RNA剪接因子hnRNP的结构与功能研究进展
动物遗传育种刘小艳 2005414
摘要RNA剪接是一个多步骤、形成多种中间状态复合物的复杂过程，尽管在已经发现的一百多种pre-mRNA剪接相关因子中，仅研究了约8%相关蛋白质的空间结构，已充分显示对剪接相关因子三维晶体结构以及溶液结构的测定与研究，在理解RNA剪接的复杂机理以及生物学特性中具有不可替代的重要意义．
关键词RNA剪接，hnRNA结合蛋白，剪接体，晶体结构，溶液结构
原核生物中mRNA的转录与翻译几乎是同步发生的，而真核生物，转炉是发生在细胞核内，翻译则在核外进行。真核生物RNA尤其mRNA分子的寿命较长，在5’和3’两个末端都要受到修饰。而RNA剪接(RNA splicing)是tRNA、rRNA，特别是mRNA加工与成熟的重要生物学过程，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。RNA剪接需要多种因子参与，包括杂性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，结合蛋白hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)，小型核RNA (small nuclear RNA，snRNA)，结合蛋白snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)等。在真核细胞内，RNA原初转录物的分子很大，通过剪接产生成熟的mRNA分子。hnRNP与hnRNA结合形成核酸蛋白质复合物hnRNPP(hnRNP particles)可穿梭于细胞核与胞质之间，具有转运和剪接RNA的作用。另一方面，snRNP与细胞核内snRNA (分子质量为100-200 nt 的小RNA)紧密结合，而构成核内小核酸蛋白质复合物snRNPP(snRNP particles)，参与RNA剪接、多聚腺苷化以及转录拷贝3’端的成熟。
最近，Reed等通过蛋白质组学方法证明，与pre-mRNA剪接相关的蛋白质因子大约有145种，它们参与RNA剪接过程中的不同环节[1]。托普霉素亲和层析［2］(tobramycin affinity-selection) 以及麦芽糖亲和层析［3] (maltose-binding affinity)等方法能识别和分离70种以上的相关剪接蛋白质。由于RNA 剪接机制愈来愈受到国内外同行的关注，在最近几年中，部分pre-mRNA 剪接因子，尤其hnRNP的晶体及溶液结构获得了一些研究成果，为阐释RNA剪接的复杂机制提供了至关重要的信息。
1 hnRNP的结构与功能
hnRNP-A1 (又名解链蛋白1，unwending protein 1，A1)是真核细胞核hnRNPP 复合物中含量十分丰富的分子．A1能与pre-mRNA结合，形成hnRNPP 复合物，并通过对几种富含Ser／Arg剪接因子的拮抗，以球状(globa1)调节因子的方式参与RNA 交替剪接(alternative splicing)，表现为选择性地跨过某些外显子，实现5’端交替剪接。A1蛋白不断地穿梭在细胞核和胞质之间，能将polyA+ mRNA从细胞核运输到胞质，该过程的调节与其C端富含Gly结构域的结构相关［4]。了解hnRNP A1与RNA相互作用中空间结构方面的信息，将有助于揭示RNA穿过细胞核膜以及剪接过程中的分子细节。
RNA 结合结构域(RNA binding domain，RBD；又称RNA识别基序RNA-recognition motifs，RRM)是蛋白质与RNA相互作用的常见结构域之一[5]。在一定条件下，单个RBD 就能特异识别RNA并进行高亲和的相互作用，但在某些情况下，需要多个RBD之间的协同才能实现蛋白质与RNA 的结合。人类hnRNP A1的N端具有两个RNA结合域，即RBD1和RBD2．晶体结构(分辨率为0．19nm)研究表明［2]，hnRNP A1含有两个在空间上相对独立的BRD，彼此由一条linker连接。在未结合RNA 时，连接肽在空间上具有较大的柔性，这有利于RBD 与RNA 直接相互作用。两个RBD在空间位置彼此靠近，呈反平行排列，构成RNA结合平台(binding platform)，并且依靠两对Arg-Asp离子键来实现稳定。反平行RNA结合平台的存在，使得RNA 能够结合并集聚于该平台，形成浓缩状态，从而有利于RNA分子的剪接和运输。
尽管A1具有两个RBD (与其类似物U1A的RBD同源)，分别包含了4条反平行β折叠和两段α螺旋。但是，这两个RBD之间在结构上具有一定的差别，与RBD2相比较，RBD1的N端起始处存在一段310-α螺旋，这可能是与RNA直接结合的结构基础。Krainer 和Steitz的研究工作很好地展示了两个RBD在空间上的折叠和相互靠近的完美空间几何特性，及其与RNA结合时的相互协同机制[4，5］。
1995年，Ishikawa等分离纯化了一种能与UUAG 片段特异结合的hnRNP，命名为hnRNP Do(简称Do)[6］。该蛋白质分子的中部具有两个RBD，且在其C端区域包括一个RGG-box，富含Gly与Arg残基，因而被称作2×RBD-Gly结构。在hnRNP家族中，如A1、A2／B1和D0，共同具有能与RNA特异结合的2×RBD-Gly结构。RBD则被认为是RNA 剪接因子所共同拥有的特征结构。因此，在RBD蛋白家族中，这些蛋白质被归类为2×RBD-Gly亚家族。在D0分子中，RBD的N端区域有19个氨基酸残基插入序列，调节RBD 对RNA底物的选择性结合，类似的插入序列在hnRNP A2／B1蛋白质中也能观察到。
尽管D0含有两个RBD (靠近N端为RBD1；C端为RBD2)，但其中任意一个都能与UUAG 片段特异性结合[7]，同时还能选择性地与人类端粒重复序列单链d (TTAGGG)n特异性结合。RBD 的N端区域由两段α螺旋和4条反平行β折叠重叠形成，这是RNP-type-RBD 的共同结构特征。与RBD2不同的是，RBD1的两条α螺旋具有N一帽状盒(capping boxes)，第二条β折叠存在一个β凸起(β一bulge)，一条附加的反平行β折叠与一个β_转角的类似结构形成一个环区(1oop)。该环区的空间结构由氢键参与稳定。从RBD整体上看，与RNA相互作用的必需氨基酸残基在结合区的中央及边缘都有分布，中央区的氨基酸残基与RNA之间为非特异性相互作用，而边缘区的残基则与特异性识别相关。
2001年，Katahira等[8]采用NMR技术比较了D0中两个RBD在溶液中的结构，获得更为详细的结果。RBD2折叠成为RNP-type RBD 的特征结构，即α螺旋和β折叠共同参与的紧密折叠结构，一条反平行β折叠与两段α螺旋面对面叠在一起．除了与RNP —type RBD有相同的4条反平行β折叠外，还在其上游发现了一条额外折叠，被称为β4 (一)。为此，RBD2就含有5条β折叠，这与RBD1有较大的不同。化学位移微扰实验显示，与RNA 相互作用的必需氨基酸位于RBD2的β折叠边沿，即位于β4(一)与4个β折叠起始端之间(β4一β)。而RBD1的必需基团却位于对侧的α螺旋上。进一步实验表明，RBD2的RNA结合位点能以相同的方式与DNA相互作用。当未结合RNA时，RBD2的β4一β区域表现为相对缓慢(毫秒至微秒级) 的构象交换(conformational exchange)。RBD与RNA复合物的形成可以淬灭该构象交换．RBD2在空间上的柔性，可
能使D0在与RNA识别过程中产生不同的构象，从而发挥诱导契合的作用。
2 展望
在参与RNA剪接的相关因子中，仅有不到约8%蛋白质的三维空间结构进行了研究，并且在已经研究的因子中，只有部分Sm蛋白质，如B／B’、D1、D2、D3等形成的复合物、hnRNP A1以及hnRNP D0的结构得到了较为完整的结构。尽管其他一些剪接相关蛋白，如DEA(D／H)一box RNA螺旋酶家族的真核转译起始因子
elF4A(eukaryotic translation initiation factor 4A)。
TlP_39(tuberoindundibular peptide-39)片段、hnRNPK、YB-1(human Y-box protein 1)等晶体结构也有报道，但是大都是多肽片段与RNA复合物的三维结构．近年来的研究表明，RNA剪接不但与胚胎发育、性别确定、激素分泌和细胞衰老等密切相关，还与人类某些重大疾病的病理过程相关，如神经退行性疾病等［9，10]．随着本领域研究的不断深入，RNA剪接因子结构与功能的研究必将成为一个重要的国际前沿领域．
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部分招生单位研究生入学历年考试真题 2004年北京师范大学攻读硕士研究生入学考试试题 一、名词解释（每题3分，共45分） 1．Ames试验 2．包膜 J．胞吞作用 4．不亲和性 5．Col质粒 6．端粒7．附加体 8．感染复数 9．回文结构 10.末端重复 11.轻链 12.噬菌体 展示 13.卫星RNA 14.致育因子 15.原毒素 二、简要回答题（每题5分，共45分） 1．说明控制微生物生长繁殖的主要方法及原理。 2．SASR病毒粒子及其基因组的基本结构是什么？ 3．以简要的图示和文字说明酿酒酵母菌的生活史。 4．溶源性细菌有哪些特性？ 5．什么是细菌群体的生长曲线？它在生产上有哪些应用？ 6．病毒壳体结构有哪几种对称形式？病毒粒子主要结构类型有哪些？ 7．固氮微生物中大多为好氧菌，它们如何保证固氮酶既不被氧灭活，又能提供必要的氧产生ATP进行固氮？ 8．说明红硫细菌，枯草杆菌，硝化细菌的营养及获能方式。 9．什么是病毒的一步生长曲线？该曲线中各时期的特点是什么？ 三、试验设计（每题15分，共30分） 1．设计一个实验程序，以确保在对未知菌进行革兰氏染色时操作正确，结果可靠。 2．设计一套从自然界筛选分离一株对聚氯联苯类农药降解能力高的菌株的 方案。 四、问答题（每题15分，共30分） 1．什么是营养缺陷型？如何从诱变菌株中筛选出营养缺陷型。 2．光合细菌有哪几类？细菌的光合作用与绿色植物的光合作用之间有什么 不同？ 2005年北京师范大学攻读硕士研究生入学考试试题 一、名词解释（每题3分，共45分） 1．半抗原 2．表型 3．病毒入胞 4．病毒因子 5．超敏反应 6．反向末端重复 7．分段基因组 8．富集培养 9．干扰素 IO.感受态细胞 11.核壳 12.类囊体 13.免疫原性 14．原养型 15．微生物传感器 二、简要回答题（每题5分，共45分） 1．RNA是微生物的遗传物质吗？为什么？ 2．HIV病毒粒子中的逆转录酶的生物学功能是什么？ 3．以简要的图示和文字说明路德类酵母菌的生活史。 4．什么是Stickland反应？图示其反应机制。 5．简述Ames试验及其实际应用意义。 6．什么是COD?如何测定COD。 7．什么是特异性免疫？其意义何在？ 8．简述嗜盐细菌视紫红质的光合作用。 9．简述微生物新陈代谢中末端产物抑制作用。 三、分析以下实验结果并简要说明理由（20分）
生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 第22卷 第4期2010年4月 Vol. 22, No. 4 Apr., 2010 文章编号 ：1004-0374(2010)04-0331-07 收稿日期：2009-10-13；修回日期：2009-11-11基金项目：山东省自然科学基金项目(Y2008D36)通讯作者：Email: xiezhh6823@https://www.doczj.com/doc/5814148176.html, 小RNAs 在沉默转座因子中的作用 谢兆辉 (德州学院生物系，德州253023) 摘 要：在很多生物基因组中都存在D N A 成分的转座序列，它们能够转座到基因组的很多位点，对 基因组造成很大的危害，如破坏编码基因、改变基因表达的调节网络、使染色体断裂或造成大范围基因重排等。真核生物已经进化出了多种机制来控制这些寄生核酸序列造成的损伤，以维持基因组完整性。虽然这些机制在不同生物中有些差异，但其中一种主要的机制是通过小R N A s 介导的，这些小R N A s 包括小干扰R N A s 、p i w i 相互作用的小R N A s 、微小R N A s 、扫描R N A s 和21U -R N A s 等。这些小R N A s 可以通过D N A 水平剪切转座序列，或在转录和(或)转录后水平沉默转座成分。该文就这些小R N A s 沉默转座成分的机制和功能做一论述。 关键词：转座成分；小干扰R N A s ；p i w i 相互作用的小R N A s ；微小R N A s ；扫描R N A s ；21U -R N A s 中图分类号：Q 522.2；Q 78 文献标识码：A The role of small RNAs in silencing transposable elements XIE Zhao-hui (Department of Biology, Dezhou University, Dezhou 253023, China) Abstract: Transposable elements (TEs) are DNA elements found in the genomes of various organisms. However,due to their ability to transpose into virtually any locus, TEs have the ability to generate deleterious damages in the host genome, such as disrupting protein-coding genes, altering transcriptional regulatory networks and causing chromosomal breakage or large-scale genomic rearrangement. Eukaryotes has evolved multiple silenc-ing mechanisms as a defense strategy against these parasitic nucleic acids to protect genomic integrity. Al-though the strategies used in different organisms vary in their details, a major system that controls the activity of TEs, is mediated by small RNAs, including siRNAs, piRNAs, miRNAs, scanRNAs and 21U-RNAs. These small RNAs can tame TEs through eliminating TE sequences or silencing them in transcriptional and/or post-transcriptional level. The functions and the mechanisms of these small RNAs in the ongoing struggle against TEs, were discussed in the following review. Key words: transposable element; siRNA; piRNA; miRNA; scanRNAs; 21U-RNAs 基因组可以产生多种小R N A s ，如微小R N A s (miRNAs)、与Piwi 蛋白相互作用的RNAs (piRNAs)和小干扰RNAs (siRNAs)。其中siRNAs 又可分为反式作用siRNAs (ta-siRNAs)、天然反义转录siRNAs (nat-siRNA)、异染色质siRNAs (hc-siRNAs)、长小片段干扰RNAs (lsiRNAs)等很多亚类。除此之外，其他生物中还发现了一些独特的小RN As ，如线虫的21U-RNAs 和纤毛虫类的扫描RNAs (scanRNAs，scnRNAs)。这些小RNAs 的产生和作用机制通常包 括三个过程：(1)形成小RNAs 前体。这些前体可以是单链RNAs、双链RNAs (dsRNAs)或发夹结构RNAs(hpRNAs)。(2)小RNAs 前体剪切成小RNAs。这个过程一类依赖Dicer，另一类不依赖Dicer。(3)小RNAs招募Argonaute (Ago)类蛋白形成复合体，发
第七章习题答案 一.名词解释 1.转座因子：具有转座作用的一段DNA序列. 2.普遍转导：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象称为普遍转导。 3.准性生殖：是一种类似于有性生殖,但比它更为原始的两性生殖方式,这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合,它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子. 4.艾姆氏试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法 5.局限转导：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体的少数特定基因携带到受体菌中,并与后者的基因整合,重合,形成转导子的现象. 6.移码突变：诱变剂使DNA序列中的一个或几个核苷酸发生增添或缺失,从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变. 7.感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态. 8. 高频重组菌株：该细胞的F质粒已从游离态转变为整合态,当与F- 菌株相接合时,发生基因重组的频率非常高. 9.基因工程：通过人工方法将目的基因与载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞，从而使受体细胞获得新的遗传性状的一种育种措施称基因工程。 10.限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子的特定序列，并能在识别位点内部或附近进行切割的内切酶。
11.基因治疗：是指向靶细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 12.克隆：作为名词，也称为克隆子，它是指带有相同DNA序列的一个群体可以是质粒，也可以是基因组相同的细菌细胞群体。作为动词，克隆是指利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或DNA序列插入一个载体DNA分子上，进行扩增。 二. 填空 1.微生物修复因UV而受损DNA的作用有光复活作用和切除修复. 2.基因组是指一种生物的全套基因。 3.基因工程中取得目的基因的途径有_____3_____条。 4.基因突变可分为点突变和染色体突变两种类型。 5.基因中碱基的置换(substitution)是典型的点突变。置换可分两类：DNA链中一个嘌呤被另一个嘌呤所置换或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，被称为转换；而DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，被称为颠换。 6.诱变剂导致DNA序列中增添（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变称为移码突变。 序列通过非同源重组的方式,从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象,被称为转座.凡具有转座作用的一段DNA序列,称转座因子,包括原核生物中的插入顺序转座子和的Mu噬菌体. 8.把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下,死亡率可明显降低,此现象称为光复活.最早是1949年有在灰色链霉菌中发现.
·综述与专论· 生物技术通报 B I O T E C H N O L O G Y B U L L E T I N 2010年第12期 Mi c r o R N A 研究进展 赵奎 庞全海 (山西农业大学动物科技学院,太谷030801) 摘 要: M i c r o R N A (m i R N A )是生物体内源长度约为21-25个核苷酸的非编码小R N A ,通过与靶m R N A 互补配对而在转录水平上对基因的表达进行负调控,导致m R N A 的翻译抑制或降解。m i R N A 虽然微小,但它在真核生物发育和基因表达中通过与靶m R N A 形成完全或不完全互补配对从而扮演着重要角色。它们参与动物体发育、细胞增殖与死亡、细胞分化等各种过程。综述了m i R N A 的发现、生物合成、特征与功能、靶基因的预测等方面的研究进展。 关键词: m i R N A 生物学功能 靶基因预测 T h e R e s e a r c hP r o g r e s s o f Mi c r o R N A Z h a o K u i P a n g Q u a n h a i (C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S h a n x i A g r i c u l t u r e U n i v e r s i t y ,T a i g u 030801) A b s t r a c t : M i c r o R N A (m i R N A )a r e a c l a s s o f e n d o g e n o u s n o n c o d i n g s i n g l e -s t r a n d e d R N Aw i t h a b o u t 21-25n u c l e o t i d e s l e n g t h . M i c r o R N Af u n c t i o n a s s e q u e n c e -s p e c i f i c n e g a t i v e r e g u l a t o r s i np o s t -t r a n s c r i p t i o n a l g e n e s i l e n c i n g b y b a s e p a i r i n gw i t ht a r g e t m R N A s ,w h i c hl e a d s t om R N A c l e a v a g e o r t r a n s l a t i o n a l r e p r e s s i o n .A l t h o u g h t h e y a r e t i n y ,i n e u k a r y o t e s ,m i c r o R N Ap l a y i m p o r t a n t r o l e s i n g e n e e x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ,t y p i c a l l y b yf o r m i n gp e r f e c t o r i m p e r f e c t d u p l e x e s w i t ht a r g e t m e s s e n g e r R N A s .T h e s em i R N Aa r ei n v o l v e di n p h y s i c a l d e v e l o p m e n t ,d e a t hp r o l i f e r a t i o n ,a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f c e l l .T h i s r e v i e wt r i e s t o h a v ea b r i e f i n t r o d u c t i o no nt h e p r o g r e s s e s o f m i R N As t u d y ,s u c ha s t h e d i s c o v e r y ,b i o g e n e s i s ,f e a t u r e a n df u n c t i o n s ,a n dg e n e p r e d i c t i o n . K e y w o r d s : m i R N A B i o l o g i c a l f u n c t i o n G e n e p r e d i c t i o n 收稿日期:2010-06-07基金项目:国家自然科学基金项目(30972223),山西农业大学基金项目(412528,614114)作者简介:赵奎,男,硕士研究生,研究方向:动物临床疾病的细胞及分子生物学研究;E -m a i l :z h a o k u i h a p p y @163.c o m 通讯作者:庞全海,教授,博士生导师,E -m a i l :p a n g q u a n h a i @126.c o m M i c r o R N A (m i R N A )是一类大小约21-25个核苷酸(n t )的R N A 分子,一般来源于染色体的非 编码区域,由大约70n t 大小的可形成发夹结构的前体加工而来,其作用是在转录水平上对基因表达产生抑制性作用[1] 。作为21世纪生命科学研究重大发现之一,越来越多的资料显示,m i R N A 在动物的基因表达调控、细胞分化等过程中起着重要的作用。 1 m i R N A 的发现和命名 1993年,L e e 等 [2] 在秀丽隐杆线虫中利用定位 克隆法克隆了第1个能阶段性调控胚胎后期发育的基因l i n -4,该基因不编码蛋白质,但是编码长度约22n t 的m i R N A 。L i n -4的发现及其翻译抑制作用提示,在生长发育过程中存在着一种新的基因调节机 制。L i n -4是在生物生长发育过程中起重要作用的l i n -14和l i n -28的负性调节因子。2000年,R e i n h a r t 等 [3] 又在线虫中找到了第2个调控时序性发育的基 因l e t -7,其转录物也被加工成大小为21个核苷酸的m i R N A ,也是一个负调节因子。人们逐渐认识到m i R N A 是一类进化保守,在生物进化和疾病发展过程中起着调控作用的重要分子,通过抑制靶基因的表达产生基因沉默效应 [4-6] 。此后,人们逐渐在人 类、果蝇、小鼠等多种生物中开展了m i R N A s 的研究,结果发现了数以百计的m i R N A s 。到2009年3月,m i R B a s e 数据库已更新到13.0版本,共发布9539种m i R N A 。 英国的S a n g e r 中心专门成立了m i R N A 的数据库(h t t p ://w w w .s a n g e r .a c .u k /S o f t w a r e /R f a m /m i r -
第五节微生物中的转座因子 转座因子（transposable element，TE）是一类广泛存在于细菌、病毒和真核生物DNA分子中一段可自主改变自身座位的DNA片段，它可以在同一细胞内DNA复制子间转移，也可以在一个复制子内部转移。 转座因子是20世纪40年代由Barbara McClintock在进行玉米的遗传学研究时首先发现的，她因此而荣获了1983年度的诺贝尔奖。尔后在细菌中得到了广泛和深入的研究。 转座因子的共同特征是：插入寄主DNA后，导致基因失活；插入时在靶DNA位点产生一个短的正向重复顺序。 一转座子的发现和分类 转座因子：是基因组内一段相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转（transposition）。 转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）。 转座子的转座特点（1）基因组内移动；（2）不依赖于供体与受体间的序列关系；（3）一般仅移动转座子序列本身。 根据转座因子的转座机理，将转座因子分为两类： 第一类是DNA转座子(DNA transposon)，其转座过程是从DNA→DNA，这类转座因子存在于原核生物和真核生物中，如细菌的转座子和插入序列； 第二类是反转座子(retrotransposon)，其转座过程是以RNA为中间体，即从DNA→RNA→cDNA → DNA转座。 二、细菌转座因子的类型和结构 细菌转座因子分为四个类型：插入序列（insertion sequence，IS）转座子（transposon，Tn）转座噬菌体（Mu） 接合型转座子 一）、插入序列 插入序列也称IS因子，它是最简单的转座因子。IS因子的长度一般为0.7-2.5 kb。 ?最简单的转座因子，不含任何宿主基因的可转座的DNA序列（insertion sequences, IS）。 ?IS元件是独立的结构单位，每个元件只编码为自身转座所需要的蛋白质。 ?IS元件的末端为短的反向末端重复序列（inverted terminal repeats）。 插入序列的结构有以下3个特点： ①在IS的两端含有长度为10～40bp反向重复序列（inverted repeat sequence，IR），两端的反向重复序列在IS的切割和DNA链转移中起作用。 ②大多数IS都含有一个编码转座酶（Transposnase 简称Tnp）的长编码区，其启动子位于一端的反向重复序列之内，而刚好终止于另一端的反向重复序列之前或之内。 转座酶负责识别切割转座子的两端以及在靶位点造成切口。有些IS含有2个或2个以上的开放阅读框架，它们除编码转座酶外，还编码用于调控转座酶活性的调节蛋白。 ③在IS插入时，在靶DNA位点产生一个短的、长度一般为3-9bp正向重复顺序(direct repeat sequence，DR)，分布在IS的两侧。 ?插入位点一般是随机的，很少是位点专一的。 ?转座是罕见事件，与自发突变率处于同一数量级，约为每代10-6一10-7。插入片段精确切离后，可使IS诱发的突变回复为野 生型，但这种概率很低，每代只有10-6一10-10。不精确切离可使插入位置附近的宿主基因发生缺失。 二）、细菌转座子 几乎就在发现IS因子的同时，微生物学家和遗传学家注意到细菌中某些对抗抗生素的基因能从一种DNA分子转移到另一种DNA分子。因此，将带有抗性基因并能在不同的DNA分子之间移动的遗传单位叫做细菌转座子(bacterial transposon，Tn)。Tn分子一般在2000~25000 bp，两端反向重复序列 Tn与IS的主要区别是携带与转座无关的药物抗性或其他特性的基因。Tn一般具有抗生素抗性的基因，因为这些基因容易鉴别，故研究得较为广泛和深入。 ?某些Tn的反向重复序列是已知的IS，带有IS的Tn也称为复合型转座子，如Tn5、Tn10、Tn903 ?不含有IS的Tn称为简单转座子，如Tn3 ?没有IS序列，体积庞大的转座子称为TnA家族 细菌抗药性转座子一般可分为两类：复合转座子(composite transposon) 复杂转座子(complex transposon) 1.复合转座子：复合转座子是由两个完全相同或类似的插入序列IS和某种抗药性基因组成的复合因子，IS作为Tn的两个臂或称两个末端，两个IS在Tn中做正向或反向排列。在这类转座子中，IS可以带动整个Tn的转座，也可单独进行转座。
微生物知识点 一、名词解释 第一章绪论 微生物：指在自然界广泛分布的个体微小，结构简单，肉眼不能看到，需借助光学显微镜或电子显微镜放大几百倍，几千倍，甚至几万倍才能看到的微小生物的统称。 菌株（又称品系）：表示由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯菌群。 第二章细菌 原生质体：在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形，对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。 球状体（原生质球）：针对革兰氏阴性细菌加溶菌酶和EDTA处理后而获得的残留部分细胞壁的球形体。 芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形，厚壁，含水量极低，抗逆性极强的休眠体。伴孢晶体：少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体。 鞭毛：某些细菌从细胞内向细胞外伸出地细长波状弯曲的丝状物。是细菌的运动器官。 培养基：培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养物质。 外毒素：病原细菌，主要是一些革兰氏阴性菌，在生长过程中合成并分泌到细胞外的毒素，化学本质是蛋白质。 类毒素：因外毒素对热和某些化学物质敏感，可以脱毒形成类毒素。 内毒素：革兰氏阴性菌的细胞壁物质，主要成分是脂多糖，当菌体裂解时释放发挥毒性，即内毒素。 放线菌：是一类介于细菌和丝状真菌之间，在形态上具有分支状菌丝，菌落形态和霉菌相似，以孢子进行繁殖，革兰染色多为阳性的单细胞原核细胞型微生物。 生长曲线：将一定数量的细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞的数量，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标作图，得到一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。 热原质：泛指那些能引起机体发热的物质，依据其来源不同可分为内源性热原质和外源性热原质。 第四章病毒 毒粒（病毒颗粒）：病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。 病毒的复制：病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质。 然后由这些新合成的病毒组分装配成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方 式称为复制。 烈性噬菌体：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环。其裂解周期和病毒的复制周期一致。包括吸附，侵入大分子合成装配和释放四个阶段。 温和噬菌体（溶源性噬菌体）：感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在在宿主细胞内，没有成 熟噬菌体产生。这一现象叫做溶源性现象。 病毒的干扰现象：俩个病毒感染同一细胞或机体时，常出现一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象，成为病毒的干扰现象。 干扰素：是机体受到病毒或其他干扰素诱生剂刺激，由机体细胞产生的一种具有生理活性的蛋白质。 第五章消毒与灭菌 正常菌群：人类的体表与外界相连得腔道都有微生物的存在、其中一部分长期生活，在正常情况下不致病。称为人的正常菌群。 条件致病菌：人体的正常微生物菌群一旦进入非正常群居部位或生态结构发生改变而引起人类疾病的微生物。 第六章抗生素 抗生素：是生物（包括微生物、植物和动物）在其生命活动过程中所产生的（或由其他方法获得的），在低微浓度时就能抑制或影响它种生物功能的有机物质，比如杀死微生物或抑制其生长。 第八章微生物的遗传与变异
RNA剪接 RNA剪接（RNA splicing）是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。通过不同方式的RNA剪接，－种基因可在不同的发育分化阶段、不同的生理病理条件或不同的细胞、组织中合成不同的蛋白质。果蝇的性别就是通过不同的剪接途径完成的。在Science这篇文章中Li等人发现了一个Archaeglobus fulgidus的RNA剪接内切酶（RNA splicing endonuclease），为了解所谓的“生物分子”（即有机分子，包括蛋白质，核苷酸等）结构提出了新的观点见解。这项研究主要是利用了X射线结晶方法（X-ray crystallography）解析生物分子的三维结构，而对于生物分子的形状以及相关的化学性质的了解是科学家们探索生物分子维持细胞生命活动机理的基础。 而在另一篇文章中，Li和来自PTC Therapeutics（一家生物制药公司）的技术人员讨论了有关内含子结构剪接的相关发现：通过对真核tRNA剪接内切酶的分析，发现了一个以前从未发现的对于其催化作用有影响的活性位点。 这些发现可以帮助科学家们了解细胞中分子识别以及相互作用的基本化学与物理机理，FSU的Timothy Logan教授认为这项工作是为理解生物分子功能提供了重要信息，而且也为许多健康问题提出了新的治疗方案。 Related fig: Hypothetical model of the cation-πsandwich of the eukaryotic tRNA-splicing endonuclease. (版权归原作者所有)
RNA剪接因子hnRNP的结构与功能研究进展 动物遗传育种刘小艳 2005414 摘要RNA剪接是一个多步骤、形成多种中间状态复合物的复杂过程，尽管在已经发现的一百多种pre-mRNA剪接相关因子中，仅研究了约8%相关蛋白质的空间结构，已充分显示对剪接相关因子三维晶体结构以及溶液结构的测定与研究，在理解RNA剪接的复杂机理以及生物学特性中具有不可替代的重要意义． 关键词RNA剪接，hnRNA结合蛋白，剪接体，晶体结构，溶液结构 原核生物中mRNA的转录与翻译几乎是同步发生的，而真核生物，转炉是发生在细胞核内，翻译则在核外进行。真核生物RNA尤其mRNA分子的寿命较长，在5’和3’两个末端都要受到修饰。而RNA剪接(RNA splicing)是tRNA、rRNA，特别是mRNA加工与成熟的重要生物学过程，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。RNA剪接需要多种因子参与，包括杂性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，结合蛋白hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)，小型核RNA (small nuclear RNA，snRNA)，结合蛋白snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)等。在真核细胞内，RNA原初转录物的分子很大，通过剪接产生成熟的mRNA分子。hnRNP与hnRNA结合形成核酸蛋白质复合物hnRNPP(hnRNP particles)可穿梭于细胞核与胞质之间，具有转运和剪接RNA的作用。另一方面，snRNP与细胞核内snRNA (分子质量为100-200 nt 的小RNA)紧密结合，而构成核内小核酸蛋白质复合物snRNPP(snRNP particles)，参与RNA剪接、多聚腺苷化以及转录拷贝3’端的成熟。 最近，Reed等通过蛋白质组学方法证明，与pre-mRNA剪接相关的蛋白质因子大约有145种，它们参与RNA剪接过程中的不同环节[1]。托普霉素亲和层析［2］(tobramycin affinity-selection) 以及麦芽糖亲和层析［3] (maltose-binding affinity)等方法能识别和分离70种以上的相关剪接蛋白质。由于RNA 剪接机制愈来愈受到国内外同行的关注，在最近几年中，部分pre-mRNA 剪接因子，尤其hnRNP的晶体及溶液结构获得了一些研究成果，为阐释RNA剪接的复杂机制提供了至关重要的信息。 1 hnRNP的结构与功能 hnRNP-A1 (又名解链蛋白1，unwending protein 1，A1)是真核细胞核hnRNPP 复合物中含量十分丰富的分子．A1能与pre-mRNA结合，形成hnRNPP 复合物，并通过对几种富含Ser／Arg剪接因子的拮抗，以球状(globa1)调节因子的方式参与RNA 交替剪接(alternative splicing)，表现为选择性地跨过某些外显子，实现5’端交替剪接。A1蛋白不断地穿梭在细胞核和胞质之间，能将polyA+ mRNA从细胞核运输到胞质，该过程的调节与其C端富含Gly结构域的结构相关［4]。了解hnRNP A1与RNA相互作用中空间结构方面的信息，将有助于揭示RNA穿过细胞核膜以及剪接过程中的分子细节。
基因组学课程论文 （RNA测序的研究进展） （） 学号： 专业：生物技术 班级：三班 论文提交日期2011 年10 月
RNA测序的研究进展 摘要：RNA测序（RNA-seq）已成为基因表达和转录组分析的新的重要手段，RNA-seq技术产生的海量数据为生物信息学带来了新的机遇和挑战. 有效地对测序数据进行针对性的生物信息学处理和分析，成为RNA-seq技术能否在科学探索中发挥重大作用的关键。目前，大约已发现了100多种miRNA，它们存在于不同的生物中，从四膜虫、线虫、植物、动物到人都已发现了不同的miRNA。miRNA的主要功能是调节内源基因表达，它在基因活动调控网络中扮演了重要的角色。小RNA分子研究将是今后分子生物学的研究热点之一。本文主要针对二代测序技术在RNA中的应用机理以及进展进行了简要综述。 关键词：二代测序；miRNA；高通量测序；cDNA文库 RNA sequencing research progress Abstract:The RNA sequencing (RNA-seq) has become a gene expression and transcription of the new important means of analysis, RNA-seq technologies to produce the amount of data for bioinformatics brought new opportunities and challenges. The effective data to sequencing the targeted bioinformatics processing and analysis, become RNA-seq technology can be in scientific exploration of the key plays a major role. Currently, about 100 has been found in DuoZhong miRNA, they exist in different biological, from the four membrane bug, worms, plants and animals to people already found different miRNA. The main function is to adjust miRNA endogenous gene expression, it in gene regulation network activities play an important role. Small RNA molecules research will be in the future of molecular biology research hotspot. This article mainly aims at the second generation sequencing technology in the application principle and progress RNA is reviewed. Key words:The second generation sequencing;miRNA; Illumina Genome Analyzer IIx; cDNA library 近年来基于边合成边测序思想的新一代测序技术迅猛发展，测序通量急速增加，测试成本也呈现直线下降的趋势。该技术正在使基因组研究发生革命性变化，在不久的未来可能将人的基因组测序成本降低到一千美元。目前新一代测序的读长很短，一般只有25-75bp，但是测序的通量非常大，一次可以获得上千万条短序列。虽然新技术已经开始普及，但是测序后的数据分析依然存在巨大的挑战，比如快速而准确的短序列比对，DNA多态性检测，数据管理和可视化等。另外，新一代测序技术在非模式生物转录组和基因组学研究进展十分缓慢。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性的长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA，能够在转录后水平调节mRNA表达。miRNA在线虫、果蝇、植物、哺乳动物，甚至病毒中广泛存在。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于其他基因。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。 1 二代测序在RNA中的应用原理与方法
mRNA前体的加工过程有哪些步骤 ?浏览：1881 ?| ?更新：2012-11-20 12:43 原核生物转录作用生成的mRNA属于多顺反子mRNA，即由操纵子机制控制生成的一条mRNA可编码几种不同的蛋白质。原核生物转录生成的初级转录本mRNA不需经过复杂的加工过程即可表现功能，惟一的加工过程是多顺反子mRNA在RnaseⅢ的催化下裂解为单个的顺反子。 真核生物转录生成的是单顺反子mRNA，其前体是非均一RNA(hnRNA)。hnRNA加工过程包括 方法/步骤 1.剪接 真核生物的基因是一种断裂基因，即其结构基因由若干编码序列和非编码序相间排列而成，其中为蛋白质编码的可转录序列称为外显子，不为蛋白质编码的可转录序列为内含子。转录合成的hnRNA需经过剪接、切掉内含子部分，然后再将外显子部分拼接起来。该过程有多种酶活性物质(包括snRNA)参与。
2.5′末端加“帽” 真核细胞成熟mRNA的5′末端均有一个特殊的结构，即m7Gpp-pmnNp，称为“帽”。帽的生成是在细胞核内进行的，但胞浆中也有酶体系，动物病毒mRNA 加帽过程就是在宿主细胞的胞浆内进行的。 3.3′末端加“尾” mRNA前体分子的3′末端有一段保守序列，由特异的核酸内切酶切去多余的核苷酸，然后在多聚A聚合酶的催化下，由ATP聚合生成多聚A尾。该反应在核内发生，在胞浆中也可继续进行。 4.碱基修饰 mRNA分子中有少量稀有碱基(如甲基化碱基)是在转录后经化学修饰(如甲基化)而形成的。 5.选择性加工 某些MRNA前体含有多个3‘剪切位点和多聚腺苷酸化位点，因此利用这些选择性位点可产生具有不同3'端非编码区或者具有不同编码能力的RNA产物。 通过可变剪接途径可以挑先最保留在MRNA中的外显子，结果单个基因可以合成多种不同的蛋白质。 6.RNA编辑 在合成并经RNA编辑加工之后，MRNA分子的序列可以发生改变。个别核苷酸可以被置换，添加或者删除。编辑过的MRNA翻译产生了较短脱脂基蛋白B48，由于基缺少一个结合受体的蛋白结构域，因此功能受限。还有好多
原理、产生背景、发展历史、现状、发展趋势、理论或实践意义 May 20, 2002 Post-transcriptional gene silencing (PTGS), which was initially considered a bizarre phenomenon limited to petunias and a few other plant species, is now one of the hottest topics in molecular biology (1). In the last few years, it has become clear that PTGS occurs in both plants and animals and has roles in viral defense and transposon silencing mechanisms. Perhaps most exciting, however, is the emerging use of PTGS and, in particular, RNA interference (RNAi) — PTGS initiated by the introduction of double-stranded RNA (dsRNA) — as a tool to knock out expression of specific genes in a variety of organisms (reviewed in 1-3). How was RNAi discovered? How does it work? Perhaps more importantly, how can it be harnessed for functional genomics experiments? This article will briefly answer these questions and provide you with resources to find in depth information on PTGS and RNAi research. More than a decade ago, a surprising observation was made in petunias. While trying to deepen the purple color of these flowers, Rich Jorgensen and colleagues introduced a pigment-producing gene under the control of a powerful promoter. Instead of the expected deep purple color, many of the flowers appeared variegated or even white. Jorgensen named the observed phenomenon "cosuppression", since the expression of both the introduced gene and the homologous endogenous gene was suppressed (1-5). First thought to be a quirk of petunias, cosuppression has since been found to occur in many species of plants. It has also been observed in fungi, and has been particularly well characterized in Neurospora crassa, where it is known as "quelling" (1-3). But what causes this gene silencing effect? Although transgene-induced silencing in some plants appears to involve gene-specific methylation (transcriptional gene silencing, or TGS), in others silencing occurs at the post-transcriptional level (post-transcriptional gene silencing, or PTGS). Nuclear run-on experiments in the latter case show that the homologous transcript is made, but that it is rapidly degraded in the cytoplasm and does not accumulate (1, 3, 6). Introduction of transgenes can trigger PTGS, however silencing can also be induced by the introduction of certain viruses (2, 3). Once triggered, PTGS is mediated by a diffusible,