蛋用75%酒精泡30分钟，灭菌法打蛋，倒入盛有玻璃珠的灭菌三角烧瓶内充分将鸡蛋摇散。 3 将各成份按比例配好，分装每管约5毫升。 4 间歇灭菌第一次90℃1小时，第二次80℃半小时，第三次80℃半小时（或放85℃烤箱内连续二次)。 质控标准： 1 灭菌试验合格。 2 接种结核杆菌要求两星期生长良好。 用途：作结核分枝杆菌培养用。
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念（medium）供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要 的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 ? 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。 6.4.1 培养基的成分 碳源 氮源无机盐水生长因子 前体与促进剂 消泡剂 1、碳源(carbon sources) 概念： 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。 碳源种类 糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸 迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸 2、氮源（nitrogen sources） 概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。 作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源 有机氮源 几乎所有微生物都能利用有机氮源 黄豆饼粉、花生饼粉 棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素 无机氮源 氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。 工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NH4）2SO4利用后，产生硫酸 生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。 3、无机盐和微量元素 ? 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 ? 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。? 种类：盐离子 磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加 铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。 4、水 菌体细胞的主要成分。 营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。培养基的主要成分之一。 5、生长因子（growth factor）
按照培养基的成分来分 培养基按其所含成分，可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基三类。 (1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏(Czapek)培养基等。 (2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。 (3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。 养基三类。 (1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。 (2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。 (3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
培养基和霉菌培养基等四类。 常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)琼脂培养基和察氏培养基等。 养基。 (1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。 (2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。 (3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。
第五章微生物与发酵工程【菜单】
【精解】 例1．所有细菌都是（） A．异养型 B．寄生 C．腐生 D．以上都不对 解析：细菌的代谢类型和生活方式多种多样，既有化能自养，如硝化细菌，又有光能自养，如光合细菌，还有很多细菌是异养型生物，如大肠杆菌。有的细菌营腐生生活，在生态系统中是分解者，如圆褐固氮菌，有的细菌营寄生生活，在生态系统中是消费者，如使人致病的结核杆菌。所以，关于细菌的代谢类型和生活方式不能一概而论。答案选D。 例2．控制细菌合成抗生素性状的基因，控制放线菌主要遗传性状的基因，控制病毒抗原特异性的基因依次位于（） ①核区大型环状DNA上②质粒上③细胞核染色体上④衣壳内核酸上 A．①③④ B．①②④ C．②①③ D．②①④ 解析：细菌的核区里有一个大型环状的DNA分子，细胞质的质粒也是小型的环状DNA分子。其中，大部分的性状由核区DNA上的基因控制，而控制细菌合成抗生素的基因、抗药性基因和固氮基因等却在质粒上；放线菌也是原核生物，核区内也有大型的DNA分子，控制着放线菌主要的遗传性状，病毒的基因只在核酸上，而蛋白质外壳没有基因。以上三类生物都没有染色体。答案选D。 例3．“非典”的病原体SARS病毒是RNA病毒，据报道，SARS疫苗的研究已取得突破性进展，
不久将进行临床实验。下列关于SARS病毒及疫苗的叙述正确的是（） A．SARS病毒的遗传物质的组成中含有5种碱基，8种核苷酸 B．接种SARS疫苗能增强人体免疫力是因为接种了SARS抗体 C．可用含碳源、氮源、生长因子、水、无机盐的普通培养基培养SARS病毒 D．决定其抗原特异性的是SARS病毒的衣壳 解析：SARS病毒是RNA病毒，因此组成它遗传物质的碱基有A．U．C．G4种，只有4种核苷酸。而病毒只能寄生在活细胞内，因此，用普通培养基是不能培养病毒的；决定病毒抗原特异性的是衣壳部分。若SARS疫苗研制成功，它可能是经过处理的已经没有毒性或毒性极弱的SARS 病毒或者是其衣壳部分，注入人体能起到抗原作用，即能刺激人体产生抗体；因此，接种的是抗原而不是抗体。本题容易错选为C，主要是没有正确掌握病毒的生活方式。答案选D 例4．下列关于病毒的叙述，正确的是（） A．病毒都含单链RNA或单链DNA B．侵染宿主细胞前，病毒自身不带有任何酶 C．病毒结构成分中只有蛋白质和核酸 D．病毒结构中有时可能装配有寄主细胞中的某些成分 解析：病毒的核酸只有一类，有的是DNA，有的RNA；有的病毒DNA是双链的，有的病毒DNA 是单链的。有的病毒RNA是单链的，也有的病毒RNA是双链的；有的病毒在侵染宿主细胞前带有一些酶，如艾滋病病毒自身带有逆转录酶，T2噬菌体带有溶菌酶。简单的病毒如烟草花叶病毒的结构成分只有蛋白质和核酸，而有些病毒如流感病毒除了核衣壳外，还带有囊膜，因此，组成成分中除了蛋白质和核酸外，还有少量脂质和糖类。所以，病毒结构成分不是只有蛋白质和核酸。因为，衣壳和核酸的组装在寄主细胞中进行，所以，有时可能装配有寄主细胞中的某些成分。答案选D 例5．下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（） A．作为碳源的物质不可能同时是氮源 B．凡是碳源都能提供能量 C．除水以外的无机物只提供无机盐 D．无机氮源也能提供能量 解析：碳源是指能给微生物提供碳元素的物质，而氮源是指能给微生物提供氮元素的物质，有的物质如氨基酸中，即有碳元素又有氮元素，因此可作为异养微生物的碳源和氮源。自养微
培养基的类型及应用 培养基种类繁多, 根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。 1．按成份不同划分 (1)天然培养基(complex medium) 这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成, 牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的 LB(Luria-Bertani) 培养基也是一种复合培养基,其组成见表4-10。 常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏( 表4-11 ) 、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等, 嗜粪微生物(coprophilous microorganisms) 可以利用粪水作为营养物质。复合培养基成本较低, 除在实验室经常使用外, 也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。 (2)合成培养基(synthetic medium) 合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemically defined medium), 高氏1 号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强, 但与天然培养基相比其成本较高, 微生物在其中生长速度较慢, 一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。 2．根据物理状态划分 根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少, 可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。 (1)固体培养基(solid medium) 在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1. 不被所培养的微生物分解利用;2. 在微生物生长的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时,由于高温容易引起培养基液化, 通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题;3. 凝 固剂凝固点温度不能太低, 否则将不利于微生物的生长;4. 凝固剂对所培养的微生物无毒害作 用;5. 凝固剂在灭菌过程中不会被破坏;6. 透明度好,粘着力强;7. 配制方便且价格低廉。常 用的凝固剂有琼脂(agar) 、明胶(gelatin) 和硅胶(silica gel) 。表4-12 列出琼脂和明胶的一些主要特征。 对绝大多数微生物而言, 琼脂是最理想的凝固剂, 琼脂是由藻类(海产石花菜) 中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物, 是最早用来作为凝固剂的物质, 但由于其凝固点太低, 而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶, 目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3) 及硅酸钾(K2SiO3) 被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体,它不含有机物, 适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。 除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外, 一些由天然固体基质制成的培养基 也属于固体培养基。例如, 由马铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就 属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。 在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养 基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以 形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。
微生物与发酵工程 13101002 朱梦雪发酵工程是生物工程的重要组成部分,也是现代微生物学的核心内容;任何产品的发酵生产都必须通过微生物发酵或细胞扩大培养才能实现。因此,微生物与发酵是紧紧联系在一起的。微生物发酵工程是加快发酵工程研究成果转化为生产力,取得最佳效益的重要手段。微生物科学工作者应不失时机地积极而科学地运用这种手段为社会社会主义市场经济服务。 根据文献的调查，微生物的发酵工程主要应用于以下几点： 首先是在农业生产上，巴西全国土壤生物研究中心的研究人员发现一种新固氮菌,即固氮醋杆菌(Aeetobaeterdiazotrophyeus)。这是人类发现的第一个有固氮能力的醋杆菌,生活在甘蔗根部,具有很强的抗酸性。由于它的高效固氮能力,可使甘蔗年产量提高2倍(由60吨/公顷提高到180吨/公顷)。在固氮菌的研究方面,我国作物茎瘤固氮根瘤菌的高效固氮活性,以及小麦、玉米、陆生水稻固氮根瘤菌研究取得重要进展;英国诺丁汉大学一个研究小组也获得田著根瘤菌进入小麦、水稻、玉米和油菜等非豆科植物侧根中形成小根瘤,且有固氮作用的类似结果。今年拟在埃及、印度、墨西哥分别进行小麦、水稻、玉米的田间试验。这些非豆科专性共生固氮菌尚处在试验研究阶段。而我国联合固氮微生物早已产业化生产,其产品推广应用于农业生产实践,获得了增产的效果。近又发现一些新的联合固氮菌如产酸克氏杆菌、植皮克氏杆菌(Klebsiellaplantieola)等,为扩大联合固
氮菌AIJ新品种的研制做出了新贡献。 其次是在生物材料方面。有很多生物材料都是应用微生物发酵来生产的。我了解到的有生物可降塑料、建筑用生物材料和壳聚糖材料。 生物可降解塑料:微生物合成塑料物质:加拿大蒙特利尔生物技 术研究所以甲醇为原料利用从土壤中选育的嗜甲基细菌生产聚件轻 基丁酸(PHB),在我国,武汉大学生物工程研究中心用圆褐固氮菌发酵生产PHB;中国科学院微生物研究所用真养产碱杆菌生产PHB,在培养基中累积的量达细胞干重的63%(W/W);山东大学微生物研究所用该菌生产PHB的研究取得类似结果。 建筑用生物材料：某些微生物及其代谢产物如橡胶物质、弹力纤维、高分子多糖等作为混凝土添加剂,制造富有弹性的牢固的生物混凝土材料是有可能的,提供生物建筑材料的另一种可能性是某些微生物—蓝细菌或微型藻类,它们有分泌石灰石(碳酸钙)能力。 多用途的壳聚糖材料：壳聚糖又叫脱乙酞基多糖,用途极其广泛,几乎各个行业都用得着它。从微生物发酵生产,如真菌细胞壁含几丁质成分20%一22%,毛霉细胞壁中几丁质含量高达30写一40%,利用黑曲霉或其他真菌来生产壳聚糖是完全可能的。 还有就是利用微生物发酵生产两类重要有机酸这里着重介绍两 类重要有机酸,都有可能通过微生物发酵途径索取。 衣康酸(itaconicac记)进人规模生产:衣康酸又称甲叉丁二酸,系一种不饱和的二梭酸,用途广、需求量大,它是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、表面活性剂、去垢剂、润滑油添加剂等的原料,
发酵技术指标 沃蒙特发酵技术服务平台 NO 项目英文技术名称名称指标 1他克莫司Tacrolimus 发酵单位：大于 1.0g/L, 发酵周期： 240 小时 , 提取收 率： 60-70% 2西罗莫司Sirolimus\Rapamyci 发酵单位： 1000±200 mg/L，发酵周期： 192hrs ，收率：35- 40% n产品含量：≥ 98% 3乳酸链球菌素Nisin 发酵水平 : 12-15g /L ，发酵时间：16-20小时，收率 :65% 以上。 4霉酚酸mycophenolate 发酵单位： 12g/L 以上，发酵时 间：160 小时，提取得率：mofetil, MMF 75% 5去甲金霉素DMCT,Demethylchlor 发酵单位： 10± 2g/L ，发酵时间： 200 小时，产品收率： 75％ tetracycline 6雄烯二酮Androstenedione 发酵时间 96 ± 24 hrs ，每 3- 3.3 公斤植物甾醇可获 得 1 公斤雄烯二酮。 7利福霉素Rifamycin 发酵周期 220 小时，发酵单位大于 20g/L ，收率 65% 86- 羟基烟酸6-Hydroxynicotinic 纯度：≥ 98%，用途说明：用于合成维 生素 A Acid 9L- 缬氨酸Valine 发酵产酸： 60±5 克 /L ，发酵周 期： 60 ± 5 小时，提取 收 率： 65%（医药级） 10 L- 异亮氨酸Isoleucine 发酵产酸： 25-30 克 / 升，发酵周期 : 60-72 小时， 提取收 率： 80% 发酵单位 :35 ± 3g/L ，发酵时间 :33-35 小时，产品 得率 : 饲 11 L- 色氨酸Tryptophan 料级≥ 85%，药品级 ≥ 70%，产品质量 :>98.0%( 纯度 ) ， 糖转化率： 18% 12 糖化酶Glucoamylase 发酵周期： 6～7 天，酶 活： 8 万- 10 万 U 13 耐高温淀粉酶Amylase 发酵周期： 140h，酶活： 17 万单位 14 纤维素酶Cellulase 发酵周期： 6～7 天，酶活： 80-100IU 15 超级泰乐菌素Super tylosin 发酵单位： 14000- 16000U/ml 发酵时间： 130-150 小时提 取 收率： 70-75%
微生物制药的一般工艺流程 微生物制药技术 工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。 微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特
点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容： 第一方面菌种的获得 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
培养基的类型及应用 培养基种类繁多,根据其成份、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。 1．按成份不同划分 (1)天然培养基(complexmedium) 这类培养基主要以化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物组成,牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB(Luria-Bertani)培养基也是一种复合培养基,其组成见表4-10。 常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(表4-11)、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡罗卜汁、椰子汁等,嗜粪微生物(coprophilousmicroorganisms)可以利用粪水作为营养物质。复合培养基成本较低,除在实验室经常使用外,也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。 (2)合成培养基(syntheticmedium) 合成培养基是由化学成份完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基(chemicallydefinedmedium),高氏1号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强,但与天然培养基相比其成本较高,微生物在其中生长速度较慢,一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。 2．根据物理状态划分 根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少,可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。 (1)固体培养基(solidmedium) 在液体培养基中加入一定量凝固剂即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件:1.不被所培养的微生物分解利用;2.在微生物生长的温度范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时,由于高温容易引起培养基液化,通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题;3.凝固剂凝固点温度不能太低,否则将不利于微生物的生长;4.凝固剂对所培养的微生物无毒害作用;5.凝固剂在灭菌过程中不会被破坏;6.透明度好,粘着力强;7.配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂(agar)、明胶(gelatin)和硅胶(silicagel)。表4-12列出琼脂和明胶的一些主要特征。 对绝大多数微生物而言,琼脂是最理想的凝固剂,琼脂是由藻类(海产石花菜)中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物,是最早用来作为凝固剂的物质,但由于其凝固点太低,而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶,目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠(Na2SiO3)及硅酸钾(K2SiO3)被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体,它不含有机物,适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。 除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外,一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如,由马铃薯块、胡罗卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉子壳培养基。 在实验室中,固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面,单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖,可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。
1、营养琼脂（普通琼脂） 成份：牛肉浸液（或其它浸液，消化液或肉膏汤） 100毫升 琼脂（视天气，琼脂质量而定） 制法：将上物加热溶解，补足水，调ph至7．6，过滤分装121℃，高压灭菌15分钟。 用途：作普通琼脂平皿。 2、血琼脂平板（BA） 制法：取营养琼脂（PH7．6），加热使其溶解待冷至45-50℃，以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血或兔血5-10毫升,轻轻摇匀，立即倾注于平板或分装试管，制成斜面备用。 用途：1． 一般棉拭子均接种此培养基。 2．尿液，脓液 3．分离细菌标本用。 3、基础培养基 （肉膏汤BB） 成份：蛋白胨 10克 牛肉膏 5克 氯化钠 5克 水 1000毫升 制法：将以上各物称好，加水煮沸溶解，用1NNOH校正PH至7．6，过滤分瓶， 1
121℃高压灭菌，20分钟备用。 用途：1 作耐药试验，增菌用分装小管。 2 作普通琼脂斜面。 4、血液培养基（大管肉汤培养基） 成份：1 新鲜牛肉浸液 1000毫升 2 PABA（对氨基苯甲酸〔相当于10mg/毫升〕） 1g% 1毫升 3 MgSO 4 [相当于0．493/100毫升] 49．3% 1毫升 4 枸椽酸钠 0．3g 制法：1 将1号，4号混合液，2号，3号液分装高压灭菌。 2 取灭菌1，4号混合液用无菌法加入PABA，MgSO4，再分管，行无菌试验三天方可使用。 用途：作血，骨髓培养用。 5、肠道杆菌培养基（伊红美兰琼脂） 成份： 蛋白胨 10克 乳糖 10克 氯化钠 5克 琼脂 25（22）克 水 1000毫升 2%伊红溶液20毫升 0．5%美兰溶液 20毫升 2
36种微生物常用培养基配制 1.牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，～。 2.高氏1号培养基(用于放线菌培养) 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl ，K2HPO4?3H2O ，MgSO4?，FeSO4?，水1000mL，～。配制时注意：可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中。 3.马丁氏（Martin）培养基（用于从土壤中分离真菌） K2HPO41g，MgSO4?，蛋白胨5g，葡萄糖10g，1/3000孟加拉红水溶液100mL，水900mL，自然pH，121℃湿热灭菌30min。待培养基融化后冷却55～60℃时加入链霉素(链霉素含量为30μg/mL)。 4.马铃薯培养基(PDA)(用于霉菌或酵母菌培养) 马铃薯(去皮)200g，蔗糖(或葡萄糖)20g，水1000mL，配制方法如下： 将马铃署去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足至1000mL，自然pH，霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。 5.察氏培养基(蔗糖硝酸钠培养基)(用于霉菌培养) 蔗糖30g，NaNO3 2g，K2HPO4 1g，MgSO4?，KCl ，FeSO4?，水1000mL，～。 培养基(用于支原体培养) 牛心消化液(或浸出液)1000mL，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，～，分装每瓶70mL，121℃湿热灭菌15min，待冷却至80℃左右，每70mL中加入马血清20mL，25%鲜酵母浸出液10mL，15醋酸铊水溶液，青霉素G钾盐水溶液(20万单位以上)，以上混合后倾注平板。 *注意：醋酸铊是极毒的药品，需特别注意安全操作。 7.麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基) 葡萄糖, KCl ，酵母膏，醋酸钠，琼脂，蒸馏水l00mL。溶解后分装试管，1l5℃湿热灭菌15min。 8.葡萄糖蛋白胨水培养基(用于.反应和甲基红试验) 蛋白胨，葡萄糖，K2HPO4 ，水100mL，，1l5℃湿热灭菌20min。 9.蛋白胨水培养基(用于吲哚试验) 蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，～，121℃湿热灭菌20min。 10.糖发酵培养基(用于细菌糖发酵试验) 蛋白胨，NaCl ，K2HPO4 ，水100mL，溴麝香草酚蓝(1%水溶液)，糖类lg。分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中，调pH至，再加入溴麝香草酚蓝(先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)，加入糖类，分装试管，装量4～5cm高，并倒放入一杜氏小管(管口向下，管内充满培养液)。115℃湿热灭菌20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽以使杜氏小管内不残存气泡。常用的糖类，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等(后两种糖的用量常加大为%)。
第五章微生物的营养和培养基 一、选择题 1. 大多数微生物的营养类型属于：（） A. 光能自养 B. 光能异养 C. 化能自养 D. 化能异养 2. 蓝细菌的营养类型属于：（） A．光能自养 B. 光能异养C．化能自养 D. 化能异养 3. 碳素营养物质的主要功能是：（） A. 构成细胞物质 B. 提供能量 C. A，B 两者 4. 占微生物细胞总重量70%-90% 以上的细胞组分是：（） A. 碳素物质 B. 氮素物质 C. 水 5. 能用分子氮作氮源的微生物有：（） A. 酵母菌 B. 蓝细菌 C. 苏云金杆菌 6. 大肠杆菌属于（）型的微生物。 A. 光能无机自养 B. 光能有机异养 C. 化能无机自养 D. 化能有机异养 7. 自养型微生物和异养型微生物的主要差别是：（） A. 所需能源物质不同 B. 所需碳源不同 C. 所需氮源不同 8. 基团转位和主动运输的主要差别是：（） A. 运输中需要各种载体参与 B. 需要消耗能量 C. 改变了被运输物质的化学结构 9. 单纯扩散和促进扩散的主要区别是：（） A. 物质运输的浓度梯度不同 B. 前者不需能量，后者需要能量 C. 前者不需要载体，后者需要载体 10. 微生物生长所需要的生长因子（生长因素）是：（） A. 微量元素 B. 氨基酸和碱基 C. 维生素 D. B，C二者 11. 培养基中使用酵母膏主要为微生物提供：（） A. 生长因素 B. C 源 C. N 源 12. 细菌中存在的一种主要运输方式为：（） A. 单纯扩散 B. 促进扩散 C. 主动运输 D. 基团转位 13. 微生物细胞中的C素含量大约占细胞干重的：（） A. 10% B. 30% C. 50% D.70%
微生物发酵中药的相关调查 中药发酵制药技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上,吸取了微生态学研究成果,结合现代生物工程的发酵技术而形成的高科技中药制药新技术,是从中药(天然 药物) 制药方面寻找药物的新疗效。传统的中药发酵多是在天然的条件下进行的, 而现在的中药发酵制药技术是在充分吸收了近代微生态学、生物工程学的研究成果 而逐渐形成的。其先进发酵工艺特点是:以优选的有益菌群中的一种或几种、一株 或几株益生菌作为菌种,加入中药提取液中,再按照现代发酵工艺制成产品,它是一 种含有中药活性成分、菌体及其代谢产物的全组分发酵液的新型中药发酵加工制剂。 一、微生物发酵中药的应用历史 早在千余年前,我国已开始用发酵方法制药,直到现在临床仍在应用的发酵(制品) 中药有六神曲、半夏曲、淡豆豉、豆黄等,其工艺均为固体发酵。 1、微生物发酵中药中所应用到的很多微生物是药用真菌或者含有真菌的混合菌群，其中药用真菌很多本身作为中药来应用。因此一定意义上讲，中药与微生物，特别 是与一些药用真菌具有密切的联系。 早在东汉年间《神龙本草经》中，就有灵芝、茯苓、猪苓、雷丸等药用真菌分 别列项论述，这些药物至今沿用不衰。 2、微生物发酵中药应用历史悠久，也是传统中药加工炮制的重要方法之一，一般 主要是起到中药复合炮制的作用。而且很多发酵之后的药物在临床应用上取得了较 好效果。 微生物发酵中药在中医药应用中得到了很大的体现。如片仔癀的主要成分是三 七的微生物发酵物；神曲由面粉、赤小豆、苦杏仁、鲜青蒿、鲜苍耳、鲜辣蓼按一 定比例混匀后经发酵而成的曲剂。 3、某些传统的微生物制剂一直使用至今，其中以不同中药作为辅料，采用微生物 处理后自身成为发酵物组成的一部分，如半夏炮制，神曲制备等。同时随着历史的 发展，微生物发酵中药的应用也在不断变化。 半夏在整个炮制过程中使用到了一些中药，最终形成具有一定功效的以半夏为 主要组成部分的中药炮制品。半夏至汉代始用汤洗去毒，即为炮制品。南北朝时增 加生姜制、热汤洗、白芥子末制、头醋制等炮制品。唐代增加姜汁制，宋代增加麸炒、热洒炒、酸浆浸、米醋炒浸、生姜甘草桑白皮制、猪苓制、白矾制、萝卜制、 姜矾牙皂制和半夏曲。金之时期，增加米泔浸、香油炒、菜油拌炒。明代增加盐水洗、面炒醋制、杏仁炒。清代增加巴豆制、活生姜制、猪胆汁炒、皂荚白矾姜汁竹 沥制，有仙半夏和法半夏。由此可见，半夏的炮制方法繁多，而且种类各异，如仙 半夏、半夏曲等，已经成为含半夏的一个复方 二、微生物发酵中药的研究现状 中药发酵研究开始于80 年代,但仅是对真菌类自身发酵的研究,如灵芝菌丝体、冬虫夏草菌丝体、槐耳发酵等,大都是单一发酵。虽有报道加入中药,但也仅是将中 药当做菌丝体发酵的菌质,同时研究发现,含有中药的菌质对原发酵物的功效有影响,只是未见深入研究。目前,已有学者呼吁中药发酵制药可按新药审批办法规定开发新药。同时也开展了另一项研究,即生物转化,我们认为它与中药发酵是密不可分的 1、利用中药为培养基的组成部分，构建药性菌质，比较发酵前后中药相关成分的
微生物实验室培养基配方大全 一、糖发酵管 成分： 牛肉膏 5g 蛋白胨 10g 氯化钠 3g 磷酸氢二钠2g 0.2％滇麝香草酚蓝溶液 12mL 蒸馏水 1000mL PH 7.4 制法 1. 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,按0.5％加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。 2. 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶1000 mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。 注： 蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。 试验方法：
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养，一般观察2～3d。迟缓反应需观察14~30d。 二、乳糖胆盐发酵管 成分： 蛋白胨 20g 猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g 乳糖 10g 0.04%滇甲酚紫水溶液 25mL 蒸馏水 1000mL 制法：将蛋白胨，胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10 mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。 注： 双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。 三、5％乳糖发酵管 成分： 蛋白胨 0.2g 氯化钠 0.5g 乳糖 5g 2%溴麝香草酚蓝水溶液 1.2mL
蒸馏水 100mL pH 7.4 制法：除乳糖以外的各成分：溶解于50mL蒸馏水内，校正pH。将乳糖溶解于另外50mL蒸馏水内，分别灭菌121 ℃ 15min，将两液混合，以无菌操作分装于灭菌小试管内。 注： 在此培养基内，大部分乳糖迟缓发酵的细菌可于ld内发酵。 四、缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用） 成分： 磷酸氢二钾 5g 多胨 7g 葡萄糖 5g 蒸馏水 1000mL 制法：溶化后校正pH，分装试管，每管1mL ，121℃高压灭菌15min。 甲基红（MR）试验：自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于36±1℃培养2～5d，哈夫尼亚菌则应在22～25℃培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，
微生物发酵过程优化控制技术进展 摘要发酵工程是生化工程和现代生物技术及其产业化的基础。在发酵工程领域，为了提高发酵水平和生产率，更多的研究工作集中在菌种的筛选和改造上。随着生物科学技术的发展，基因工程与代谢工程研究领域都出现了长足的进步与发展，利用基因重组与诱发等技术可以实现高产菌株普遍生产。但只有通过发酵过程的优化控制，才能实现产品质量最高、生产力最大、成本消耗最低的生产过程，因此对微生物发酵过程的优化控制成为发酵工程中研究人员日益关注的焦点。 关键词微生物发酵；影响因素；优化控制技术 1 培养基对发酵的影响 1.1 发酵培养基碳源和氮源的选择 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞以及形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的重要来源，与此同时，氮源也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源以及有机氮源，比如氨盐、硝酸盐、蛋白胨以及豆粉等。 1.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响 无机盐对代谢产物的生成及微生物的正常生长都具有相当重要的影响。在微生物的生长代谢过程中，磷参与了微生物细胞中核酸等辅酶的构成，是微生物能量代谢、生长的重要因素之一。在苏云金芽泡杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中包含磷酸根，所以在其发酵培养基中添加更多磷酸盐，更有利于产物苏云金素的合成。钙离子在微生物发酵过程中的主要作用是调节细胞的生理状态，比如说维持细胞的胶体状态、降低细胞膜的通透性等。与此同时，在大多数发酵培养基里面，添加适量的CaCO3，能够对发酵液含菌量的变化起到相当明显的影响，其主要原因是CaCO3的添加对发酵液的pH具有非常良好的缓冲作用，从而大大改善了菌体的生长环境。镁元素是许多酶的催化剂。锰、锌、铁、钼以及钴等元素是微生物所需要的微量元素[1]。 2 培养条件对发酵的影响 2.1 种子质量对发酵的影响 在发酵培养基中接入合适的接种量以及种龄适宜的优质种子液，能够使目标微生物更加迅速地进入到对数生长期，从而使发酵周期大大地减短，进而促使产物质量得以有效提升。如果种龄过长则会直接导致菌体过早的发生衰退，菌体的生产能力也随之而有一定程度的下降；如果种龄过短，则会直接导致菌体生长缓慢，产物合成时间大大推迟。若接种量过小，那么便会使得菌体细胞的生长量变
高中生物详尽的培养基的分类 培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳源、氮源、无机盐（包括微量元素）水以及维生素等生长因子。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。 根据培养基成分的原料来源不同，分类合成培养基、半合成培养基与天然培养基 天然培养基：利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。由化学成分不清楚或不衡定的天然有机物配制而成。成分复杂，但营养丰富全面。常用于实验研究和生产。例如，麦芽汁培养基、玉米粉培养基，以及生产中使用的麸皮、锯末等。 合成培养基：指一类由化学成分已知的有机物和无机物配制而成,又称为综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。但营养局限，微生物生长缓慢。适用于菌种分离、选育、遗传分析及生物测定等。如培养放线菌的高氏培养基、培养霉菌的察氏培养基以及各种化能自养菌培养基等。 例如，葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。 半合成培养基：由某些天然物质与少量已知成分的化学物质配制而成。营养全面，能有效地满足微生物对营养的需求。广泛应用于微生物的培养。如培养细菌用的牛肉膏蛋白胨培养基，培养霉菌的土豆葡萄糖培养基，工业生产中常用的玉米粉等天然物质加无机盐配制的各种发酵培养基等。 例如，马铃薯蔗糖培养基。 按培养基外观的物理状态进行分类可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。 液体培养基：一类呈液态的培养基。用各种营养成分加水配成，或用天然物质的浸汁(麦芽汁、豆芽汁等)制成。组分均一，适宜各类微生物的营养生长。广泛应用于实验研究及大规模工业生产中，有利于广泛获得大量菌体或代谢产物。 固体培养基：一类外观呈固态的培养基。根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤膜。在液体培养基中加入凝固剂，或用麸皮等固体原料配制。常用的凝固剂是琼脂(又称琼胶、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制成。市售琼脂为条状、片状或粉末状，主要成分为多聚半乳糖的硫酸酯，绝大多数微生物不能将其分解，在培养基中仅起支撑作用。其熔点约98℃，凝固点42℃，1.5～2％的水溶液在一般培养温度下呈凝胶状态。琼脂固体培养基广泛应用于微生物的分离培养、菌种鉴定和保藏。 半固体培养基：指液体培养基中加入0.2～0.5％琼脂制成半固体状态的培养基。用于观察细菌的运动、菌种鉴定及测定噬菌体的效价等。 根据培养基的用途(功能)，可分为选择培养基、鉴别培养基、加富培养