铜绿假单胞菌感染治疗策略
铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌常定植于正常人的呼吸道,皮肤粘膜以及医疗设备等处。当患者免疫力低下,长期使用广谱抗生素,糖皮质激素及接受吸氧、气管插管机械通气时,铜绿假单胞菌大量繁殖,往往导致严重下呼吸道感染。因为铜绿假单胞菌的耐药及复发率高,故临床治疗较为困难。为更好地预防和控制医院感染，建议应采取以预防为主，加强对铜绿假单胞菌的耐药性监测，及早进行菌株鉴定和药敏检测，避免大量和长期使用同一类型的抗菌药物，并规抗菌药物的应用，具体措施如下：
一、阻断病原菌播散
医院加强对高危患者的病原菌监测，尤其将下列患者列为目标监测的重点：住在ICU、接受过广谱抗菌药物治疗或抗菌药物治疗效果不佳的患者，留置各种导管以及合并慢性基础疾病的患者。对目标监测患者进行主动筛查和定期监测，及时发现、早期诊断铜绿假单胞菌感染与定植患者。如：患者的呼吸道长期定植铜绿假单胞菌，到多家医院就诊导致其克隆传播，致使不同医院间存在同一克隆株的PA,因此，加强对铜绿假单胞菌定植患者的监控，是控制克隆株播散的关键。有文献报导PA克隆朱主要在ICU病房流行，原因可能为ICU住院患者病情重、自身免疫力低下，多接受过侵入性治疗，因此，加强病区（尤其是重点科室）的消毒、隔离和监控工作，阻断外源性传播媒介，是有效控耐药PA在医院感染发生和流行的重要途径。
二、加强监测抗铜绿假单胞菌的药物及其敏感性
目前可用于治疗铜绿假单胞菌感染的药物基本有六类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-酰胺类，氨基糖苷类和喹诺酮类，另外多黏菌素类(如黏菌素，多黏菌素B)以及磺胺类(甲磺灭脓、磺胺嘧啶银)主要用于铜绿假单胞菌的局部感染的治疗。多黏菌素B 也用于难治性的铜绿假单胞菌感染的全身治疗。2011年中国C H IN E T铜绿假单胞菌耐药性监测显示铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率
最低，为14．3%，对头孢哌酮和氨曲南的耐药率最高，分别为31.7%和38.9%，对其他抗菌药物的耐药率为19～30%，耐药率从低到高依次为：阿米卡星<头孢吡肟<头孢他啶<头孢哌酮一舒巴坦<环丙沙星<哌拉西林一他唑巴坦<庆大霉素<美罗培南<亚胺培南<哌拉西林<头
孢哌酮<氨曲南。
（1）青霉素类药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林、替卡西林、替卡西林／克拉维酸，其中以哌拉西林最常用于铜绿假单胞菌导致的肺部感染。
（2）头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹胺是铜绿假单胞菌的敏感药物。头孢他啶是目前针对铜绿假单胞菌作用最强的药物，头孢吡肟对铜绿假单胞菌的作用与头孢他啶相似，头孢哌酮对铜绿假单胞菌有良好的抗菌作用，可用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药，头孢匹胺对铜绿假单胞菌的作用与头孢哌酮和哌拉西林相似或略优。
（3）碳毒霉烯类药物该类药物抗菌谱特别广，抗菌活性强。治疗PA感染应首选敏感药物碳青霉烯类，并且初始剂量宜大，以增强其
迅速的杀菌能力和延长药物浓度依赖性的药物后效应。
（4）单环β-酰胺类药物该类药物包括氨曲南，对铜绿假单胞菌的作用低于头孢他啶，与庆大霉素相近，可对抗金属酶。
（5）氨基糖苷类药物该类药物包括妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星，铜绿假单胞菌对氨基糖苷类药物的敏感性依次为阿米卡星>妥布霉素>庆大霉素，因此，对庆大霉素、妥布霉素耐药的菌株对阿米卡星可能敏感，氨基糖苷类药物常用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药。协同效果最好的是阿米卡星与头孢他啶组合。
（6）喹诺酮类药物该类药物包括环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星，对铜绿假单胞菌都有较好的抗菌活性，其中环丙沙星优于同类其他药品。
（7）其他类药物磷霉素结构独特、耐酶、抗菌机制特异，有抗铜绿假单胞菌的作用，但抗菌活性不强。
三、药物治疗
具有抗假单胞菌活性的药物包括抗假单胞菌青霉素及其与β- 酰胺酶抑制剂复合制剂（替卡西林、羧苄西林、哌拉西林、美洛西林、阿洛西林、哌拉西林一他唑巴坦、替卡西林。克拉维酸）、抗假单胞菌头孢菌素及其与β- 酰胺酶抑制剂复合制剂（头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢哌酮- 舒巴坦）、抗假单胞菌碳青霉烯类、氨曲南、抗假单胞菌喹诺酮、氨基糖苷类、磷霉素及多黏菌素等。
1.目前推荐用于治疗铜绿假单胞菌的药物
1.1 β酰胺类抗生素
（1）半合成青霉素类：哌拉西林。
（2）第三代头孢菌素：头孢哌酮、头孢噻肟、头孢匹胺、头孢他啶等。
（3）碳青酶烯类：亚胺培南/西司他丁、美罗培南、比阿培南、多尼培南等。
（4）第4代头孢菌素：近年来新开发的头孢立定最突出的特点是具有极强的抗铜绿假单胞菌活性，其作用是氨曲南的4倍，是头孢他啶的4~16倍。
1.2 β酰胺类抗生素与β酰胺酶抑制剂组成的复方抗生素
（1）安灭菌：阿莫西林+克拉维酸。
（2）特美汀：替卡西林+克拉维酸。
（3）舒普深：头孢哌酮+舒巴坦。
（4）特治星：哌拉西林+他唑巴坦等。
1.3 氨基糖苷类抗生素
（1）阿米卡星。
（2）妥布霉素等。
1.4 氟喹诺酮类
（1）环丙沙星。
（2）氧氟沙星。
（3）氟罗沙星等。
2. 目前推荐用于铜绿假单胞菌感染的治疗方案
2.1 轻度感染，使用哌拉西林（或环丙沙星）+妥布霉素。
2.2 中~重度感染，采用上诉3代头孢菌素+阿米卡星。
2.3 极严重或伴有免疫功能受损的患者采用亚胺培南（或氨曲南）+阿米卡星。
2.4 联合应用β酰胺类（如头孢吡肟、头孢他啶或氨曲南）和氨基糖苷类抗生素（如阿米卡星）对铜绿假单胞菌有协同作用。铜绿假单胞菌对这两类药物有交叉耐药的菌株仅占1.3%。
2.5 头孢吡肟与氨曲南合用，对铜绿假单胞菌有协同作用。
2.6 联合应用阿奇霉素和氟罗沙星。因为阿奇霉素虽然本身无抑制铜绿假单胞菌的作用，但可抑制该菌生物被膜的形成，增加氟罗沙星对生物被膜的渗透性，提高后者抗铜绿假单胞菌的作用。
2.7 局部用药。经纤支镜反复做支气管肺泡灌洗，或经雾化器吸入方式局部给予阿米卡星或头孢他啶，可作为铜绿假单胞菌肺炎的一种辅助疗法。
2.8 铜绿假单胞菌噬菌体是一种生态制剂。它是细菌病毒，具有高度特性，能在细菌胞繁殖，最终将菌细胞裂解。临床上已将其用于呼吸道和皮肤等处治疗铜绿假单胞菌的感染。
对于非多重耐药铜绿假单胞菌感染或病情较轻的患者可采取具有抗假单胞菌活性抗菌药物的单药治疗，通常采用B- 酰胺类抗生素，如酶抑制剂复合制剂（哌拉西林- 他唑巴坦、头孢哌酮- 舒巴坦）、头孢菌素类（头孢他啶、头孢吡肟）或碳青霉烯类（美罗培南、亚胺培南）。
氟喹诺酮类和氨基糖苷类可在β- 酰胺类过敏或其他原因不能使用时采用，或作为联合治疗用药。对多重耐药铜绿假单胞菌感染或重症患者常需要以敏感的β- 酰胺类抗生素为基础的联合治疗，并尽可能避免患者近期使用过的抗菌药物。β- 酰胺类抗生素与氨基糖苷类或氟喹诺酮类抗菌药物联合可提高对铜绿假单胞菌的抗菌活性，荟萃分析结果显示，联合用药组病死率均低于单药治疗组。
铜绿假单胞菌肺炎治疗的国外指南常推荐联合用药，包括抗假单胞菌β- 酰胺类+ 氨基糖苷类，或抗假单胞菌β- 酰胺类+ 抗假单胞菌喹诺酮类，或抗假单胞菌喹诺酮类+ 氨基糖苷类；也可采用双β- 酰胺类联合治疗。而对碳青霉烯类耐药尤其是广泛耐药或全耐药铜绿假单胞菌的肺部感染，国外推荐上述联合的基础上再加多黏菌素的治疗。针对铜绿假胞菌肺炎初始治疗的抗菌药物选择见下表(肝功能正常成年患者给药方案)：
(a一般作为青霉素过敏患者的备用药物，b应调整剂量使血清谷浓度＜1ug/ml；c应调整剂量使血清谷浓度＜4-5ug/ml)
抗假单胞菌青霉素类和头孢菌素类及其与酶抑制剂复合制剂均属于时间依赖性抗生素，血清药物浓度高于MIC 的时间%(T>MIC%) 与临床疗效密切相关。这类药物需日剂量分3-4 次给药，以加强杀菌作用和提高临床疗效。碳青霉烯类可通过延长滴注时间提高对铜绿假单胞菌严重感染或耐药菌感染的疗效，如美罗培南可缓慢持续静脉输注2-3 h。
氨基糖苷类药物是浓度依赖性抗生素，临床实施氨基糖苷类药物日剂量单次给药方案来控制感染性疾病。环丙沙星和左氧氟沙星均为浓度依赖性抗菌药物，左氧氟沙星日剂量单次给药，环丙沙星日剂量分2-3 次给药。
美国临床实验室标准化研究所（CLSI）建议，对铜绿假单胞菌
严重感染患者的治疗，用大剂量抗假单胞菌青霉素或加酶抑制剂复合制剂，并推荐与氨基糖苷类或氟喹诺酮类联合应用。目前已发现十四、十五元环大环酯类抗生素：红霉素、克拉霉素、阿奇霉素等在体外能抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。喹诺酮类药物与大环酯类无拮抗作用，在细菌生物被膜形成初期有较强渗透性。克拉霉素与加替沙星联合应用，在抑制铜绿假单胞菌生物被膜同时加强了抗菌药物的渗透性，起到了较好的杀菌作用。诺氟沙星也是一种铜绿假单细胞菌敏感性相对较高的抗菌类药物，对抗呼吸道感染效果明显，与阿奇霉素以及哌拉西林联合使用后，可进一步增强整体药效。三联用药对铜绿假单细胞菌的抑制力度明显更强，整体用药效果明显增强。
四、掌握目前PA耐药趋势
铜绿假单胞菌临床感染类型分为菌血症、肺炎、烧伤和手术部位感染、脑膜炎、眼科术后感染和泌尿道感染。随着PA耐药率增加,且呈多重耐药,其趋势是:对碳青霉烯类仍最敏感,但敏感率已经下降甚至明显下降;头孢哌酮/舒巴坦钠和哌拉西林/三唑巴坦对PA显示较好抗菌活性;头孢他啶和头孢吡肟抗PA活性与碳青霉烯类相仿或略优;喹诺酮类对PA耐药率不断增加,而氨基糖苷类仍保留较好活性。在我国,因为头孢哌酮/舒巴坦钠和头孢他啶对PA的良好抗菌活性,在尚未威胁生命的中重度感染可以作为首选药物。
五、研发新药
针对耐药PA的耐药机制探索新的药物作用靶点，如：作用于外
排泵系统的外排泵抑制剂（1）CCCP是最典型的质子泵抑制剂，通过抑制细菌细胞膜主动外排系统能量来源的跨胞浆膜质子浓度梯度，来破坏外排系统的主动外排作用，使药物在细菌体的蓄积浓度增加。（2）植物来源外排泵抑制剂研究发现，粉防己碱能够使多药耐药的铜绿假单胞菌对氧氟沙星的耐药性明显降低，不同浓度的粉防己碱在与铜绿假单胞菌作用不同时间后，原来的M IC值可以降低23倍～27倍。可以考虑将主动外排泵抑制剂粉防己碱作为一种治疗耐药铜绿假单胞菌辅助药物，增强铜绿假单胞菌对氧氟沙星的敏感性，从而提高抗菌药物疗效。（3）有研究发现不同浓度穿心莲酯可在mRNA水平抑制铜绿假单胞菌外排泵MexA B-OprM的表达，使其恢复对抗菌药物的敏感性。（4）近来研究还发现了一种新的外排泵抑制剂：MC-207，110。这是一种广谱的泵抑制剂，对铜绿假单胞菌所有四类外排泵均有抑制作用。因此，外排泵抑制剂可和抗生素联合应用于抗菌治疗。
铜绿假单胞菌生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 假单胞菌普遍存在,而在潮湿环境尤甚。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌，它偶尔可在腋下和肛门生殖道周围的正常皮肤,但除非给服抗生素,在粪中甚为罕见。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染.假单胞菌感染通常发生于医院内。洗涤槽,防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室.是重要的医院内病原菌。 铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌,是换气机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外,HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染,而且一旦被铜绿假单胞菌感染,常可出现晚期HIV感染的体征。 铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位,包括皮肤,皮下组织,骨,耳,眼,尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时,焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所,进而成为引起菌血症的病灶,而菌血症常是烧伤的致死性并发症。 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。在住院病人中,若口咽部有绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌共同繁殖,则气管插管,气管切开或间歇性正压呼吸可引起肺部感染。囊性纤维病的后期铜绿假单胞菌性支气管炎常见，分离得到的菌株有粘液状菌落的形态学特征。烧伤伴有恶性肿瘤的病人常见在其血液中分离出该菌株,临床表现为革兰氏阴性败血症,有时出现坏疽性深部脓疱,其特征为直径约1cm的紫黑色病变,中央区溃疡,四周为红斑。这种病变最常见于腋下和肛门生殖器部位。该菌还是 尿路感染的常见病原菌,特别常见于有过泌尿科操作的病人,尿路梗阻的病人或接受广谱抗生素的病人。 热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎,表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹,需要肠外给药治疗。绿脓杆菌眼部感染一般表现为角膜溃疡,最多见于外伤之后,但有些病人也可因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染。引流的窦道,特别在足部外伤或深部穿刺伤后,可发现该菌菌。引流物常有汗味和果味.这种穿刺伤有很多可引起铜绿假单胞菌性蜂窝织炎和骨髓炎,为此除抗生素外,还要早期外科扩创。 罕见情况下该菌可引起心内膜炎,通常发生于心脏直视手术所装的人工瓣膜或静脉吸毒者的自然瓣膜上。右侧心内膜炎用内科治疗,但为根治累及二尖瓣,主动脉瓣或人工瓣膜的感染,通常必须将感染的瓣膜切除。 二、细菌的生物学特性 铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，是一种非发酵革兰阴性菌，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有一根鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。本菌生长温度范围25~42℃，最适生长温度为35℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。需氧生长，在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素。在血平板上会溶血。 该菌含有O抗原（菌体抗原）以及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。O抗原可用以分型。 细菌的实验室检查及其它检查 1.标本采集采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。 2.染色镜检为革兰阴性菌，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有一根鞭毛。 3.分离培养对有正常菌群存在的临床标本或采自环境中的标本应接种选择性培养基如MAC；
铜绿假单胞菌感染 百科名片 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)在自然界分布广泛，对人类而言，属于条件致病菌。长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后(气管切开、保留导尿管等)的病人易导致本菌感染，故认为该菌为医院内感染的重要病原菌之一。 [编辑本段]病原 铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌种，在琼脂平板上能产生蓝绿色绿脓素，感染伤口时形成绿色脓液。本菌为无荚膜、无芽胞、能运动的革兰阴性菌，形态不一，成对排列或短链状，为专性需氧菌，最适宜生长温度为370C，致病性铜绿假单胞菌在420C 时仍能生长，据此可与荧光假单胞菌等进行鉴别，本菌生长对营养要求不高。菌体0抗原有两种成分，一为内毒素蛋白，是一种保护性抗原，另一为酯多糖，具有特异性，根据其结构可将铜绿假单胞菌分成12个血清型，此外还可利用噬菌体或铜绿假单胞菌素分型。铜绿假单胞菌对外界环境抵抗力较强，在潮湿处能长期生存，对紫外 线不敏感，湿热550C 1小时才被杀灭。 [编辑本段]流性病学 正常人皮肤，尤其潮湿部位如腋下、会阴部及耳道内，呼吸道和肠道均有该菌存在，但分离率较低。铜绿假单胞菌感染常在医院内发生，医院内多种设备及器械上均曾分离到本菌，通过各种途径传播给病人、病人与病人的接触也为传播途径之一。除院内感染外，铜绿假单胞菌还可引起与医院环境无关的感染，近年来对此已有更多的认识，它已成为足穿刺感染、心内膜炎、滥用药物所致的骨髓炎、眼部感染、新生儿感染性外耳炎、游泳池等引起的皮肤病的主要病原菌，亦是战伤感染的常见致病 菌。 [编辑本段]发病机制 铜绿假单胞菌的多种产物有致病性，其内毒素则在发病上无重要意义。其分泌的外毒素A(PEA)是最重要的致病、致死性物质，进入敏感细胞后被活化而发挥毒性作用，使哺乳动物的蛋白合成受阻并引起组织坏死，造成局部或全身疾病过程。动物模型表明：给动物注射外毒素A后可出现肝细胞坏死、肺出血、肾坏死及休克等，如果注射外毒素A抗体则对铜绿假单胞菌感染有保护作用。铜绿假单胞菌尚能产生蛋白酶，有外毒素A及弹性蛋白酶同时存在时则毒力最大;胞外酶S是铜绿假单胞菌所产生的一
铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa，PA）是一种革兰阴性杆菌，也是临床最常见的非发酵菌，在自然界广泛分布，可作为正常菌群在人体皮肤表面分离到，还可污染医疗器械甚至消毒液，从而导致医源性感染，是医院获得性感染重要的条件致病菌，具有易定植、易变异和多耐药的特点。下呼吸道是医院内细菌感染最常见的发生部位，感染种类主要包括支气管扩张合并感染、慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）合并感染和肺炎等，由多重耐药PA（multidrug resistant P aeruginosa，MDR-PA）引起的下呼吸道感染病死率高，治疗困难，因此规范PA下呼吸道感染的诊断和治疗具有特别重要意义。 一、微生物学特点 假单胞菌属为需氧、有鞭毛、无芽孢及无荚膜的革兰阴性杆菌，和不动杆菌属、黄杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌等共同构成非发酵糖（Nonfermenters）革兰阴性杆菌，是常见的条件致病菌，是医院感染的主要病原之一。PA是假单胞菌的代表菌株，占所有假单胞菌感染的70%以上。PA呈球杆状或长丝状，宽约0.5～1.0 μm，长约1.5～3.0 μm，一端有单鞭毛，无芽孢，成双或短链排列。PA能产生多种色素，如绿脓素和荧光素等，专性需氧，部分菌株能在兼性厌氧条件下生长。 二、流行病学 （一）流行状况 近年来，PA感染的流行病学特点突出地表现在两个方面，一是院内感染尤其是肺部感染的发病率不断增加。国内已有多项大型流行病学调查显示我国PA感染的严重性，其中最具代表性的“中国CHINET细菌耐药性监测”资料显示，2012年综合性教学医院PA的分离率占所有分离菌的第5位，2005-2012年PA的分离率分别占革兰阴性菌的11.6%、14.1%、16.9%、16.4%、15.8%、14.8%、14.2%和14.0%，居第2~5位[1]。有13家教学医院参与的中国医院院内获得性细菌耐药性分析（CARES）结果显示，2009年和2011年PA在所有分离细菌中也是居第4位，分离率分别为10.8%和12.6%[2]，且MDR-PA的比例高达12.7%。这一点在呼吸系统感染更为突出，根据美国疾病预防控制中心（CDC）的全国医院感染研究数据显示，PA 肺炎的发生率在逐年升高，1975-2003年医院获得性肺炎（HAP）中PA比例从9.6%上升至18.1%，几乎翻了一倍[3]。一项大规模ICU感染病原学的流行病学调查结果显示，PA是最常见的革兰阴性需氧菌，占23%（8 244/35 790），也是最常见的从呼吸道分离出的细菌（31.6%）[4]。美国一项关于呼吸机相关肺炎（VAP）的回顾性研究结果显示，PA分离率达9.3%。即便得到有效地治疗，PA导致的感染总病死率仍高达42.1%~87.0%，直接病死率为 32.0%~42.8%[5]。2005年胡必杰等[6]报道562例HAP中PA的分离率为18.6%，列第1位；我国近期进行的13家大型教学医院HAP的临床调查结果显示，PA的分离率为20.9%，居第2位[7]。2011年CARES研究也证实HAP中PA的分离率为22.9%，居第2位[2]。二是PA的耐药率居高不下，全球细菌耐药监测数据（SENTRY）显示PA在HAP致病原中居前几位，同时对常用抗菌药物耐药率的逐年升高[8]。中国CHINET 2005-2012年连续监测资料显示，PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0%、42.8%、35.8%、30.5%、30.5%、30.8%、29.1%和29.1%，对美罗培南的年度
铜绿假单胞菌的生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 假单胞菌普遍存在,而在潮湿环境尤甚。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌,它偶尔可在腋下和肛门生殖道周围的正常皮肤,但除非给服抗生素,在粪中甚为罕见。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染.假单胞菌感染通常发生于医院内。洗涤槽,防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室.是重要的医院内病原菌。 铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人,它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌,是换气机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外,HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染,而且一旦被铜绿假单胞菌感染,常可出现晚期HIV感 染的体征。 铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位,包括皮肤,皮下组织,骨,耳,眼,尿 路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时,焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所,进而成为引起菌血症的病灶,而菌血症常是烧伤的致死性并发症。 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。在住院病人中,若口咽部有绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌共同繁殖,则气管插管,气管 1 切开或间歇性正压呼吸可引起肺部感染。囊性纤维病的后期铜绿假单胞菌性 支气管炎常见,分离得到的菌株有粘液状菌落的形态学特征。烧伤伴有恶性肿瘤的
病人常见在其血液中分离出该菌株,临床表现为革兰氏阴性败血症,有时出现坏疽性深部脓疱,其特征为直径约1cm 的紫黑色病变,中央区溃疡,四周为红斑。这种病变最常见于腋下和肛门生殖 器部位。该菌还是 尿路感染的常见病原菌,特别常见于有过泌尿科操作的病人,尿 路梗阻的病人或接受广谱抗生素的病人。 热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最 常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎,表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹,需要肠外给药治疗。绿脓杆菌眼部感染一般表现为角膜溃疡,最多见于外伤之后,但有些病人也可因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染。引流的窦道,特别在足部外伤或深部穿刺伤后,可发现该菌菌。引流物常有汗味和果味.这种穿刺伤有很多可引起铜绿假单胞菌性蜂窝织炎和骨髓炎,为此除抗生素外,还要早期外科扩创。 罕见情况下该菌可引起心内膜炎,通常发生于心脏直视手术所装的人工瓣膜或静脉吸毒者的自然瓣膜上。右侧心内膜炎用内科治疗,但为根治累及二尖瓣,主动脉瓣或人工瓣膜的感染,通常必须将感染的瓣膜切除。 二、细菌的生物学特性 铜绿假单胞菌属于假单胞菌属,是一种非发酵革兰阴性菌,菌体细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。菌体的一端有一根鞭毛,在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。本菌生长温度范围25~42℃,最适生 长温度为35℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。需氧生长,在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素。在血平板上会溶血。
保健用品微生物检验方法 第3部分：铜绿假单胞菌测定 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品中微生物中铜绿假单胞菌的测定方法。 本标准适用于生产和经营的保健用品中的铜绿假单胞菌测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃±1 ℃条件下能生长。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。 4.1 灭菌生理盐水:详见附录A.1。 4.2 灭菌液体石蜡:详见附录A.2。 4.3 灭菌吐温-80:详见附录A.3。 4.4 SCDLP:详见附录A.4。 4.5 十六烷基三甲基溴化铵:详见附录A.5。 4.6 乙酰胺:详见附录A.6。 4.7 革兰氏染液:详见附录A.7。 4.8 绿脓菌素测定培养基:详见附录A.8。 4.9 硝酸盐蛋白胨水:详见附录A.9。 4.10 明胶液化培养基:详见附录A.10。
5 仪器和设备 5.1 天平：感量0.1 g。 5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 5.3 高压灭菌器。 5.4 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。 5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 5.6 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。 5.7 研钵。 5.8 振荡器。 5.9 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃、28 ℃±2 ℃。 5.10 接种针、接种环。 5.11 显微镜。 5.12 小倒管。 5.13 玻璃棒。 5.14 冰箱：2 ℃～5 ℃。 6 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应从不少于2 个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。包装量小于20 g的样品，采样时可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.2.5 如检出铜绿假单胞菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成1:10匀液。 油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL 灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预温），在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。
一例支气管扩张继发感染铜绿假单胞菌治疗分析 一、病史简介 患者，男性，84岁，身高177cm，体重79kg，因“慢性咳嗽、咳痰、喘息30年，加重半月”入院。现病史：患者30年前无明显诱因出现慢性咳嗽、咳痰、以黄脓痰为主，伴喘息，活动后明显。病情反复发作，逐年加重，治疗期间给予喹诺酮类、头孢类药物等进行抗感染治疗。半月前，患者无明显诱因出现咳嗽、咳黄痰、痰量多、伴喘息加重，活动后明显，门诊以“支气管扩张继发性感染”收入我院。既往有慢支、肺气肿、肺心病、支气管扩张、骨质疏松症病史。否认肝炎、结核病等传染病史，否认高血压、糖尿病史，否认药物过敏史。体格检查：体温36.3℃，脉搏95次/分，呼吸22次/分，血压121/87mmHg，神清语明，查体合作。咽无充血、红肿，扁桃体无肿大，桶状胸，双肺听诊呼吸音粗糙，双肺闻及广泛干啰音。辅助检查：血常规：白细胞11.59×10?/L；中性粒细胞百分比：78.5%；C-反应蛋白：159mg/L；胸部CT平扫：1.左肺上叶陈旧性肺结核，2.双肺支气管扩张继发性感染。临床确定诊断为支气管扩张继发性感染、慢性支气管炎继发性感染、阻塞性肺气肿。 二、治疗经过 入院后完善相关检查，在化痰、平喘的同时给予抗感染治疗。初始治疗方案给予左氧氟沙星注射液500mg ivgtt qd。入院第4天，患者咳嗽、咳黄痰、痰量多且不易咳出、喘息症状无缓解，血常规：白细胞12.5×10?/L；中性粒细胞百分比：85.9%；C-反应蛋白：186mg/L。痰培养结果：铜绿假单胞菌。药敏结果：氨苄西林、氨苄西林/棒酸、阿莫西林/棒酸为耐药；左氧氟沙星、环丙沙星为中介；头孢他啶、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦为敏感。经药师建议，停用左氧氟沙星，加用头孢哌酮舒巴坦 3.0g ivgtt bid，联合用硫酸依替米星 0.15g ivgtt qd。入院第7天，患者咳嗽、咳痰有所减轻，继续抗感染6天，患者述无痰，偶有咳嗽，喘息明显减轻。复查C-反应蛋白<3.71 mg/L,复查肺CT,炎症情况较入院前好转。入院第13天，患者病情平稳，要求出院。出院带药吸入用布地奈德福莫特罗粉吸入剂1盒，160μg 雾化吸入 bid。嘱患者每次吸完药后用水漱口，不要吞咽。
铜绿假单胞菌 的生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 假单胞菌普遍存在,而在潮湿环境尤甚。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌，它偶尔可在腋下和肛门生殖道周围的正常皮肤,但除非给服抗生素,在粪中甚为罕见。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染.假单胞菌感染通常发生于医院内。洗涤槽,防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室.是重要的医院内病原菌。 铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌,是换气机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外,HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染,而且一旦被铜绿假单胞菌感染,常可出现晚期HIV感染的体征。 铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位,包括皮肤,皮下组织,骨,耳,眼,尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时,焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所,进而成为引起菌血症的病灶,而菌血症常是烧伤的致死性并发症。 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。在住院病人中,若口咽部有绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌共同繁殖,则气管插管,气管切开或间歇性正压呼吸可引起肺部感染。囊性纤维病的后期铜绿假单胞菌性支气管炎常见，分离得到的菌株有粘液状菌落的形态学特征。烧伤伴有恶性肿瘤的病人常见在其血液中分离出该菌株,临床表现为革兰氏阴性败血症,有时出现坏疽性深部脓疱,其特征为直径约1cm的紫黑色病变,中央区溃疡,四周为红斑。这种病变最常见于腋下和肛门生殖器部位。该菌还是 尿路感染的常见病原菌,特别常见于有过泌尿科操作的病人,尿路梗阻的病人或接受广谱抗生素的病人。 热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎,表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹,需要肠外给药治疗。绿脓杆菌眼部感染一般表现为角膜溃疡,最多见于外伤之后,但有些病人也可因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染。引流的窦道,特别在足部外伤或深部穿刺伤后,可发现该菌菌。引流物常有汗味和果味.这种穿刺伤有很多可引起铜绿假单胞菌性蜂窝织炎和骨髓炎,为此除抗生素外,还要早期外科扩创。
铜绿假单胞菌感染治疗策略 铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌常定植于正常人的呼吸道,皮肤粘膜以及医疗设备等处。当患者免疫力低下,长期使用广谱抗生素,糖皮质激素及接受吸氧、气管插管机械通气时,铜绿假单胞菌大量繁殖,往往导致严重下呼吸道感染。因为铜绿假单胞菌的耐药及复发率高,故临床治疗较为困难。为更好地预防和控制医院感染，建议应采取以预防为主，加强对铜绿假单胞菌的耐药性监测，及早进行菌株鉴定和药敏检测，避免大量和长期使用同一类型的抗菌药物，并规抗菌药物的应用，具体措施如下： 一、阻断病原菌播散 医院加强对高危患者的病原菌监测，尤其将下列患者列为目标监测的重点：住在ICU、接受过广谱抗菌药物治疗或抗菌药物治疗效果不佳的患者，留置各种导管以及合并慢性基础疾病的患者。对目标监测患者进行主动筛查和定期监测，及时发现、早期诊断铜绿假单胞菌感染与定植患者。如：患者的呼吸道长期定植铜绿假单胞菌，到多家医院就诊导致其克隆传播，致使不同医院间存在同一克隆株的PA,因此，加强对铜绿假单胞菌定植患者的监控，是控制克隆株播散的关键。有文献报导PA克隆朱主要在ICU病房流行，原因可能为ICU住院患者病情重、自身免疫力低下，多接受过侵入性治疗，因此，加强病区（尤其是重点科室）的消毒、隔离和监控工作，阻断外源性传播媒介，是有效控耐药PA在医院感染发生和流行的重要途径。 二、加强监测抗铜绿假单胞菌的药物及其敏感性
目前可用于治疗铜绿假单胞菌感染的药物基本有六类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-酰胺类，氨基糖苷类和喹诺酮类，另外多黏菌素类(如黏菌素，多黏菌素B)以及磺胺类(甲磺灭脓、磺胺嘧啶银)主要用于铜绿假单胞菌的局部感染的治疗。多黏菌素B 也用于难治性的铜绿假单胞菌感染的全身治疗。2011年中国C H IN E T铜绿假单胞菌耐药性监测显示铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率 最低，为14．3%，对头孢哌酮和氨曲南的耐药率最高，分别为31.7%和38.9%，对其他抗菌药物的耐药率为19～30%，耐药率从低到高依次为：阿米卡星<头孢吡肟<头孢他啶<头孢哌酮一舒巴坦<环丙沙星<哌拉西林一他唑巴坦<庆大霉素<美罗培南<亚胺培南<哌拉西林<头 孢哌酮<氨曲南。 （1）青霉素类药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林、替卡西林、替卡西林／克拉维酸，其中以哌拉西林最常用于铜绿假单胞菌导致的肺部感染。 （2）头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹胺是铜绿假单胞菌的敏感药物。头孢他啶是目前针对铜绿假单胞菌作用最强的药物，头孢吡肟对铜绿假单胞菌的作用与头孢他啶相似，头孢哌酮对铜绿假单胞菌有良好的抗菌作用，可用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药，头孢匹胺对铜绿假单胞菌的作用与头孢哌酮和哌拉西林相似或略优。 （3）碳毒霉烯类药物该类药物抗菌谱特别广，抗菌活性强。治疗PA感染应首选敏感药物碳青霉烯类，并且初始剂量宜大，以增强其
（一）铜绿假单胞菌的传播途径： 1、水源：水与铜绿假单胞菌的存在联系紧密。水源污染主要来自人或动物排泄物、人肠道铜绿假单胞菌两个途径。铜绿假单胞菌在污染的水中可较长时间的存留，各种液体药剂，包括眼药水长期放置有可能被铜绿假单胞菌污染，消毒剂、手术器械浸泡液都可能成为铜绿假单胞菌的贮存场所。呼吸机湿化装置及导管可作为传播的直接媒介。 2、环境：医院内长期潮湿的地方及湿的物品是铜绿假单胞菌贮存的场所。洗涤槽，防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。 3、医护人员：通过医护人员（手）可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室。 4、特殊的病人：人体本身是一个主要的铜绿假单胞菌贮存所，细菌主要存在人体较为潮湿的部位如腋下、会阴部、呼吸道和肠道等。HIV感染、气管切开和插管、大面积烧伤、恶性肿瘤、免疫力低下、静脉插管、留置导尿及各种侵入性操作的患者易感染本菌。 （二）铜绿假单胞菌的预防措施： 1、铜绿假单胞菌感染的患者应实行接触隔离，住隔离病室，隔离标志明确、醒目，在隔离病房或者区域的
入口处应配备手套、手消毒凝胶、隔离衣及外科口罩； 2、医务人员接触患者前，戴好口罩、帽子，穿隔离衣； 3、加强医务人员手卫生，接触患者血液、体液、污物后均应洗手。洗手提倡采用流动水洗手，如果手没有明显污染时，可以用消毒凝胶消毒双手；医务人员如手皮肤有破损，不宜护理此类感染性疾病的患者； 4、护士对患者导管的各项操作，应先从清洁的部位开始再到污染的部位，避免交叉污染，如进行可能产生气溶胶的操作（吸痰或雾化治疗、纤维支气管镜等）时必须戴标准外科口罩，必要时带保护性眼罩； 5、进行床旁检查（如便携式照片、心电图、B超）的仪器在检查完成后用消毒剂进行擦拭消毒； 6、如患者需离开隔离病室到医技科室做检查，主管医生应先电话通知该诊疗科室或在检查单上标注患者感染情况，检查完毕患者接触过的物体表面要及时进行消毒处理； 7、隔离病室患者接触过的一切物品，如被单、衣物、各类医疗器械、导管等应先行消毒处理，然后再清洁（洗）、消毒、灭菌； 8、严格医疗废物管理，患者用过的所有敷料、导管等废物须置入专用黄色医疗废物袋内、封口，锐利器具用后及时放入专用利器盒内,集中焚毁。
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铜绿假单胞菌感染治疗策略 铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌常定植于正常人的呼吸道,皮肤粘膜以及医疗设备等处。当患者免疫力低下,长期使用广谱抗生素,糖皮质激素及接受吸氧、气管插管机械通气时,铜绿假单胞菌大量繁殖,往往导致严重下呼吸道感染。因为铜绿假单胞菌的耐药及复发率高,故临床治疗较为困难。为更好地预防和控制医院感染，建议应采取以预防为主，加强对铜绿假单胞菌的耐药性监测，及早进行菌株鉴定和药敏检测，避免大量和长期使用同一类型的抗菌药物，并规范抗菌药物的应用，具体措施如下： 一、阻断病原菌播散 医院加强对高危患者的病原菌监测，尤其将下列患者列为目标监测的重点：住在ICU、接受过广谱抗菌药物治疗或抗菌药物治疗效果不佳的患者，留置各种导管以及合并慢性基础疾病的患者。对目标监测患者进行主动筛查和定期监测，及时发现、早期诊断铜绿假单胞菌感染与定植患者。如：患者的呼吸道长期定植铜绿假单胞菌，到多家医院就诊导致其克隆传播，致使不同医院间存在同一克隆株的PA,因此，加强对铜绿假单胞菌定植患者的监控，是控制克隆株播散的关键。有文献报导PA克隆朱主要在ICU病房流行，原因可能为ICU住院患者病情重、自身免疫力低下，多接受过侵入性治疗，因此，加强病区（尤其是重点科室）的消毒、隔离和监控工作，阻断外源性传播媒介，是有效控耐药PA在医院感染发生和流行的重要途径。 二、加强监测抗铜绿假单胞菌的药物及其敏感性
目前可用于治疗铜绿假单胞菌感染的药物基本有六类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类，氨基糖苷类和喹诺酮类，另外多黏菌素类(如黏菌素，多黏菌素B)以及磺胺类(甲磺灭脓、磺胺嘧啶银)主要用于铜绿假单胞菌的局部感染的治疗。多黏菌素B也用于难治性的铜绿假单胞菌感染的全身治疗。2011年中国C H IN E T铜绿假单胞菌耐药性监测显示铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐药率最低，为14．3%，对头孢哌酮和氨曲南的耐药率最高，分别为%和%，对其他抗菌药物的耐药率为19～30%，耐药率从低到高依次为：阿米卡星<头孢吡肟<头孢他啶<头孢哌酮一舒巴坦<环丙沙星<哌拉西林一他唑巴坦<庆大霉素<美罗培南<亚胺培南<哌拉西林<头孢哌酮<氨曲南。 （1）青霉素类药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林、替卡西林、替卡西林／克拉维酸，其中以哌拉西林最常用于铜绿假单胞菌导致的肺部感染。 （2）头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹胺是铜绿假单胞菌的敏感药物。头孢他啶是目前针对铜绿假单胞菌作用最强的药物，头孢吡肟对铜绿假单胞菌的作用与头孢他啶相似，头孢哌酮对铜绿假单胞菌有良好的抗菌作用，可用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药，头孢匹胺对铜绿假单胞菌的作用与头孢哌酮和哌拉西林相似或略优。 （3）碳毒霉烯类药物该类药物抗菌谱特别广，抗菌活性强。治疗PA 感染应首选敏感药物碳青霉烯类，并且初始剂量宜大，以增强其迅速的杀菌能力和延长药物浓度依赖性的药物后效应。
铜绿假单胞菌检查 1 简述 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气中，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品，本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中长引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度。国内外药典均将铜绿假单胞菌列为检查项目之一。 铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯培养、革兰染色、镜检及生化试验等步骤进行检验。 2 仪器、设备和用具（见大肠埃希菌2）。 3 试液、指示液 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液[附录3.1，3.3]。 3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[附录3.2]。 3.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液[附录2.1]。 3.4 盐酸试液[附录2.12]。 3.5 氯仿[附录1.57]。 4 培养基 4.1 营养肉汤培养基[附录 5.1]。 4.2 胆盐乳糖（BL）培养基[附录 5.6]。 4.3 营养琼脂培养基[附录 5.2]。 4.4 溴代十六烷基三甲胺[附录 5.14]。
4.5 绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）[附录 5.26]。 4.6 明胶培养基[附录3.27]。 4.7 硝酸盐胨水培养基[附录 5.28]。 5 对照用菌液 铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。 6 操作方法 6.1 供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。 6.2 供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）；（大肠埃希菌6.2）。 6.3 增菌培养 取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照菌应无军生长。 6.4 分离培养 轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1～2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、
铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识中华医学会呼吸病学分会感染学组）是一种革兰阴性杆菌，也是临床最常PA，P.aeruginosa，铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa见的非发酵菌，在自然界广泛分布，可作为正常菌群在人体皮肤表面分离到，还可污染医疗器械甚至消毒是医院获得性感染重要的条件致病菌，具有易定植、易变异和多耐药的特点。液，从而导致医源性感染.下呼吸道是医院内细菌感染最常见的发生部位，感染种类主要包括支气管扩张合并感染、慢性阻塞性）MDR-PA Paeruginosa，肺疾病（简称慢阻肺）合并感染和肺炎等，由多重耐药PA（multidrug resistant下呼吸道感染的诊断和治疗具有特别重要的意义。因此规范PA引起的下呼吸道感染病死率高，治疗困难，一、微生物学特点假单胞菌属为需氧、有鞭毛、无芽孢及无荚膜的革兰阴性杆菌和不动杆菌属、黄杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌及洋葱伯克霍尔德菌等共同构成非发酵糖革兰阴性杆菌，是常见的条件致病菌，尤其是医院感染的主要病原之一。0.5~1.0呈球杆状或长丝状，宽约以上。PAPA是假单胞菌的代表菌株，占所有假单胞菌感染的70%能产生多种色素，如绿脓素和荧PA.成双或短链排列。xm，—端有单鞭毛，无芽孢（xm，长约1.5~3.0（光素等，专性需氧，部分菌株能在兼性厌氧条件下生长。二、流行病学（一）流行状况感染的流行病学特点突出地表现在两个方面，一是院内感染，尤其是肺部感染的发病率PA近年来，CHINET中国感染的严重性，其中最具代表性的“不断增加。国内已有多项大型流行病学调查显示我国PA年—2012的分离率占所有分离菌的第5位，2005资料显示，细菌耐药性监测”2012年综合性教学医院PA，和14.0%、14.8%、14.2%，14.1%，16.9%、16.4%、15.8%PA的分离率分别占革兰阴性菌的11.6%2~5位。居第20112009年和家教学医院参与的中国医院院内获得性细菌耐药性分析（CARES）结果显示，有1312.7%。且MDR-PA的比例高达4位，分离率分别为10.8%和12.6%m，年PA在所有分离细菌中也是居第肺炎）的全国医院感染研究数据显示，PA这一点在呼吸系统感染更为突出，美国疾病预防控制中心（CDC，几乎翻18.1%比例从9.6%上升至—19752003年医院获得性肺炎（HAP）中PA的发生率在逐年升高，倍。了123%是最常见的革兰阴性需氧菌，占ICU感染病原学的流行病学调查结果显示，PA一项大规模）。8244/35790），也是最常见的从呼吸道分离出的细菌（31.6%（。即便得到有效的9.3%）的回顾性研究结果显示.PA分离率达美国一项关于呼吸机相关性肺炎（VAP。，直接病死率为32.0%~42.8%治疗，PA导致的感染总病死率仍髙达42.1%~87.0%家大型教13位；我国近期进行的18.6%，列第1PA2005年胡必杰等报道562例HAP中的分离率为2位。，居第的临床调查结果显示，PA的分离率为20.9%学医院HAP 的耐药率居高不下，位。二是PA的分离率为22.9%，居第22011年CARES研究也证实HAP中PA致病原中居前几位，同时对常用抗菌药物的耐药率逐在HAPSENTRY）显示，PA全球细菌耐药监测数据（年升高。对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略年连续监测资料显示，PACHINET2005—2012中国29.1%，30.5%、30.8%42.8%、35.8%、30.5%、呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0%、25.0%，，25.8%28.5%，24.5%、25.2%和29.1%，对美罗培南的年度耐药率分别为32.0%、34.1%， 1.5%。2012年分别达到1.8%和和27.1%，但其中全耐药（PDR）菌株数量显著增多，在2011年和，这一点在呼吸系22.1%对亚胺培南和美罗培南的耐药率达29.3%和CARES2011年研究也证实PA和70.7%PA对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达统感染中更为突出，我国HAP临床调查结果显示，PA对碳青霉烯类的耐药率。，远高于48.8%CHINET监测中各种标本分离菌中对PA年的中国CHINET资料显示2012PA 对于其他具有抗假单胞菌活性的药物敏感度也不容乐观，，19.8%，舒巴坦、头孢他啶、环丙沙星和哌拉西林--他唑巴坦的耐药率分别为13.5%阿米卡星、头孢哌酮。和、19.6%17.9%17.5% 1
一、改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜体外模型 （扫描电镜观察） 1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释 2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次 3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌 4、2.5%戊二醛预固定2小时（戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。） 5、0.1mol/LPBS漂洗三次，再用1%锇酸固定2小时（经锇酸固定后，又能防止用酒精脱水时所产生的沉淀作用。也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂） 6、40-100%系列浓度酒精脱水（1、酒精可以置换组织内的水，最终脱水用的是无水乙醇。高浓度的酒精（95%以上）对细菌有强烈的收缩和脆化的缺点，因此洗后不能立即投入高浓度酒精中。脱水时为了避免细菌萎缩、僵硬，应在不同浓度的酒精里逐渐脱水。2、如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，这时细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好的深入细菌内部）
7醋酸乙戊酯置换（醋酸乙戊酯的极性较弱,临界点干燥时可以更好的与co2置换,从而更加完整的保持生物样品的表面形态.） 8将盖玻片装入样品盒中置HCP-2临界点干燥仪中干燥2小时（扫描电镜在观察样品要求在高真空中进行。无论是水还是脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈的汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构，因此，样品在用电镜观察前必须要干燥。 ） 9喷金三分钟，电镜扫描（生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。） 二、激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜 1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释 2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次 3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是院内获得性感染的常见致病菌，耐药率高 、耐药机制复杂，所致感染可供选择的抗菌药少，治疗极为困难。通常以一种β-内酰胺类抗 生素（酰脲类青霉素，头孢他啶，亚胺培南）为基础，联合氨基糖苷类或氟喹诺酮类抗菌药 进行治疗，但细菌清除率低，临床疗效尚待改进。因此迫切需要研究开发新的抗铜绿假单胞 菌药物。目前已经涌现出多种对铜绿假单胞菌更为有效的抗菌药。 1 β-内酰胺类抗生素 青霉素类 以哌拉西林为代表的酰脲类青霉素有抗铜绿假单胞菌活性，但由于抗菌活性低（仅 为头孢他啶的1／2～1／4）和耐药率高，临床应用受限。近年经过结构改造出现了一些仅针 对革兰氏阴性菌的窄谱青霉素类抗生素，其中6α-甲酰胺基青霉素福米西林（fomidacillin ，BRL36650）对铜绿假单胞菌的活性较强（MIC90≤2 mg／L），强于哌拉西林、氨曲南和头 孢他啶；有较好的酶稳定性，对质粒介导的TEM－1、TEM－2、OXA－2、PSE－4、SHV－1和染色体介导的Sabath-Abraham酶稳定，其临床价值正在评价。 第四代头孢菌素 第三代头孢菌素中头孢他啶是经典的抗铜绿假单胞菌药物，但活性仍不尽人意，且 耐药菌株迅速增加。一些对铜绿假单胞菌活性增强或对目前耐药菌株有效的第四代头孢菌素 已经涌现，部分品种已用于临床。 头孢瑞南头孢瑞南（cefluprenam，E－1077）是在头孢母核的3-位引入丙烯氨基， 7-位侧链引入氟甲氧亚氨基而获得的新注射用头孢菌素，对铜绿假单胞菌的活性较头孢他啶 和头孢匹罗强约2～4倍。已完成的临床研究证实为有效的抗铜绿假单胞菌药。 头孢克定头孢克定（cefclidin，E－1040）是目前抗铜绿假单胞菌活性最强的第四 代头孢菌素之一。其体外活性较头孢他啶强4～16倍，且对头孢他啶或亚胺培南耐药株高度敏 感（MIC90分别为6.25和3.13 mg/L。较其它第四代头孢菌素活性增强的原因在于其不仅对染 色体介导的头孢菌素酶稳定，而且亲水性好、对细菌细胞膜穿透性增强。 含儿茶酚的第四代头孢菌素含儿茶酚取代基的第四代头孢菌素是开发研究的热点， 有被称为"第五代"之势。其中GR69153、LB10522、Ro09－1428、Ro09-1227和RU－59863对铜绿假单胞菌抗菌作用增强且对耐药菌株更有效，其作用机制可能有：（1）通过依赖tonB的铁 转运系统进行跨膜转运，绕过了抗生素摄取的渗透屏障；（2）对β-内酰胺酶更稳定。GR69 153 的抗铜绿假单胞菌活性约为头孢地啶的2～4倍，而LB10522的活性是头孢他啶的16～32 倍且药物动力学特性好以及酶诱导活性低。约99％铜绿假单胞菌临床分离株对Ro09－1428敏 感；且因其对PBP3亲和力更好，所以体外活性极为出色，远强于头孢他啶，稍强于头孢克定 。RU－59863对β-内酰胺酶很稳定，对铜绿假单胞菌的体外活性较强（MIC900.5mg/L），耐 环丙沙星、氨基糖苷类和头孢他啶的多重耐药性铜绿假单胞菌株也对其高度敏感，有望成为 治疗难治性铜绿假单胞菌感染的有效药物。 碳青霉烯类
铜绿假单胞菌感染,铜绿假单胞菌感染的症状,铜绿假单胞菌感染治疗【专业知识】 疾病简介 假单胞菌属在自然界分布广泛，对人和动物有致病性的菌种有十余种，以铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)在医学中最为重要。本属细菌侵袭性弱，一般认为属条件致病菌。当机体免疫功能受损或缺损时，可引起严重的甚至致死性的感染;手术后或某些治疗操作后(气管切开、保留导尿管等)的患者也易罹患本菌感染，故亦为医院内感染的重要病原菌之一。铜绿假单胞菌可感染人体的血液、呼吸、中枢神经、泌尿等各个系统组织，引起一系列病变。 疾病病因 一、发病原因假单胞菌属根据其RNA/DNA的同源性可分为五个主要型，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是其代表菌种，在医院感染病原菌中检出率最高。此外，临床常见的假单胞菌属细菌还有荧光假单胞菌(P.fluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)等。本菌为无荚膜、无芽孢、能运动的革兰阴性菌，菌体大小(1.5～5.0)um*宽(0.5～1)um，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，为专性需氧菌，最适宜生长温度为37℃，致病性铜绿假单胞菌在42℃时仍能生长，据此可与荧光假单胞菌等进行鉴别，本菌生长对营养要求不高。在普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落，该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色;在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环，菌落呈金属光泽。菌体O抗原有两种成分，一为内毒素蛋白(OPE)，是一种保护性抗原，另一为酯多糖，具有特异性，根据其结构可将铜绿假单胞菌分成12个血清型，此外还可利用噬菌体或铜绿假单胞菌素分型。铜绿假单胞菌对外界环境抵抗力较强，在潮湿处能长期生存，对紫外线不敏感，湿热55℃1h才被杀灭。铜绿假单胞菌在琼脂平板上能产生蓝绿色绿脓素，感染伤口时形成绿色脓液。 铜绿假单胞菌为条件致病菌，完整皮肤是天然屏障，感染力再强的病菌亦不能引起病变，正常健康人血清中含有调理素及补体，可协助中性粒细胞和单核细胞巨噬细胞吞噬及杀灭铜绿假单胞菌，故