真菌检查步骤 1.采集标本浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。 2.检查方法真菌检查的方法主要有： （1）直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。 （2）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接镜检。 （3）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。 （4）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。 四、真菌学检验的基本技术 （一）直接镜检 是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液：A.10%~20%的KOH。配方：氢氧化钾10～20g，蒸馏水加至100ml，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。B.复方氢氧化钾溶液配方：氢氧化钾（AR）10g，二甲基亚砜（AR）40ml,甘油50ml, 蒸馏水加至100ml,配制方法：将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后，再依次加入DMSO、甘油揺匀后，用蒸馏水加到100ml，装入塑料瓶内。此配方的优点是：配方中加DMSO，能促进角质的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，氢氧化钾的浓度相对低，腐蚀性亦低，为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。②胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。③涂片染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或
灵芝虫害：真菌瘿蚊 真菌瘿蚊(MycophilafungicolaFelt)又名嗜菇瘿蚊，菇呐。属双翅目，瘿蚊科。形态和小性成虫体小，长1毫米左右。头、胸、背部深褐，其他为灰褐色或橘红色。 真菌瘿蚊(MycophilafungicolaFelt)又名嗜菇瘿蚊，菇呐。属双翅目，瘿蚊科。 一、形态和小性成虫体小，长1毫米左右。头、胸、背部深褐，其他为灰褐色或橘红色。头小，复眼大，左右相连，触角细长念珠状，11节，每节都有环生放射状细毛，雄虫触角比雌虫长，翅宽大有毛。雌虫腹末尖细，雄虫腹末有一对钳状抱握器。卵肾形长0.3毫米左右，乳白至淡褐色。幼虫蛆状，体13节，无足，橘黄、淡黄或白色。蛹为裸蛹，平均长1.07毫米，宽0.27毫米，橘红色，顶部有2根毛，为呼吸管。 成虫、幼虫均有趋光性，在较明亮地方，虫口密度大。幼虫喜潮湿，在潮湿处活动自由，在水中可存活多天。高温、高湿条件下，每周繁殖一代。因此，短期内可大量发生。 二、为害情况以幼虫为害灵芝的菌丝体和子实体。发菌期间在料中为害，覆土后转移至土层，为害绒毛菌丝与子实体原基，菌蕾受害后发黄，萎蔫而死。 三、防治方法 1、发生室门窗安装纱网，防止成虫侵入。 2、清除废弃脏物及废料，保持卫生和撒石灰保持环境干燥。
3、发现瘿蚊时，用1%氯菊酯或1000倍50%的辛硫磷喷杀。 4、覆土堆制消毒处理时表面喷洒500倍敌敌畏药液，覆盖薄膜杀灭卵、蛹和幼虫。 5、利用成虫的趋光性，安装“食用菌高压静电杀虫灯”捕杀。最近，浙江余姚市食用菌研究所根据食用菌小飞虫设计生产出一种新颖的高压静电杀虫灯。该产品具有杀虫效果好、安装方便、使用安全、耗电低、寿命长、体积小等特点。
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真菌漆酶的研究进展及其应用前景 作者：周雪婷， 张跃华， 罗志文， 潘亭如， 缪天琳 作者单位：佳木斯大学,黑龙江佳木斯,154007 刊名： 农业与技术 英文刊名：Agriculture & Technology 年，卷(期)：2012,32(9) 参考文献(33条) 1.王光辉;季立才中国漆树漆酶的底物专一性 1989 2.Nina H;Laura-Leena K Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear coper site 2002(08) 3.雷福厚;蓝虹云漆树漆酶和真菌漆酶的异同研究[期刊论文]-中国生漆 2003(01) 4.李慧蓉白腐真菌生物学和生物技术 2005 5.Harald Claus Laccases:structure.reactions,distrihution 2004(35) 6.张丽白腐真菌产漆酶对染料废水降解的研究 2004 7.张敏;肖亚中;龚为民真菌漆酶的结构与功能[期刊论文]-生物学杂志 2003(20) 8.Gimifreda L;Xu F;Bollag J-M Laccases:a useful group of oxido reductive enzymes 1999(03) 9.Xu F;Kulys J J;Duke K Redox Chemistry in Laccase-Catalyzed Oxidation of N-Hydroxy Compounds 2000(66) 10.堵国成;赵政;陈坚真菌漆酶的酶活测定及其在织物染料生物脱色中的应用[期刊论文]-江南大学学报（自然科学版） 2003(02) 11.缪静;姜竹茂漆酶的最新研究进展[期刊论文]-烟台师范学院学报(自然科学版) 2001(17) 12.刘尚旭;赖寒木质素降解酶的分子生物学研究进展[期刊论文]-重庆教育学院学报 2001(14) 13.何为;詹怀宇;王习文;伍红一种改进的漆酶酶活检测方法[期刊论文]-华南理工大学学报（自然科学版） 2003(31) 14.季立才;胡培植漆酶结构,功能及应用 1996(18) 15.侯红漫白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究 2004 16.Huang Z Y;Huang H P;CaiR X Organic solvent enhanced spectrofluorin etric method for determition of laccase activity 1998(01) 17.Badiani M;Felici M;Luna M Laccase assay by means of highperfomance liquid chromatography 1983(02) 18.Wood D.A Production,Purification and Properties of Extracelluar laccase of Agaricus bisporus 1980(17) 19.林俊芳;刘志明;陈晓阳真菌漆酶的酶活测定方法评价[期刊论文]-生物加工过程 2009(04) 20.望天志;李卫莲;万洪文微量热法测定漆酶的活性[期刊论文]-自然杂志 1997(06) 21.Kirk T K;Farrell R L Enzymatic "combustion":The microbial degradation of lignin 1987(10) 22.张爱萍;秦梦华;徐清华漆酶在制浆造纸中的应用研究进展[期刊论文]-中国造纸学报 2004(02) 23.Reid I D Biological pulping in paper manufacture 1991(08) 24.Bergbauer M;Eggert C;Kraepelin G Degradation of chlorinated lignin compounds in a bleach plant effluent by the white-rot fungus Trametes Versicolor 1991(35) 25.林建城酶在食品工业,轻工业和环境保护上的应用分析[期刊论文]-莆田学院学报 2005(02) 26.林鹿;陈嘉翔白腐菌对纸浆CEH漂白废水的脱色、消除毒性和芳香化合物的降解 1996(11) 27.E Rodriguez;MA.Pickard;R Vazquez-Duhalt Industial dye decolorization by laccases from ligninolytic fungi 1999(38) 28.Bollag J M;Myers C Detoxification of aquatic and terrestrial sites through binding of pollutants to humic substances 1992(117-118) 29.Majcherczy A Oxidation of ploycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor 1998(22) 30.刘涛;曹瑞饪漆酶在环境保护领域中的研究及应用进展[期刊论文]-云南环境科学 2005(03) 31.Collins P J;Kotterman M J J;Field J A;Dobson A Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccase from Trametes versicolor[外文期刊] 1996(12)
真菌的常规检验法 实验室检查： ?标本采集分离培养 ?直接镜检生化反应 ?染色镜检免疫学试验 一、临床标本的采集 ?1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。 2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。 ?3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4．脓汁及渗出物。 二、检验方法 （一）标本直接检查法
不染色标本检查 染色标本检查 （二）培养检查 （三）鉴定 ①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 ②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。 微生物学检查步骤： 取患部标本
（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化 →镜检（观察菌丝和孢子） 直接镜检的意义 ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； ③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。 直接镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。 2. 染色标本检查 ?（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。 ?（2）乳酸酚棉蓝染色
?（3）糖原染色： ?又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。 ?（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色 ?（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 ?（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。 （二）培养检查法 ?本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。 ①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大； ③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
霉菌和酵母菌介绍及检测方法 一、霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。 具体检测标准参见： GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明： 1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。 高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。 4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平
真菌漆酶的研究进展 宋瑞（安徽大学生命科学学院合肥230039） 【摘要】漆酶是一种蓝色多铜氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶，哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属同族，能够催化多种有机底物和无机底物的氧化[1,2]，同时伴随分子氧还原成水。漆酶广泛分布于真菌、高等植物、少量细菌和昆虫中，尤其在白腐真菌中普遍存在。漆酶特有的结构性质和作用机理使其具有巨大的应用价值。本文就真菌漆酶结构，功能的研究进展作一综述，并对其应用作简单介绍。 【关键词】真菌漆酶三维结构功能应用 1真菌漆酶结构特征 1.1 漆酶的组成 漆酶是一种糖蛋白，肽链一般约由500个氨基酸组成[3]，糖基含量差异较大，占整个分子质量的10%—80%[4]，据相关报道，漆酶的热稳定性可能与其糖基化有关。糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖和阿拉伯糖等。Mayer[5]认为漆酶并不均一，它由多条5000~7000分子量的糖肽链基本结构单元组成。由于结构单元之间的缔合度不同，造成了各种漆酶分子量的不同。另外，分子中的糖基的差异，也会引起漆酶的分子量随来源不同会有很大的差异，从59—390ku不等。真菌漆酶约含19种氨基酸，绝大部分为单体酶，但也有例外，如双孢蘑菇和长绒毛栓菌漆酶由两个亚基组成[6]，而柄孢壳漆酶I由四个亚基组成。漆酶种类繁多，不同种类的真菌产生的漆酶种类不同，即使同一种真菌在不同环境下也产生不同种漆酶。
1.2漆酶的晶体结构 由于漆酶是含糖蛋白质，且糖质量分数较高，一直以来很难获得X-衍射分析所用的单晶体，因此阻碍了关于漆酶结构的研究进展。1998年第一个漆酶晶体是Ducros V[7]制备的来自灰盖鬼伞(Coprinus cinereusv)T1Cu缺失型漆酶晶体，并分析了其结构。至今为止，Bacillus subtilis(CoA)[8]；Melanocarpus albomyces(MaL)[9]；Rigidoporus lignosus(RiL)[10]；Pycnoporus cinnabaricus(PcL)[11]；Coprinus cinereus(CcL)[12]和Trametes versicolor(TvL)[13]漆酶的三维结构已相继被报道。 漆酶分子整体由3个杯状结构域所组成，分别称作结构域A、B、C，每个结构域主要由β-折叠桶，α-螺旋，loop结构所组成。三者紧密结合形成球状结构。这是铜蓝蛋白家族所共有的结构形式[7,9]。分子当中含有二硫键，漆酶种类不同，二硫键数目也不一样，MaL 漆酶分子由3个二硫键，分别是位于结构域A Cys4～Cys12、结构域A和C界面上Cys114～Cys540、结构域C Cys298～Cys332，而CcL，RiL漆酶中则含有两个二硫键。在CcL漆酶分子中，由结构域A的Cys85和结构域B的Cys487形成一个二硫键，另一个二硫键存在于结构域A和结构域B(Cys117—Cys204)之间。一个伸展的loop(氨基酸284—327)连接结构域B和结构域C。Asn343上有N连接的N—乙酰葡萄胺。 1.3 漆酶的催化中心 真菌漆酶分子中一般都含有4个Cu原子，根据磁学和光谱学性
第一节真菌 真菌（fungi）是一大类不含叶绿素，无根、茎、叶，多数类群为多细胞，大多数呈分支或不分支的丝状体，能进行有性和无性繁殖，营腐生或寄生生活的真核微生物。 根据形态可分为： 酵母菌、霉菌和担子菌 三大类群，但这不是真菌学上的分类方法。 真菌属于单独成立的真菌界，第八版《真菌字典》（Ains worth等，1995）将真菌界分为壶菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门、半知菌门五个门，酵母菌、霉菌和担子菌分属于真菌的各门。 真菌中能引起人、畜的疾病，或寄生于植物造成作物减产，称为病原性真菌。 一）酵母菌 酵母菌多数为单细胞。 1、酵母菌的形态 大多数酵母菌为球形、卵形、椭圆形、腊肠形、圆筒形，少数为瓶形、柠檬形和假丝状等。菌细胞比细菌大得多，大小约1~5μm×5~30μm或者更大，在高倍镜下可清楚看到。 不形成真正的菌丝：形成的芽体依次相互连接，就象是丝状，称为假菌丝。 酵母菌有典型的细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核及其他内含物等。 单独的酵母菌细胞是无色的，在固体培养基上形成的菌落，多数是乳白色，少数是黄色或红色。 菌落表面光滑、湿润和黏稠，一般比细菌的菌落大而厚。 酵母菌细胞生长在培养基的表面，菌体容易挑起。有些酵母菌表面是干燥粉状的，有些种培养时间长了，菌落呈皱缩状，还有些种可以形成同心环状等。 菌落的颜色、光泽、质地，表面和边缘特征，均为菌种鉴定的依据。 （二）霉菌(Molds) 又称丝状真菌，是工农业生产中长期广泛应用的一类微生物。 有些霉菌是人和动植物的病原菌，有的能导致饲料等霉败引起中毒。 霉菌由菌丝和孢子构成。 菌丝(hypha)：由孢子萌发而成，菌丝顶端延长，旁侧分支，互相交错成团，形成菌丝体(mycelium)，称为霉菌的菌落。 霉菌菌丝的平均宽度为3～10μm，菌丝的细胞构造基本上类似酵母菌细胞，都具有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质及其内含物。 细胞壁结构类似酵母菌，成分有差别，但也含有几丁质，占细胞干物质的2%～26%。 幼年霉菌菌丝胞浆均匀，老年时出现液泡。霉菌的菌丝分为两种：一种无隔膜，为长管状的分支，呈多核单细胞，称为无隔菌丝，如毛霉和根霉。 另一种有隔膜，菌丝体由分支的成串多细胞组成，每个细胞内含一个或多个核，菌丝中有隔，隔中央有小孔，细胞核及原生质可流动，称为有隔菌丝。 菌丝可有不同的形态，如螺旋状、球拍状、梳状、结节状和鹿角状等数种，具有鉴别意义。霉菌菌丝在功能上有了一定程度的分化，伸入固体培养基内部或蔓生于固体培养基表面。具有摄取营养物质功能的菌丝称为营养菌丝或基质菌丝，伸向空气中的菌丝称气生菌丝。有的气生菌丝发育到一定阶段，分化成能产生孢子的菌丝称为繁殖菌丝。 2、孢子 是霉菌的繁殖器官。是分类鉴定的主要依据：孢子形成过程、形状、大小、排列及色泽等。无性孢子：不经过两性细胞的结合，直接由营养细胞分裂或营养菌丝分化而形成的孢子称为无性孢子。
丝状真菌——霉菌（mold） 霉菌是丝状真菌的俗名，即发霉的真菌，通常是指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。喜好潮湿的气候，大量生长时形成肉眼可见的菌丝体，有较强的陆生性，在自然条件下常引起食物、工农业产品的霉变和植物的真菌病害。 分布：地球上无所不在。种类和数量惊人。主要复杂有机物的分解作用由真菌承担，特别是纤维素、半纤维素和木质素的分解。） 概念：霉菌和酵母同属于真菌。 霉菌：为丝状真菌的统称。凡是在营养基质上能形成绒毛状、网状或絮状菌丝体的真菌（除少数外），统称为霉菌。 按Smith分类系统，霉菌分属于真菌界的藻状菌纲、子囊菌纲和半知菌类。 霉菌的分布： 在自然界分布相当广泛，无所不在，而且种类和数量惊人。 在自然界中，霉菌是各种复杂有机物，尤其是数量最大的纤维素、半纤维素和木质素的主要分解菌。 一般情况下，霉菌在潮湿的环境下易于生长，特别是偏酸性的基质当中。 应用： 1）工业应用：柠檬酸、葡萄糖酸等多种有机酸，淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等多种酶制剂，青霉素、头孢霉素等抗生素，核黄素等维生素，麦角碱等生物碱，真菌多糖、酿造食品以及植物生长刺激素（赤霉素）等的生产；利用某些霉菌对甾族化合物的生物转化以生产甾体激素类药物；以及霉菌在生物防治、污水处理和生物测定等方面的应用等。 2）生产各种传统食品，如酿制酱、酱油、干酪等。 3）基本理论研究：霉菌在基本理论研究中应用很广，最著名的例子是（粗糙脉胞菌）在建立生化遗传学中的作用。 4）工业产品的霉变：食品、纺织品、皮革、木器、纸张、光学仪器、电工器材和照相胶片等都易被霉菌腐蚀，造成霉变。 5）引起植物病害：植物传染性病害的主要病原微生物是真菌。真菌约可引起3万种植物病害。如19世纪中叶在欧洲大流行的马铃薯晚疫病；我国于1950年发生的麦锈病和1974年发生的稻瘟病，使小麦和水稻分别减产了60亿Kg，等等。 6）引起动物疾病：不少致病真菌可引起人体和动物的浅部病变（例如皮肤藓菌引起的各种藓症）和深部病变（例如既可侵害皮肤、粘膜，又可侵犯肌肉、骨骼和内脏的各种真菌），在当前已知道的约5万种真菌中，被国际确认的人、畜致病菌或条件致病菌已有200余种（包括酵母菌在内）。 况下，霉菌在潮湿的环境下易于生长，特别是偏酸性的基质当中。 霉菌的应用： 生产各种传统食品：如酿制酱、酱油、干酪等。 工业应用： 生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸）、酶制剂（如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶）、抗生素（如青霉素、头孢霉素）、维生素、生物碱、真菌多糖、植物生长刺激素（如赤霉素）、生产甾体激素类药物和酿造食品等，另外在生物防治、污水处理和生物测定等方面都有应用。 基本理论研究：霉菌在基本理论研究中应用很广，最著名的是利用粗糙脉胞菌进行生化遗传学方面的研究。 霉菌的危害： 引起霉变：可造成食品、生活用品以及一些工具、仪器和工业原料等的霉变。
真菌漆酶的研究进展及其应用前景 周雪婷,张跃华＊ ,罗志文,潘亭如,缪天琳 (佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007) 摘 要:漆酶生产菌株多为白腐真菌,常用的漆酶活性测定方法有分光光度法、ABTS 法、微量热法等,其降解工业“三废”中的有毒有害物质被认为是一种效率较高,成本较低的且最有前途的方法,其对环境保护的研究以逐渐成为国内外研究的热点,本文阐述漆酶的性质、活性中心、结构特点以及其在环境治理方面的应用。关键词:漆酶;结构;活性中心;环境修复 中图分类号:X592 文献标识码:A 基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助(项目编号:12521573) ＊为本文通讯作者 漆酶最早由Yoshi 从日本紫胶漆树(Rhus vernicifera )漆液 中发现。19世纪末,G .Betranel 首次将能够使生漆固化的活性物质进行分离,命名为“Laccuse ”,即漆酶。漆酶属蓝色多铜氧化酶家族[1,2],与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆中铜蛋白同源。人们将自然界中得到的漆酶分为漆树漆酶和真菌漆酶,其中真菌漆酶极具研究价值。漆酶在生物制浆、污水处理、防腐剂、杀虫剂等化工产品的降解效果显著,用于环境保护、环境监测等领域,在食品工业等方面也有应用[3],已逐渐成为自然科学的研究热点之一。漆酶催化氧化不同种类型的底物已达200余种,广泛用于食品、废水处理、造纸等领域。 国内外真菌漆酶研究主要是以担子菌、子囊菌、脉孢霉、柄孢壳菌和曲霉等真菌来研究漆酶的生物学活性,细菌和放线菌的研究较少,现已在细菌生脂固氮螺菌(Azospirillum lipofer -um )中发现了漆酶的存在。而高等担子菌中的研究对象包括白腐真菌、杂色云芝、平菇、变色栓菌,其中白腐真菌所产的漆酶为胞外酶,可作为主要的产酶者和研究对象。1 漆酶的性质1.1 理化性质 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,不同来源的漆酶铜含量也有所不同,多含有4个铜原子[4]。漆酶多为1条多肽链组成的单聚体,由500～550个氨基酸分子所组成,相对分子质量主要集中在50～80kD ,其碳水化合物约占15%～20%,等电点pI 为3～6,反应温度为30～60℃,pH 低的环境,漆酶的生物活性较高[5-7]。1.2 活性中心 漆酶催化中心根据其光谱性质,存在3种不同的功能:1.2.1 Ⅰ型铜 含铜的蓝色蛋白质,Ⅰ型铜与2个组氨酸和1个半胱氨酸配位,紫外可见光谱λ=600nm 时出现峰值,在EPR (电子顺磁共振)谱上有1个平行超精细耦合结构,Ⅰ型铜参与分子内的电子传递,将电子从底物传递到其它铜原子上。1.2.2 Ⅱ型铜 II 型铜与2个组氨酸和1个水分子配位,形成T 型几何结构,没有明显的可见吸收光谱,但有EPR (电子顺磁共振)信号。1.2.3 Ⅲ型铜 与漆酶的催化作用密切相关,经实验研究其为活性中心, 由2个铜原子通过1个-OH 桥配位连接起来组成四面扭曲的四方立体双核铜区结构,铜原子之间具有抗磁性,其距离是0.38n m 。在紫外可见光谱λ=330nm 处有最大吸收峰,在EPR 上无谱带[8～14];为了测定漆酶活性中心,将其经过抑制剂处理后,Ⅲ型铜在EPR 上出现有裂分峰,表明外源性配体与Ⅲ型铜发生了配位,1个Ⅱ型铜和2个Ⅲ型铜形成三核铜簇,双氧还原的反应位置在三核铜簇,此时Ⅲ型铜已结合5个配体,使其氧化性降低,限制了还原,同时也抑制O 进入三核中心区。 另有实验表明,将漆酶晶型结构被完全还原,Ⅰ和Ⅱ型铜的配位环境不变,Ⅲ型铜的-OH 桥配体则在反应中消耗,2个Ⅲ型铜之间距离亦增加[15]。1.3 检测方法 检测漆酶活性方法有分光光度法[16]、ABTS 法、微量热法、测O 2法、高效液相色谱法[17]、极谱法[18]等。AB TS 法测定漆酶,常用醋酸钠溶液作为缓冲溶液,反应体系内ABTS 的浓度为0.5mmol /L 。漆酶对不同种底物的亲和力也有显著地差异,但其对ABTS 的亲和力和催化能力普遍很高,测得的酶活性值也高,此方法反应条件不高,使用安全,常温下性质稳定,测定的OD 值相对稳定而准确[19]。微量热法测定漆酶的活性,利用LKB -2107Batch 型微量热系统,将其温度调至298K ,pH 调至7.4,此方法漆酶的提取物样品用量较少,可直接对酶的悬浮液进行测定,其对反应体系没有任何限制或干扰,适合研究酶促反应中的酶活。分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定某种漆酶作用的底物,底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基,底物自由基浓度与吸光值成正相关,其在一定的光波波长下存在吸光系数的最大值,依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。分光光度法因其操作简单、快速、较准确、无需配备昂贵仪器设备等特点,得以在漆酶测定实验中广泛应用[20]。 2 漆酶的应用2.1 工业污水治理 真菌降解木质素目前主要集中于生物制浆方面。传统的氯法漂白,在去除纤维原料中木质素的过程中,仍有3%～12%的残留。在漂白废水中会产生大量有毒、有害物质,严重污染 农业与技术 第32卷 第9期 2012年9月 2 AG RIC ULTURE AND LTECHNOLOG Y
真菌鉴定操作常规 一.标本的采集和处理 1. 皮肤、指甲、毛发和组织 在收集标本前用75%酒精消毒病变部位。如果损害处已用了软膏、冷霜或粉剂应事先清洁。取材应用钝手术刀刮取表皮皮屑，或用透明胶带粘取皮屑直接移至载玻片上，水疱取疱壁组织，脓疱则取脓液。皮肤粘膜交界处或菲薄的皮肤部位如龟头、大阴唇、口周、肛周等处以浸有生理盐水的湿棉拭子，檫拭局部后送检。 指甲标本应取变色、萎缩或变脆的部位，以钝手术刀刮除表层，采集病甲边缘下病甲置载玻片上，滴封固液，微加热，使甲溶解。 毛发标本应取无光泽、脆而松动，根部折断的毛发。毛发置载玻片滴加10%KOH溶液，微加热使角质溶解。 组织取病变部位，置无菌生理盐水中送检。以无菌镊子和剪刀剪碎后进行培养或镜检，避免使用组织研磨器对真菌菌丝的折断及机械性损害 皮肤、指甲、毛发和组织标本一般采用直接镜检。 2．眼、耳部标本 怀疑真菌性角膜炎时，应在手术显微镜下以眼科小匙刮取溃疡的基底和边缘部位。怀疑真菌性内眼炎时，应尽可能收集玻璃体液。结膜标本可用消毒生理盐水浸湿的棉拭子拭取。 耳部标本应从耳道中刮屑取材，也可采用拭子取材。 3．脑脊液标本 取3-5ml经腰穿获取的脑脊液标本至无菌管内立即送检。将标本2500rpm离心15分钟，上清液可用于血清学实验，沉淀部分用于培养和涂片镜检。 4．血液、骨髓标本 抽取5－10 毫升血液或骨髓注入需氧菌血培养瓶中，尽快送检。如血培养仪器报告阳性，及时取样接种于沙氏培养基并涂片革兰染色镜检，如发现真菌孢子电话报告病房并登记。 5．体液（包括胸腔、腹腔及关节腔积液）： 将无菌抽取胸水、腹水和关节腔液及时送检。标本放无菌离心管中，2500rpm离心10分钟，取沉渣培养或涂片镜检。 6．尿液 将清洗外阴后留取的中段尿，或经导尿管导出的中段尿，或经皮膀胱穿刺尿立即送检。尿标本应先2500rpm离心10分钟，取沉淀部分进行培养及涂片镜检。 7．阴道分泌物或男性尿道标本 女性由妇科医师用窥器取阴道或宫颈的伪膜或豆渣样凝块。男性则以尿道拭子伸入尿道2.5cm处旋转取出尽可能多的尿道脱落细胞及分泌物，立即送检。 8．呼吸道标本（咳出痰、诱导痰、气管吸痰、支气管肺泡灌洗液、肺组织） 取清晨新鲜咳出的痰，如病人不能咳痰，可用支气管盐水诱导咳痰，插管病人采用气管吸出痰，必要时在纤维支气管镜检的同时获取支气管肺泡灌洗液或支气管毛刷标本。对于局灶性肺部病变，高度怀疑肺部真菌感染的患者可经皮穿刺，在影像学指导下获取病变部位的肺组织。 9．脓液或溃疡、窦道、瘘管等标本 用75%酒精消毒病变部位后刮取脓液，窦道壁及周围尽可能深的部位，若脓肿未破，应以无菌注射器抽出脓液送检。注意寻找并收集脓液中或窦道开口部位的颗粒送检。 10．大便 留取新鲜大便，尽快送检。 收到标本后，应根据申请项目将检验信息录入计算机并获取检验号记录在申请单上 二、真菌的显微镜检查： 1．直接检查： 将待检标本（皮肤、甲屑、毛发或组织）置载玻片上，加一滴载液（根据不同需要选用相应载液），盖上盖玻片，放置片刻或在火焰上快速通过2-3次（不可煮沸），轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用吸纸吸去周围溢液，置显微镜下镜检。检查时先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察菌丝和孢子的形态、特征、位置、大小和排列。结果报告依据镜下情况报：“找到真菌孢子” 或者“找到真菌菌丝”或者“找到真菌菌丝及孢子”。如未找到真菌孢子及菌丝报告“未找到真菌”。 注意：毛发标本不可过度施压以免破坏毛发的结构而影响对菌丝孢子与毛干相对位置关系的判断。 载液：
第五章昆虫病原真菌及其应用 近代利用病原微生物防治害虫的趋向是细菌和病毒的研究快于真菌，直至近十多年来才发现到因真菌引起害虫种群的抑制作用而引起重视。早在公元前5世纪，我国就有利用虫生真菌的白僵蚕入药的记载。冬虫夏草、僵蚕作为药物的记载都是虫生真菌的结果。 能侵染昆虫并使昆虫死亡的真菌的种类很多，目前已知约有530余种真菌，分属于藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，有可能作为微生物杀虫剂的真菌主要是藻状菌和半知菌。最常用于微生物防治的虫生真菌有白僵菌、绿僵菌、拟青菌、多毛菌、虫霉等。其中绿僵菌和白僵菌多。 第一节昆虫病原真菌的利用（白僵菌） 本节内容包括白僵菌（半知菌）的生活史与侵染循环、培养与培养物、大规模生产和制剂种类及其稳定性与应用。通常所说的白僵菌，指的是白僵菌属的真菌。生活史中有分生孢子。 一、白僵菌概述 白僵菌属半知菌纲丛梗孢目，丛梗孢科，白僵菌属。被白僵菌侵染的昆虫可从外形加以识别，多数情况下，虫体上长出白色菌丝体并变硬，在表面长出孢子层，普遍称为白僵病或硬化病 1.形态：白僵菌菌丝体具隔膜、分枝，表面色泽白色至不同程度的乳色，或略带橙黄或红色，偶有绿色。分生孢子梗单生或分枝，最后形成产孢细胞，产孢细胞多为球形，有时呈瓶状的圆柱形，弯曲或正直，孢子生于产孢细胞的呈线形的顶端，产孢细胞生于小枝梗上。白僵菌在虫体上蔓延为白色菌丝，至后期呈淡黄色，有的很快形成粉层状孢子，有的继续保持絮状。 2.种类：分生孢子和分生孢子梗的形态是区别种的主要特征，特别是孢子的大小和形状。经研究，白僵菌属可作为独立种的只有2个种，即白僵菌和卵孢白僵菌。这两个种的区别是：白僵菌的分生孢子约有50%为球形，而卵孢白僵菌的分生孢子约有98%为卵形。之前曾有19个种被描述，后经研究将其归并。 白僵菌的寄主范围很广，有200多种昆虫和螨类，包括鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、直翅目等，白僵菌常常侵染的是幼虫。 二、白僵菌的感染途径及杀虫机理 1.感染途径及侵染过程：白僵菌在虫体上及在培养基上均以无性繁殖完成世代交替。绝大多数真菌是通过体壁侵染寄主的，但有证据表明，白僵菌也可通过口被寄主摄入后，经肠壁感染寄主，经此途径感染的均为咀嚼式口器昆虫，如家蚕、蚱蜢等。也有人认为白僵菌从气门等处进入虫体。对于同翅目、半翅目等刺吸式口器的昆虫，真菌感染的唯一途径是体壁。
1、什么是真菌？ 真菌为真核细胞型微生物，属于真菌界。具有典型的细胞核，不具有叶绿素，以腐生和寄生方式摄取营养，细胞壁含几丁质和纤维素，有完善的细胞器，能进行有性生殖和（ 或）无性繁殖。真菌在自然界分布极为广泛，约有20余万种，大多对人无害，仅有约150种对人和动物致病。 2、真菌的基本结构是什么？ 真菌的基本结构为菌丝和孢子，菌丝为微细的管状结构，具有细胞壁，细胞膜，细胞浆和细胞核，分枝或不分枝，分隔或不分隔，有粗有细，着色或不着色。一般致病真菌的菌丝较细而且分隔。孢子是真菌的繁殖器官，也是抵抗不良环境的结构，类似于高等植物的种子，是真菌分类坚定的最主要依据。 3、引起人和动物感染的真菌分为哪两类？ 引起人和动物感染的真菌分为病原性真菌和条件致病菌两大类。病原性真菌本身具致病性，而条件致病菌一般不具致病性，只有在一定条件下，即机体免疫力降低时才致病。 4、引起真菌病的常见诱因有哪些？ 长期使用广谱抗生素，皮质激素和免疫抑制剂，代谢障碍，血液病，尿毒症，慢性消耗性疾病，外伤，大手术，器官移植，静脉高营养，导插管，放化疗及爱滋病等都是重要的诱因。 5、真菌生长的特点？ 真菌在生长过程中有从中心向四周等距离生长形成圆形菌落的倾向。也正因为这一特点使体股癣的皮肤损害表现为环行或多环行。 6、实验室检查真菌包括什么？ 实验室检查主要包括真菌直接检查和真菌培养。 7 、真菌直接检查的意义？ （1）直接检查阳性有诊断意义，一般可确定有真菌感染，但阴性不能排除诊断。 （2）根据直接检查所见的真菌镜下形态可确定少数病原菌的种，如新型隐球菌，花斑癣菌等。有些可确定属，如念珠菌属等。 （3）直接检查所见的真菌形态，代表该菌在组织内的形态即组织象。（4）真菌镜下形态有时可提示该菌的活动性，如念珠菌出现真菌丝和假菌丝，皮肤癣菌的菌丝肥大粗长多分枝，胞浆浓都表示该菌处于活跃状态。 8 、真菌培养的目的是什么？
真菌和食用真菌的价值及其发展方向 摘要：在中国，真菌食用的历史有6000～7000年，真菌药用的历史有4000多年。药用真菌在中国传统医药中起着重要的作用，是中草药的重要组成部分。具有丰富营养、味道鲜美且兼有保健和药用价值的真菌的开发具有很好的前景。 关键字：食用真菌价值发展方向 参考文献及资料：百度百科—真菌； 徐松波，张学莉，等编著. 食品营养与健康指南，中国医药出版社，1992 黄年来.中国食用菌百科. 北京:中国农业出版社，1993 竹内容雄.日本发酵与工业。1976 商业部昆明食用菌研究所.昆明：中国食用菌，1995～2001 上海市农业科学院.上海：食用菌，1995~2001 郑建仙.功能性食品.中国轻工出版社，1995 荣福雄，等.8254山西金黄银耳医疗保健作用的研究.全国食用菌新成果、新技术学术交流会论文集，1994， 6 荣福雄，等. 8254金黄银耳多糖抗辐射损伤的研究. 香港首届国际食用笛会议论文集l993 潘继红，等. 灵芝、酵母“双菌”，发酵饮料的研制.食品科学.1997,(8)22-24 潘继红，等.猴头功能饮料生产工艺初探.食用菌，1995，增刊，42-43
可食用真菌更是价值非凡。在中国，真菌食用的历史有6000～7000年，真菌药用的历史有4000多年。药用真菌在中国传统医药中起着重要的作用，是中草药的重要组成部分。早在东汉末年的《神农本草经》中就记载了10余种药用真菌。明代《本草纲目》中记载了40多种药用真菌。当前，灵芝、虫草等传统药用真菌仍在被广泛使用。这些传统药用真菌作为中医药的代表之一，在向世界弘扬中华文化中发挥着重要作用。现代疾病对人类的威胁正在改变着疾病谱，要求医疗模式由单纯的疾病治疗向预防、保健、治疗、康复相结合的模式转变，各种替代医学和传统医学将发挥越来越大的作用，在这种背景下形成的“回归自然”的世界潮流正推动着国际社会对天然药物和营养药物需求的日益增长。因此，具有丰富营养、味道鲜美且兼有保健和药用价值的真菌的开发具有很好的前景。 食用菌是可供人类食用的大型真菌（Macroscopic Fungi）。通常也称为菇、菌、蕈、蘑、耳。全世界有10000 多种肉质菌（Fleshy mushroom）,目前中国已报道的食用菌有850 多种，其中大约有80 多种是美味的，人工栽培的近的50 种，其中形成大规模商业性栽培的15 种左右。在农业不发达的年代，菌类成为人们用以充饥的食物来源。到了现代，菌类成为一种菜肴和美味食品。菌类的营养成分介于肉类和果蔬之间。菌类的蛋白质含量，鲜品为自身重的2％-5％，干品达30％-40％，香菇、金针菇、蘑菇等的蛋白质含量均较高，比一般的蔬菜高几倍至几十倍。菌体蛋白质是最优良的蛋白质，氨基酸种类齐全，一般人体必需的8-9 种氨基酸，如赖氨酸、氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸及异亮氨酸等均有，且不含有高脂肪及高胆固醇等不利影响，是典型的低热量食品。菌类中的生理活性物质，如矿质元素、维生素、核酸及多糖类化合物不但含量丰富，而且使菌类食品有别于一般食品，成为一类高营养价值的风味食品、保健食品和抗癌食品。许多食用菌既是美味佳肴，又具有独特的医疗作用。一般认为，菇类具有益气、清神、理肠胃等功能，但不同菇类还有其独特的医疗作用。灵芝，我国古代传说为”仙草”，历代本草学家都认为灵芝能治疗多种疾病，而且是滋补强壮、扶正固本的药物。通过现代临床试用已证实灵芝对慢性气管炎、急性肝炎等均有一定疗效。经药理研究证明灵芝具有保肝、解毒、强心、镇静、抗缺氧及抗惊厥等多方面的生物活性。茯苓，自古以来就是一种常用中药。临床上主要用于治疗水肿、急性肝炎和急性肾炎等。药理实验证明，茯苓有利尿和一定镇静作用。木耳性平、味苷，能润肺清肠和消化纤维，它是矿业和纺织工人的保健食品。木耳并具有益气强身、活血、止血等功效，是中医治疗寒湿腰痛的辅药。《本草纲目》中认为木耳能”疗痔”。香菇，性平、味甘，能化痰理气、益味助食等，同时又能增强人体的抗病力及防治感冒。经常食用香菇，可预防坏肉病、肝硬
漆酶来源与应用 万云洋1,2，杜予民2 1.中国石油大学（北京）资源与信息学院，北京（102249） 2.武汉大学资源与环境科学学院，武汉（430079） E-mail ：yunyangwan@https://www.doczj.com/doc/578006486.html, 摘 要：本文对漆酶来源，包括动物、微生物和植物，尤其是我国的特产资源漆树及其他植 物漆酶，酶的稳定化及固定化，生物整治、对木质素的作用以及其各方面的应用作一综述。 关键词：漆酶，漆树，生物整治，木质素，固定化 漆酶(EC1.10.3.2)，对－二酚:(双)氧氧化还原酶，又名酚酶，多酚氧化酶，漆酚氧化酶 和等，是一种含铜的糖蛋白氧化酶，是多铜氧化酶的一种[1]。对漆酶的研究已有一百多年的 历史，是有记载以来开发最早的酶之一：1883年，日本人吉田在研究生漆液成份时发现这 种酶成份，但当时他误为淀粉酶物质(diastatic matter)，1898年，法国人Bertrand 在研究越南 产漆液的时候，首次提出了漆酶(laccase)的概念并沿用至今[2-5]；Reinhammar 等[6;7]、杜予民 等[8-12]对漆酶及漆树液全成份的分离纯化作了很好的工作；另外，熊野等[13;14]对漆酶反应机 理，黄葆同、甘景镐[15]等对中国漆酶化学的发展，Morpurgo(意大利)[16;17]，Solomon(美国) 等[18-24]对漆酶铜原子中心的研究作出了各自的贡献。 漆酶虽然是研究史中的老酶，但其各种新功能也正在被发现和挖掘。本文结合自身工作实践，专门就漆酶来源、特别是植物漆酶来 源和其各方面的应用研究作一综述，进一步推动漆酶(尤其是植物漆酶)研究的发展。 Figure 1. Dominating distribution of lacquer trees in the world. 1. 漆酶的来源 1.1植物漆酶 由上述可知，对漆酶的研究首先就是从漆树来源开始的。漆树(Rhus vernicifera ) 种属于 75 90 105120135 15015 30 45