最佳答案
1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。
2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）
3.根据所需波长转动波长选择钮。
4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室，使空白管对准光路。
5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。
6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。
7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净
分光光度计使用的外部环境要求
分光光度计属于精密仪器，应当妥善保管和精心维护，这样才能保证分光光度计长期使用、长期的稳定可靠、测量精度高。元析公司在多年的生产和应用的过程中，得到了一套在一定环境下维护分光光度计的经验，具体如下：
1、环境温度在条件容许的情况下，尽量保持在15-30摄氏度之间，这样能保持电器件稳定工作，不易老化，使分光光度计不易损坏，灯源的使用寿命得到延长。若条件不容许，在高温的情况下，缩短开机时间，高效使用分光光度计，使电器件不要长期保持在高温下。在低温下，使预热时间比常温下的预热时间要长，这样能保证在仪器稳定的情况下进行测试。
2、环境湿度在条件容许的情况下，尽量保持在60%以下，这样能保证光度计部的光学件和电器件不易受潮、腐蚀、和上霉。若条件不容许，在高湿度和低湿度的情况尽量保持通风。
3、环境在条件容许的情况下尽量保持洁净，打扫环境时动作不宜太大，不要扬起灰尘，打扫之前用防尘罩盖上分光光度计，不要让灰尘进入分光光度计部。
以上仅就仪器使用的外部环境作了描述，以供使用用户参考。
分光光度计的使用
分光光度计的应用常识
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定围变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此围，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8
（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
蛋白质的直接定量（UV法）
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。
Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。
某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA 测
出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后1011分光光度计的重要配件——比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。
细菌细胞密度（OD 600）
实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。
分光光度计的重要配件——比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外围测试样品。
由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
分光光度技术
6.1 基本原理
利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1. 光谱：
光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。
λ＝C/ν
λ——波长C——光速ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。
光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：
E＝h?ν
H——普朗克常数（6.624×10-27尔格?秒）
ν——频率
紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm～400nm。可见光区为400nm～800nm。
组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成：
E＝E0+E平+E转+E振+E电
E0是分子在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。
分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。
按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：
E＝E2- E1＝h
E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E ＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大，E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大，E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。
可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。
与吸收光谱有关的三种电子是：
⑴二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称σ 键，构成键的电子称σ电子，如C－C、C－H键。
⑵平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称π 键，形成π键的电子称为π电子，如C=C键。
⑶未共享成键的电子，称n电子。
各种电子跃迁所需能量大小的顺序是：
n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*
紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。
如下表所示：
电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系表
电子跃迁类型例子紫外吸收波长围
σ→σ* C－H 100～150 nm
π→π*( 非共轭) C＝O ＜200 nm
π→π*( 共轭) ＝C－C＝200～300 nm
n→π* C＝O ～300 nm
π→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200～300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200～300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。
若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。
吸光度A
D
C
B
λmax λmin 波长(nm)
由上图可以看出吸收光谱的特征：
⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。
⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表示。
⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。
测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。
常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。
发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝O等发色团。
助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。
增色效应（hyperchromic effect）:
核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。
减色效应（hypochromic effect）:
在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。
2. 光吸收定律：
朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律：
A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又称光密度“O.D”。
T——透光度，T＝I / I。，I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L?mol－1?cm－1）。
b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C——样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
摩尔吸光系数：，是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常ε＝10～105：一般认为ε＞104为强吸收；ε＝103～104 为较强吸收；ε＜102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。
因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001, 所以，当b＝1cm,
ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8 mol/L。
常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%（W / V），液层厚度b＝1cm时的吸光度，以E1%λmax表示。
C——百分浓度（W / V）。
L——液层厚度，吸收杯光径长度。A——吸光度。
最大吸收波长λmax时的ε 和E1%λmax值可用下式换算：
ε＝E1%λmax×分子量/ 10
吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：
A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝
即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。
若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例如，离子交换柱层析分离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率：
m＝C?V ，∵，∴
m——溶质的量C——溶质浓度
V——溶液体积A——吸光度
ε——吸光系数b——吸收池光径
∴回收率（100%）
（上式中假设ε总和各核苷酸的ε近似相等）
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数= 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。
∵A＝εbC ∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）
∴A＝0.650－0.070＝0.580 ∵b＝1cm
∴C==7.1×10－5 mol / L
例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度为24.9（1cm吸收池，280nm），计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度。
由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法计算浓度。
∵∴∴C未知＝0.01％＝0.1mg / ml
6.2 分光光度计的组成和构造：
1. 组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。
光源单色器样品室检测放大系统显示器
国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：721、722、723等型号，紫外/可见光系列有：751、752、753、754、756等型号，主要生产厂为分析仪器总厂等。
我系1985年购买的瑞士KONTRON康强公司生产的UNICON 860型紫/可见光分光光度计，是双光束、快速自动扫描、荧屏显示的高档分光光度计。这种双光束分光光度计的特点是来自光源的连续光谱经凹面全息光栅分光后，由出射狭缝得到单色光，经过由电机带动的25周/秒左右的旋转镜分解为“样品”、“参比”光束，顺序分时通过参比池和样品吸收池，照射到光电倍增管上，由于两条光路是几乎同时测量，参比信号又不断与标准电压比较，使参比信号恒定，所以由光源、单色器、外界杂光、光电倍增管以及电源电压等带来的影响，仪器均能自动消除。最快波长扫描速度为1200nm/min，有五种测量功能和五种数据处理功能。
我系2000年购买的德国耶拿（蔡司）公司生产的SPECORD 200型高档紫外/可见光分光光度计的光路原理图如下：
SPECORD 200分光光度计的样品和参比光路，分别有各自的带温控的光电二极管检测器，因而取消了电机带动的旋转镜，大大提高了仪器的稳定性及各项检测指标，其波长围是190nm～1100nm，吸光度测定围是0～3A，可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm，仪器使用微机控制时，扫描速度最高可达6000nm/min，宽大的样品室可以安装各种附件，仪器性能优良，适合教学、科研使用。该仪器的使用说明详见附录。
2. 构造：
⑴光源：
理想光源的条件是：①能提供连续的辐射；②光强度足够大；③在整个光谱区光谱强度不随
在目标：1.掌握比色分析的基本原理 2.规范使用721型分光光度计及利用镨钕滤光片法对其波长的检测实验用品：721型分光光度计、镨钕滤光片、5%CuSO 4液、纱布、比色杯等内容： 一、721型分光光度计的使用 【原理】 利用被测物的有色溶液对某一特定波长的光谱具有选择性吸收的特性，将吸收的光谱按不同强度转变相应的电能，再将电量的变化用检流计显示出来，将显示的电量以光量强度（D或A）计算，根据朗伯-比尔定理，即D=KCL，即吸光度与溶液的浓度与厚度的乘积成正比关系。 【操作步骤】 接通电源→选择波长→粗调透光度T“O”(开盖)和透光度T“100%”(关盖)→预温20min→放入被测液→精确调节透光度T“O”(开盖)和透光度T“100%”(关盖)→测定，读取各管吸光度→收场（关电源、罩仪器罩、登记、清洗比色杯和纱布等） 【注意事项】 1.仪器需防震、防潮、避光。 2.比色时，手拿比色杯的毛面，液体倒杯高的或，比色杯不能用硬毛刷刷洗，也不能用高温烘烤。 二、721型分光光度计波长的检测与校正（镨汝滤光片法） 1.在比色槽的光路上放一张小白纸，调节波长至580nm。 2.旋动光量T100%的旋钮至最大，在小白纸上应看到桔黄色的光斑。 3.若光斑不是橘黄色，左右旋转波长调节旋钮使之出现橘黄色的光斑，粗略判断波长偏离的程度，选择检测的起始波长。
4.调节波长至起始波长，用蒸馏水或空气调T“0”和T“100%”。 5.将镨汝滤光片推入光路中，记录T或A值，退出镨汝滤光片。 6.调节波长至另一值，用蒸馏水或空气调T“0”和T“100%”。 7.再将镨汝滤光片推入光路中，记录T或A值，退出镨汝滤光片8.如此反复测定直至T值为最小或A值为最大，记录此点的指示波长。 9.将A值最大时的波长减去镨汝滤光片最大的吸收波长529nm，即得被校比色计的波长误差。 10.如波长精度超出允许误差. （360~600nm≤3nm;600~700≤5nm;700~800≤8nm），打开分光光度计左侧调节窗口盖板，用螺丝刀试调波长的调节杆。具体位置详见仪器使用说明书。 11.试调波长的调节杆后，再按步骤3~8操作，直至分光光度计的波长精度误差在其允许范围内即可。
722型光栅分光光度计使用说明（图） 1．构造原理 一、原理 当一束单色光照射待测物质的溶液时，当某一定频率（或波长）的可见光所具有的能量（h f）恰好与待测物质分子中的价电子的能级差相适应（即ΔE=E2-E1=hf）时，待测物将对该频率（波长）的可见光产生选择性的吸收。用可见分光光度计可以测量和记录其吸收程度（吸光度）。由于在一定条件下，吸光度A与待测物质的浓度C及吸收地长度l的乘积成正比，即A＝KCL 所以，在测得吸光度A后，可采用标准曲线法、比较法以及标准加入法等方法进行定量分析。 722型分光光度计由光源室、单色器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。光源为钨卤素灯，波长范围为330nm～800nm。单色器中的色散元件为光栅，可获得波长范围狭窄的接近于一定波长的单色光。其外部结构如附图所示。722型分光光度计能在可见光谱区域内对样品物质作定性和定量分析，其灵敏度、准确性和选择性都较高，因而在教学、科研和生产上得到广泛使用。
722型分光光度计 1. 数字显示器 2. 吸光度调零旋钮 3. 选择开关 4. 吸光度调斜率电位器 5. 浓度旋钮 6. 光源室 7. 电源开关 8. 波长手轮 9. 波长刻度窗10. 试样架拉手11. 100%T旋钮12. 0%T旋钮 13. 灵敏度调节旋钮14. 干燥器 2．使用方法 （1）预热仪器将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。 （2）选定波长根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。 （3）固定灵敏度档在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。 （4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”（此时试样室是打开的）。 （5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对
722N可见分光光度计使用说明书 目次 1仪器的主要用途--------------------------------------------------1 2仪器的工作环境--------------------------------------------------1 3仪器的主要技术指标及规格----------------------------------------1 4仪器的工作原理--------------------------------------------------2 5仪器的光学原理--------------------------------------------------2 6仪器的安装、使用与维护------------------------------------------3 7 仪器的调校和故障分析--------------------------------------------5 8 仪器的成套性----------------------------------------------------6 9 仪器的保管及免费修理期限----------------------------------------7 制造计量器具许可证编号： 产品执行标准的编号：Q/YXLZ50-2004
1仪器的主要用途 722N可见分光光度计能在近紫外、可见光谱区域对样品物质作定性和定 量的分析。该仪器可广泛地应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部门，是理化实验室常用的分析仪器之一。 2仪器的工作环境 仪器应安放在干燥的房间内，使用温度为5℃～35℃，相对湿度不超过 85%。 使用时放置在坚固平稳的工作台上，且避免强烈的震动或持续的震动。 室内照明不宜太强，且避免直射日光的照射。 电扇不宜直接向仪器吹风，以免影响仪器的正常使用。 尽量远离高强度的磁场、电场及发生高频波的电器设备。 供给仪器的电源电压为AC220V22V，频率为50Hz1Hz，并必须装有良好的接地线。 推荐使用交流稳压电源，以加强仪器的抗干扰性能。使用功率为1000W以上的电子交流稳压器或交流恒压稳压器。 2.7避免在有硫化氢、亚硫酸氟等腐蚀气体的场所使用。 3仪器的主要技术指标及规格 仪器类别：2类 光学系统：单光束、衍射光栅。 波长范围：330nm～800nm。 光源：钨卤素灯12V30W。 接收元件：光电池。 波长准确度：2nm。 波长重复性：≤1nm。 光谱带宽： 5nm。 杂光：≤%（在360nm处）。 透射比测量范围：%～%。 吸光度测量范围：～。 浓度直读范围：0000～1999。 透射比准确度：%。 透射比重复性：≤%。 噪声：100%噪声≤%，0%噪声≤%。 稳定性：亮电流≤%/3min， 暗电流≤%/3min。 电源：AC220V22V， 50Hz1Hz。
第一章：产品概述 产品原理： 分光光度计的原理是利用物质对不同波长的选择性吸收现象对物质进行定性和定量分析，通过对吸收光谱的分析，普安短物质的内部结构及化学组成。 光谱系列紫外/可见分光光度计就是根据以上原理，将传统的设计制造经验与现代精密光学和最新微电子等高新科学技术合理的结合在一起，研制开发的具有当代先进水平的新型分光光度计，是化工、药品、生化、冶金、轻工、材料、环保、食品、制药以及教学等行业的必备仪器。 产品特点： 光谱系列紫外/可见分光光度计具有以下特点： 采用经改良的低杂散光、高分辨率的单光束光路以及简捷、可靠的结构设计，使仪器具有良好的单色性、稳定性、重现性和精确的测量读数。2-4nm的光谱带宽可满足大多数分析测试项目的要求。 新型微机技术的运用，使仪器具有自动设置0%T和100%T、浓度计算和数据处理、自动校正波长，自动切换滤光片，自动光源切换点、自动显示出错信息等功能。科学的设计，新技术的运用，将光、机、电以及微机技术有机的结合在一起，使仪器的稳定性指标接近或达到高级紫外可见光光度计的水平。 一起选用2×20位大屏幕点阵式带背光显示器，可现实透射比、吸光度、浓度、波长等参数，还实现了仪器人机对话功能和连接PC等功能。仪器安装了标准的RS—232C通讯接口，可向计算机输送测试参数，并可接受计算机发送的控制指令（需使用SPECTRUM用户应用软件），实现PC机对仪器进行直接操作。外接打印机，可打印实时测试参数。 仪器附有可在视窗95（WIN95）操作平台运行的PC—SPECTRUM基本应用软件，可进行透射比、吸光度测试，浓度计算和直读，并可以打印，保存和调用测试参数，使使用者轻松、方便、准确、可靠地进行分析。 仪器各部件介绍
原子吸收分光光度法测定溶液中CU含量 一、实验目的 1．掌握原子吸收分光光度法的特点及应用； 2．了解原子吸收分光光度计的结构及其使用方法。 二、实验原理 原子吸收光谱分析是基于从光源中辐射出的待测元素的特征光波通过样品的原子蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，使通过的光波强度减弱，根据光波强度减弱的程度，可以求出样品中待测元素的含量。 利用锐线光源在低浓度的条件下，基态原子蒸气对共振线的吸收符合朗伯—比尔定律，即： A=lg(I0/I)=KLN0 （1） 式中，A为吸光度，I0为入射光强度，I为经原子蒸气吸收后的透射光强度，K为吸光系数，L为辐射光穿过原子蒸气的光程长度，N0为基态原子密度。 当试样原子化，火焰的绝对温度低于3000K时，可以认为原子蒸气中基态原子的数目实际上接近原子总数。在固定的实验条件下，原子总数与试样浓度c的比例是恒定的，则等式（1）可记为 A==K’c (2) 式(2)就是原子吸收分光光度法定量分析的基本关系式。常用标准曲线法、标准加入法进行定量分析。 三、仪器与试剂 1.原子吸收分光光度计 2.标准溶液1～4号 3.样品溶液1～2号 四、操作步骤 1.开机前先检查水封是否有水，乙炔管道有无泄漏（空气中有无乙炔气味） 2.打开抽风机 3.打开电脑以及原子吸收分光光度计电源开关 4.分析方法设计
进入软件→点文件→选择新建→选择分析方法（火焰法、石墨法、氢化物法等）→分析任务选择（Cu、Pb、Ca等）→填写数据表（批数、个数、测量次数、稀释倍数）→展开→完成→仪器控制→点击自动波长→精调→完成→检测（准备两杯水，一杯调零，另一杯洗样管） 5.将元素灯预热30min 6.打开空压机，将压力调到0.3Mpa 7.打开乙炔钢瓶阀，将出气阀压力调到0.05～0.06Mpa之间 8.调整燃烧器高度，对好光路 9.旋开仪器上的乙炔伐，按点火开关，点火，调节火焰大小，开始检测 10.标准空白（纯水）读数5次，平均 11.标液1～标液4各读数5次，平均 12.建立标准曲线，相关系数应在0.995以上。 13.未知样品读数5次，平均。从标准曲线中求得结果。 14.检测完毕后，保存数据 15.点火吸去离子水10min，在关乙炔伐，使管道中气体烧完再关仪器、电脑、空压机。 五、结果处理 1.记录操作条件 灯电流 燃烧器高度 狭缝宽度 乙炔流量 空气流量 2.根据标准曲线计算样品中Cu含量。
UVPROBE简易操作手册 第1章：初始画面 第2章：装置的连接 第3章：测定 第4章：光谱测定方式 4-1参数和显示的设置 4-2光谱测定 4-3数据处理功能 1．波长范围和纵轴范围的变更 2．峰谷检测 3．光谱线色彩的改变等 4．面积计算 5．数据计算 6．其他 第5章：光度分析方式 5-l参数和显示的设置 5-2定量测定 第6章：动力学方式 第1章：初始画面 启动UVPROBE以后，出现上示的对话窗口，需要输入设定的用户名和密码，然后点击确定健。 测量前注意事项 1、测量前先打开仪器，再打开计算机，测量完成后确认样品室内无样品后，关上样品室盖，先关闭计算机再关闭仪器。 2、电压不稳定一定要使用镇压器，否则将烧坏仪器保险丝。 3、样品池内溶液不要超过池容积的4/5，样品池放入样品室前外部要擦干。测量完毕后，比色皿要冲洗干净。 4、定期检查干燥剂情况，若已经变色要更换。
5、使用大样品室要把检测器切换到EXT状态，使用完后要拨到INT状态。 6、测量时，波长范围的边界要尽量避开检测器和光源更换时的波长。 第2章：装置的连接 首先从下拉式菜单的仪器项上追加需要的仪器。操作完毕如下图①所示，加装了UV-1650、UV- 2550、UV- 2450以及UV- 3150；使用时点击实际连接的仪器，例如下图的UV- 2450，然后点击上图的连接键②，这样装置与PC机连接（当然，中间的通讯电缆的连接、通讯口的指定等都是必须的，此处不再赘述）并开始下示的初始化面。 使用大样品室时，首先安装光路转换器（下图左），然后将检测器切换按钮拨到EXT档（下图右），测 量完毕后需要将检测器切换按钮又拨回到INT档上。 初始化大约需要5分钟左右，进行一系列的检查和初置，如一切顺利通过就可以开始测定。若某些项 检测失败，请检查光源是否正常发光和干燥剂是否放置正确。
721可见分光光度计使用方法 一、开机预热 仪器在使用前应预热30分钟。 二、波长调整 转动波长旋钮，并观察波长显示窗，调整至需要的测试波长。 注意事项：转动测试波长调100%T/0A后，以稳定5分钟后进行测试为好(符合行业标准及质监局检定规程要求)。 三、设置测试模式 按动“功能键”，便可切换测试模式。相应的测试模式循环如下：*开机默认的测试方式为吸光度方式 四、结果打印(721型无此功能) 在得到测试结果后按动“打印”键便可打印结果(需外接标准串行打印机)。 五、光源切换(适用于752、754、755B型) 因为仪器在紫外区和可见区使用不同的光源，所以需要波动光源切换杆来手动的切换光源。建议的光源切换波长为340nm，即200nm-339nm适应氘灯，340nm-1000nm使用卤素灯。 注意事项：如果光源选择不正确，或光源切换杆不到位，将直接影响仪器的稳定性。特殊测试要求除外。 六、比色皿配对性 仪器所附的比色皿是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。适应比色皿一套两只，供紫外光谱区使用，置入样品架时，两只石英比色皿上标记Q或箭头方向要一致。玻璃比色皿一套四只，供可见光谱区使用。 石英比色皿和玻璃比色皿不能混用，更不能和其他不经配对的比色皿混用。用手拿比色皿应握比色皿的磨砂表面，不应该接触比色皿的头光面，即透光面上不能有手印或溶液痕迹，待测溶液中不能有气泡、悬浮物，否则也将影响样品的测试精度。比色皿在使用完毕后应立即清洗干净。 七、调T零(0%T) 1.在T模式时，将遮光体置入样品架(如图七所示)，合上样品室盖，并拉动样品架拉杆使其进入光路。然后按动“调0%T”键，显示器上显示“00.0”或“-00.0”，便完成调T零，完成调T零后，取出遮光体。 注意事项：1.测试模式应在透射比(T)模式； 2.如果未置入遮光体合上样品室盖，并使其进入光路便无法完成调T零；
第四章比色分析及分光光度法 Colorimetric and Spectrophotometric Analysis §1 概述 许多物质本身具有明显的颜色，例如KMnO4溶液显紫色，K2Cr2O7溶液显橙色等。另外，有些物质本身并无颜色，或者颜色并不明显，可是当它们与某些化学试剂反应后，则可以生成有明显颜色的物质，例如Fe3+本身具有黄色，当与一定量的KSCN试剂反应后，生成的Fe(SCN)3具有血红色；浅蓝色的Cu2+与氨水作用后，则生成深蓝色的Cu(NH3) 42+。当这些有色物质溶液的浓度改变时，溶液颜色的深浅液会改变。浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，可以肯定地说，溶液颜色的深浅与有色物质的含量之间有一定的关系。在分析化学中，把这种基于比较有色物质溶液的颜色深浅以确定物质含量的分析方法称为比色分析。 实践证明，无论物质有无颜色，当一定波长的光通过该物质的溶液中时，根据物质对光的吸收程度，也可以确定该物质的含量。这种方法称为分光光度法。目前的比色分析常用分光光度计将光源变为单色光，并选择对待测物质具有最大吸收的单色光进行比色测定。 比色分析法、分光光度法与前面所讲的容量分析法、重量分析法相比，具有以下优点：1.灵敏度高比色分析法和分光光度法测定物质的浓度，下限一般可以达到10-5～10-6 mol/L，可以测定相当于含量0.001～0.0001%的微量组分。如果将被测物质加以富集，灵敏度还可以提高。 2.准确度高一般比色分析的相对误差为5～20%，分光光度法的相对误差为2～5%，其准确度虽不如容量分析及重量分析，但对微量组分来说，这个灵敏度还是可以的，因为微量组分用容量分析及重量法已无法测定，更谈不上准确了。例如1滴KMnO4滴入100mL水中时，仍可得到明显的适于比色分析的颜色，但这一滴溶液在滴定分析中只相当于它的误差的大小，根本无法进行准确测定。由此看来，比色法的准确度较高，可进行微量组分的分析。 3.操作简便，测定速度快比色法和分光光度法的仪器设备都简单，操作方便。进行分析时，试样处理成溶液后，一般只经历显色和比色两个步骤，就可得出分析结果。近年来，由于新的灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，使得一些干扰物可以不经分离，既可以进行测定。在生产过程的分析中，一般只要几分钟就可以得出结果，对于生产中的快速分析，起了很大的作用。 4.应用广泛几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用比色法和分光光度法进行测定，由此可见，比色及分光光度法应用范围之广泛。在环境监测中，适用最多的也是分光光度法，绝大多数污染物都可以用分光光度法测定，大多数中小型实验室都可以配备分光光度计，因此不受仪器设备条件的限制。
原子荧光分光光度计 一、发展历程 1859年克希霍夫研究太阳光谱时开始原子荧光理论的研究。 1964年,Winefordner和Κuga首先提出用原子荧光光谱（AFS)作为分析方法的概念。1969年,Holak研究出氢化物气体分离技术并用于原子吸收光谱法测定砷。 1974年,Tsujiu将原子荧光光谱和氢化物气体分离技术相结合，提出了气体分离-非色散原子荧光光谱测定砷的方法，这种联合技术就是现代常用氢化物发生-原子荧光光谱（HG-AFS)。 1982年郭小伟（西北有色地质研究所）和张锦茂（地矿部物化探研究所）两个研究小组合作，研制成功了世界上首台以溴化物无极放电灯作激发光源的“WYD^2型蒸气发生-双道原子荧光光谱仪”。该仪器采用微波激发无极放电灯作为激发光源、自行研制的高温石英管原子化器、间断法氢化反应发生器，可同时测定两个可形成氢化元素及汞原子的原子荧光光谱仪。与此同时，张锦茂、范凡等开展了地球化学样品中As，Sb，Bi，Hg等两种元素同时测定分析方法的研究，取得了令人满意的分析结果。使其成为地矿部开展《20万区域化探全国扫面计划》找矿的重要配套仪器及分析方法，随即将科研成果迅速地转化为商品化仪器，按地矿部统一部署转让给北京地质仪器厂。 1985年开始由北京地质仪器厂（随后脱离出海光仪器公司）和江苏宝应仪器（种种原因到现在就没有发现该公司）进样系统以小蠕动泵为主并投入批量生产。 1995年以郭小伟为首西北有色金属研究院成立金索坤技术有限公司（不知道什么原因到目前为止市场占有率极低，目前也只有蠕动泵的产品）。 1996年北分瑞利公司与著名原子荧光光谱专家张锦茂先生合作，成功研制以蠕动泵为主的原子荧光（不知道什么原因现在市场占有率也不是很理想）；随后北京东西电子研究所也推出以蠕动泵为主的原子荧光（不知打什么原因现在市场占有情况不是很理想）。 1998年，加拿大Aurora公司也推出了一款蒸气发生-原子荧光光谱仪，该仪器的性能基本上接近于我国早期同类型仪器的水平。所以国外原子荧光水平和国内至少相差15年左右。 1999年，北京有色金属研究院为了进一步提高空心阴极灯的辐射强度，满足原子荧光分析高灵敏度的需求，在我国早期吴廷照、高英奇研制成功的原子吸收高性能空心阴极灯[13]基础上结合原子荧光的特点，研制成功了用于原子荧光的“高性能空心阴极灯”。一直沿用至今（随后各厂家为灯添加特殊代码，实验灯的自动识别）。其中光源直接决定检测结果，未来发展发向是一种新型的激发光源，其性能具有单色性好、相干性强、方向集中和功率密度高等优点，但是价格也就不说咯。 2000年以刘明钟（海光第一任老总）为首成立北京吉天仪器有限公司。随后为原子荧光推出入双注射泵进样系统（目前市场占有率较高）；随后普析也开始开展原子荧光的业务（目前市场占有率不是很理想）。 2005年北分瑞利成功研制推出第一台联用技术原子荧光光谱仪。随后几年内海光吉天普析等厂家也顺利推出该仪器。（为原子荧光测试重金属不同价态含量做出重要贡献）。 2006年北京路捷仪器有限公司（目前北京锐光仪器有限公司）成立致力于原子荧光各基础核心部件改进研发，并多次拿得国家重大专项目，协助制定多项有关原子荧光应用标准。并将成熟技术以授权于其他厂家使用带来良好效果。
UV2600型紫外分光光度计操作规程 一、开机 1.打开仪器电源。 2.打开电脑，点击UV Analyst 进入光谱分析软件。 3.软件将自动搜索仪器端口，点击“联机”，软件与仪器联机成功。 二、选择测试模式 根据实验需求选择测试模式。仪器提供的测试模式有“波长扫描”“时间扫描”“定点测量”“定量测量”“核酸测量”和“蛋白质测量” 【波长扫描】主要用以检测样品对一定范围波长光的吸收情况，以便对样品进行定性测量。 1.点击左侧主功能栏中的“波长扫描”即可进入波长扫描界面。 2. 根据实验要求，在“设置”设定检测参数。 3. 在样品室内参比及检测光路同时放入装有空白溶液的比色皿。 4. 点击“基线测量”以扣除空白的背景吸收。 5. 将检测光路中的空白溶液换成待测样品。 6. 点击“扫描”。以完成样品波长扫描检测。 7. 点击“保存”并选择保存路径即可保存谱图。 注意：在“基线测量”中所选择的基线必须与参数设置中基线一致！ 【时间扫描】是检测样品在特定波长范围内吸光度（或透过率）随时间的推移而发生变化情况。主要用以检测样品的稳定性或进行化学动力学研究。 1. 点击左侧主功能栏中的“定量测量”即可进入定量测量界面。 2. 根据实验要求，在“设置”设定检测参数。 3 在样品室内参比及检测光路同时放入装有空白溶液的比色皿。 4. 点击“基线测量”以后扣除样品空白的背景吸收。 5. 将检测光路中的空白溶液换成待测样品。 6. 点击“扫描”。以完成样品波长扫描检测。 7. 点击“保存”并选择保存路径即可保存谱图。 【定点测量】是检测样品在特定波长中的吸光度（或透过率）。 1. 点击左侧主功能栏中的“定量测量”即可进入定量测量界面。 2. 根据实验要求，在“设置”设定检测参数。 3. 在样品室内参比及检测光路同时放入装有空白溶液的比色皿。 4. 点击“自动校零”，以扣除该波长中空白溶液的背景吸收。 5. 将检测光路中的空白溶液换成待测样品。 6. 点击“测量”，以完成样品的吸光度（或透过率）的测量。 7. 点击“保存”并选择保存路径即可保存测量结果。 【定量测量】可通过检测标准样品或输入特定的系数建立标准曲线后测量样品的浓度值。
72型分光光度计工作原理 72型分光光度计是可见光分光光度计，波长范围为420nm～700nm，它由三大部分组成:磁饱和稳压器、光源、单色光器和测光机构、微电计。 72型分光光度计的基本依据是朗伯—比耳定律，它是根据相对测量原理工作的，即先选定某一溶剂作为标准溶液，设定其透光率为100%，被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的，即让单色光分别通过被测试样和标准溶液，二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。如图所示，白色光源经入射狭缝、反射镜和透光镜后，变成平行光进入棱镜，色散后的单色光经镀铝的反射镜反射后，再经过透镜并聚光于出射狭缝上，狭缝宽度为0.32nm。反射镜和棱镜组装在一可旋转的转盘上并由波长调节器的凸轮所带动，转动波长调节器便可以在出光狭缝后面选择到任一波长的单色光。单色光透过样品吸收池后由一光量调节器调节为适度的光通量，最后被光电电池吸收，转换成电流后由微电计指示，从刻度标尺上直接读出透光率的值。 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被
吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。 事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值 1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗
754紫外-可见分光光度计操作规程 用途：能在紫外、可见光谱区域对样品物质作定性和定量的分析。 波长范围：200nm-800nm。 操作要点： 3、插上电源，打开开关，打开试样室盖，按“A/T/C/F”键，选择“T%”状态，选择测量所需波长，预热30分钟。 4、开始测量时要先调节仪器的零点，方法为： 保持在“T%”状态，当关上试样室盖时，屏幕应显示“100.0”，如否，按“OA/100%”键；打开试样室盖，屏幕应显示“000.0”，如否，按“0%”键，重复2-3次，仪器本身的零点即调好，可以开始测量。 3、用参比液润洗一个比色皿，装样到比色皿的3/4处（必须确保光路通过被测样品中心），用吸水纸吸干比色皿外部所沾的液体，将比色皿的光面对准光路放入比色皿架，用同样的方法将所测样品装到其余的比色皿中并放入比色皿架中。 7、将装有参比液的比色皿拉入光路，关上试样室盖，按“A/T/C/F”键，调到“Abs”，按“OA/ 100%”键，屏幕显示“0.000”，将其余测试样品一一拉入光路，记下测量数值即可（不可用力拉动拉杆）。 8、测量完毕后，将比色皿清洗干净（最好用乙醇清洗），擦干，放回盒子，关上开关，拔下电源，罩上仪器罩，并打扫卫生，才可离开。 9、本操作要点只针对测量吸光度而言。 注意事项：
7、仪器使用前需开机预热30分钟 8、开关试样室盖时动作要轻缓 9、不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器 10、一定要将比色皿外部所沾样品擦干净，才能放进比色皿架进行测定 11、有任何疑问请报告指导老师 12、使用完毕请认真填写《仪器设备使用登记簿》，并交指导老师签字。
1.正磷酸盐含量的测定 （1）方法提要 在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵反应生成黄色的磷钼杂多酸，再用抗坏血 酸还原成磷钼蓝，于710nm最大吸收波长处用分光光度法测定。 （2）试剂和材料 a.磷酸二氢钾； b.硫酸溶液（1+1）； c.抗坏血酸溶液（20g/L）：称取10g抗坏血酸，精确至0.5g，称取0.2g乙二 胺四乙酸二钠（C10H14O8N2Na2.2H2O），精确至0.01g，溶于200mL水中，加入8.0mL甲酸，用水稀释至500mL，混匀，贮存于棕色瓶中（有效期一 个月）； d.钼酸铵溶液（26g/L）：称取13g钼酸铵，精确至0.5g，称取0.5g酒石酸锑 钾（KSbOC4H4O6.1/2H2O）,精确至0.01g，溶于200mL水中，加入230mL 硫酸(1+1)溶液，混匀，冷却后用水稀释至500mL，混匀，贮存于棕色瓶中 （有效期两个月）； e.磷标准贮备溶液（1mL含有0.5mgPO43-）:准确称取0.7165g预先在 100~105℃干燥并已恒重过的磷酸二氢钾，精确至0.0002g，溶于约500mL水中，定量转移至1L容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀； f.磷标准溶液（1mL含有0.02mgPO43-）：取20.00mL磷标准贮备溶液于 500mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 （3）仪器和设备 分光光度计：带有厚度为1㎝的吸收池。 （4）分析步骤 a.工作曲线的绘制：分别取0.00（空白），1.00mL，2.00mL，3.00mL， 4.00mL， 5.00mL， 6.00mL， 7.00mL， 8.00mL磷标准溶液于9个50mL容量 瓶中，依次向各瓶中加入约25mL水、2.0mL钼酸铵溶液，3.0mL抗坏血酸溶液，用水稀释至刻度，摇匀，于室温下放置10min.在分光光度计710nm处， 用1㎝吸收池，以空白调零测吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，相对应的 PO43-量（μg）为横坐标绘制工作曲线。 b.正磷酸盐含量的测定：从试样中取20.00mL试验溶液，于50mL容量瓶中， 加入2.0mL钼酸铵溶液，3.0mL抗坏血酸溶液，用水稀释至刻度，摇匀，室温 下放置10min。在分光光度计710nm处，用1㎝吸收池，以不加试验溶液的空白调零测吸光度。 （5）分析结果的表述 以“mg/L”表示的试样中正磷酸盐（以PO43-计）的质量浓度X1按下式计算 X1= m1/V1 式中m1------从工作曲线上查得的以“μg”表示的PO43-量； V1-----移取试验溶液的体积，mL。
UV-762紫外可见分光光度计使用说明 一.仪器的特点 UV762是一台双束光扫描型紫外可见分光光度计，具有较宽的光谱范围和优良的平直。仪器内微处理机系统，优良的光学、电路系统和合理的机械结构，并采用大屏幕液晶显示。 二.仪器键盘简介 F1测试数据类型选择：τ（T）（透射比） F2测试数据类型选择：Abs（吸光度） F3测试数据类型选择：Conc（浓度） F4对所测数据进行打印输出 [GOTO WL]在仪器进行单波长测定时，若准备变化一个工作波长点，按此键能重新设定一个新的工作波长。 [AUTO ZERO]该键为自动校零键，进行定量测定过程中按此键，即自动校正零点τ（T）=100%或A=0.000 [MODE]该键在任何情况下按下则可返回上一级菜单。 [START/STOP]运行键和程序动作停止键。在完成一个测定过程的参数输入后，按此键，仪器就执行所设定的程序。或当完成一个测定过程后，若要继续下一个测定过程，只要再按此键，就可以继续测定一次。如完成一个扫描测定样品以后，按下此键，可以再进行下一个样品的测定。或向停止正在进行的程序动作，按此键，仪器当前的测定程序即停止。 三.仪器操作步骤 1. 开机开机前将样品室内的干燥剂取出，确认电源是否连接。打开仪器电源开关，等待仪器自检通过(6 个自检项目均出现OK 字样)，自检过程中禁止打开样品室。开机自检程序完成，经30min 热稳定后，可以进入正常测量。 2. 使用仪器预热结束后，屏幕进入主菜单，显示如下7 个功能项：1. 光度测 量；2.光谱测量；3.定量测量；4.动力学测量；5.数据处理；6. 多波长测量； 7.系统状态设置。移动光标，按相应选项，即可进入该选项的下一级子菜单。
722型分光光度计的使用方法 一、测量原理 分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A 与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b(cm)成正比。其定律表达式A=abc （a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，比例系数用ε表示，则A=εbc称为摩尔吸光系数。其单位为L·mol-1·cm-1它是有色物质在一定波长下的特征常数。 T(透光率)=I/I0 A(吸光度)= -lgT 或A=K·C·L(比色皿的厚度) 测定时，入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定，“L”、“I0”也一定。只要测出A即可算出“C”。 《分光光度计的表头上，一行是透光率，一行是吸光度。》 二、722型分光光度计的使用 1、将灵敏度旋钮调至“1”档（信号放大倍率最小）。 2、开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至到测试用波长。仪器预热20分钟。 3、打开试样室（光门自动关闭），调节透光率零点旋钮，使数字显示
为000.0。（调节100%T旋钮），盖上试样室盖，将比色皿 架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率100%旋钮使数字显示100.0。如显示不到100.0，则可适当增加微电流放大的倍数。（增加灵敏度 的档数同时应重复（3）调节仪器透光率的“0”位）但尽量使倍率置于低档使用。这样仪器会有更高的稳定性。 4、预热后，按（3）连续几次调整透光率的“0”位和“100%”的位置，待稳定后仪器可进行测定工作。 三、吸光度“A”的测量 将选择开关置于A 。调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为零，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。 四、浓度c的测量 将选择开关由“A”旋至“C”将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。 注意事项： 1、测量完毕，速将暗盒盖打开，关闭电源开关，将灵敏度旋钮调至最低档，取出比色皿，将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内，关上盖子，将比色皿中的溶液倒入烧杯中，用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。 2、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。
分光光度计实验报告
实验六 分光光度法测溴酚蓝的电离平衡常数 王思雨 PB12207007 中国科学技术大学生命科学院 摘要 本实验中我们通过使用722型分光光度计测量出了溴酚蓝(Bromphenalblue)的最大吸收波长，并了解了溶液浓度对λmax 的影响 以及酸度对B.P.B 的影响和用缓冲溶液调节溶液酸度的方法。 关键词 分光光度计 溴酚蓝 电离平衡常数 1．前言 本实验用分光光度法测定弱电解质溴酚蓝的电离平衡常数。溴酚蓝是一种酸碱指示剂，本身带有颜色且在有机溶剂中电离度很小，所以用一般的化学分析法或其他物理化学方法很难测定其电离平衡常数。而分光光度法可以利用不同波长对其组分的不同吸收来确定体系中组分的含量，从而求算溴酚蓝的电离平衡常数。 溴酚蓝在有机溶剂中存在着以下的电离平衡： HA H ++A － 其平衡常数为： K a =+-[H A HA ][][] (6－2) 溶液的颜色是由显色物质HA 与A －引起的，其变色范围PH 在 3.1～ 4.6之间，当PH ≤3.1时，溶液的颜色主要由HA 引起的，呈黄色；在PH ≥4.6时，溶液的颜色主要由A －引起，呈蓝色。实验证明，对蓝色产生最大吸收的单色光的波长对黄色不产生吸收，在其最大吸收波长时黄色消光为0或很小。用对A －产生最大吸收波长的单色光测定电离后的混合溶液的消光，可求出A －的浓度。令A －在显色物质中所占的分数为X ，则HA 所占的摩尔分数为1－X ，所以 K X X a =--1[]A (6－3) 或者写成： lg PH lg 1a X K X =+- (6－4) 根据上式可知，只要测定溶液的PH 值及溶液中的[HA]和[A －]，就可以计算出电离平衡常数Ka 。 在极酸条件下，HA 未电离，此时体系的颜色完全由HA 引起，溶
原子吸收分光光度计操作规程 ⒈压缩机打开供应干净干燥的助燃气，压力控制在0.35±0.03MPa。 ⒉开启灯架门，拧下固定空心阴极灯的螺帽，插好空心阴极灯，将螺帽拧回，记好灯所插的灯架位置，关好灯架门。 ⒊打开抽烟机、原子吸收分光光度计和电脑，点击电脑桌面上的中文版AA6300客户端图标，出现“WizAArd注册”窗口，无密码，直接点击“OK”，出现“WizAArd选择”对话框，如果是第一次测定的金属元素，双击“元素选择”即可；如果是曾经检测过的金属元素，可以点击“新近模板”，套用以前设定好的程序。 ⒋点击“元素选择”出现“元素选择”对话框，点击对话框中的“连接”键，电脑与原子吸收分光光度计进行连接检测，出现“初始化”界面，此界面除“ASC检查”和“GFA检查”为红色外，其余均应为绿色，其中当检测到燃气压力、助燃气压力和废液探头时，系统会提示是否检测，如果仪器在正常使用时，可以点击“否”，省略检测，如果仪器长时间不用，需要点击“是”，进行检测，以检查三项是否有问题存在，防止发生事故。全部检测完后，点击“OK”。 ⒌“初始化”结束后，出现“火焰分析的仪器检查目录”，在确认仪器在完善了检查目录中九项的要求，在九项目录前打勾，点击“OK”，退出“火焰分析的仪器检查目录”对话框。 ⒍“连接”检测完毕后，回到“元素选择”对话框，点击“选择元素”，出现“装载元素”窗口，在元素域中可以直接输入所要检测的元素符号，也
可在元素域的下拉菜单中寻找，还可点击“周期表”，从周期表中选择；然后选择“火焰连续”和“普通灯”。选择后点击“确定”。 ⒎进入“编辑参数”的“光学参数”窗口，修改点灯方式(检测锰元素用NON-BGC，检测铁元素用BGC-D2),点击灯位设置，出现灯位位置窗口（点击灯位设置，灯架可以转动），将在装灯的插座号后的元素框中的下拉菜单中选择所要检测元素，点击“OK”，回到“光学参数”界面，在“点灯”上打勾，此时空心阴极灯点亮；然后点击“谱线搜索”键，出现“谱线搜索”窗口，系统自动进行搜索，直到“谱线搜索”和“光束平衡”都出现“OK”，谱线正常时，点击“关闭”键，回到“光学参数”窗口。 ⒏在“编辑参数”中点击“重复测定条件”，在该窗口中的“空白”、“标准”、“样品”中根据需要设定重复次数，最大重复次数也相应变化，也可增加最大重复次数在重复次数的结果达不到RSD界限值（重复性）时，将自动按照最大重复次数再次检测“空白”、“标准”、“样品”。 RSD界限值可以根据国家标准通过试验方法的重复性公式推出，设置完成后点击“OK”。 ⒐在“编辑参数”中点击“测定参数”，在窗口中修改“重复次序”为“SM-M-M。。。”，预喷雾时间为3秒，积分时间为5秒，响应时间为1。 ⒑在“编辑参数”中点击“校准曲线参数”，在窗口中根据需要修改“浓度单位”，将校准曲线次数定为1st，在零截距上不用标记任何符号。 ⒒回到“元素选择”界面，点击“下一步”，出现“制备参数”窗口，点击“标准曲线设置”，根据所配备标准工作曲线溶液的数量修改“标准曲线的测定次序”中的“行数”，更新，并将“实际值”输入，点击“OK”；回到“制
可见光分光光度计的操作方法 学时：2学时 一、实验原理 利用可见光等测定物质的吸收光谱，利用此光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法，使用的仪器是分光光度计。分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，是生物化学研究中必不可少的基本手段之一。 可见光光谱：光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。λ=C/V 其中，λ-波长；C-光速；V-频率；单位时间要通过一个定点的波数。可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。 根据朗伯-比尔（Lambert- Beer）定律：A=εbc，（A为吸光度，ε为摩尔吸光系数，b为液池厚度，c为溶液浓度）可以对溶液进行定量分析。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率越大，通常ε=10～105：一般认为ε>104为强吸收；ε=103～104为较强吸收；ε<102为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。通常使用分光光度计可检测出的最小吸收度A=0.001，所以b=1cm，ε=105时，可检测的溶液最小浓度是C=10-8mol/L。 二、分光光度计的基本参数和组成与构造 1. 722S可见光分光光度计的基本参数 波长范围：340-1000nm 波长精度：±2nm（360-600nm） 表面刻度：（T）0-100%（A）0-2 2. 组成与结构 各种型号的分光光度计不论是何种型式，基本上都是由五部分组成：（1）
紫外可见分光光度计的使用方法 1、电源开关,使仪器预热20分钟; ?仪器接通电源后,仪器即进入自检状态,自检结束后波长自动停在546nm处,测量的方 式自动设定在透射比方式(%T),并自动调100%与0%T。 注意:①开机前,先确认仪器样品室内就是否有东西挡在光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。 ②检查透过率模式下,挡光位置,透过率就是否显示00、0%T。否则要调整暗电流,按“0%T”键,使透过率显示为00、0%T。返回对光位置时仍能显示100、0%T,否则重新调100%T。通过“▲”与“▼”键,设定测试波长;按“100%T”键,使透过率显示为100、0%。 如果您要获得被测样品的透射比参数时(透射比方式):T 2、按方式键“MODE”将测试方式设置为透射比方式: ?显示器显示“ 3、按波长设置键“▲”或“▼”设置您想要的分析波长,如340nm; ?按波长设置键“▲”或“▼”直到显示器显示“340nm xxx x%T” ?每当波长被重新设置后,请不要忘记调整“100、0%T”。 4、将您的参比溶液与被测溶液分别倒入比色皿中; ?比色皿内的溶液面高度不应低于25毫米,大约25毫升。否则,会影响测试参数的精确度。 ?被测试的样品中不能有气泡与漂浮物,否则,会影响测试参数的精确度。 5、打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中,盖上样品室盖。 ?一般情况下,参比样品放在样品架的第一个槽位中。 ?被测样品的测试波长在340nm—1000nm范围内时,建议使用玻璃比色皿,被测样品在190nm—340nm范围内时,建议适用石英比色皿。 ?仪器所附的比色皿,其透射率就是经过测试与匹配的,未经匹配处理的,比色皿将影响样品的测试精确度。 ?比色皿的透光部分表面不能有指印、溶液痕迹。否则,将影响样品的测试精确度。 6、将参比溶液推入光路中,按“100%T”键调整零ABS。 ?仪器在自动调整100%T的过程中,显示器显示“ 340nm Blank 、、、”当100、0%T调整完成后,显示器显示“340nm 100、0%T”