第４１卷 第４期
陕西师范大学学报（自然科学版）Ｖ
ｏｌ．４１ Ｎｏ．４ ２０１３年７月Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｊｕｌ．，２０１３
文章编号：１６７２－４２９１（２０１３）０４－００６３－
０４ 收稿日期：２０１０－１０－
１５ 基金项目：
国家自然科学基金资助项目（３１０００１３４）；陕西省科技研究发展攻关计划（２００６Ｋ１６－Ｇ１５）． 第一作者：
张璇，女，硕士，主要研究方向为植物生物技术． ＊通信作者：王喆之，男，教授，博士研究生导师．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｚｗａｎｇ
＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．丹参锚蛋白重复序列家族基因的克隆和表达分析
张 璇，库里满·恰里甫，武玉翠，王喆之＊
（陕西师范大学药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源
开发国家工程实验室，陕西西安７１００６２
）摘 要：用降落ＰＣＲ的方法获得了丹参锚蛋白重复序列家族基因（ＳｍＡＲＰ）．生物信息学显示，ＳｍＡＲＰ所编码蛋白的分子质量为１９，０６４ｋＤ，理论等电点为８．４，
是一种不稳定而且无信号肽和无跨膜区域的蛋白．该蛋白的二级结构中主要存在α螺旋（３９．６４％）和无规卷曲（４２．０１％），其三维结构模型中每个锚蛋白重复序列折叠成两个反向平行的α－螺旋，每两个α－螺旋中间形成一个长环．实时荧光定量ＰＣＲ结果显示，该基因在丹参的根、茎、叶、花中均有表达．关键词：丹参；锚蛋白重复序列家族基因；生物信息学分析中图分类号：Ｑ５１７；Ｑ９４３．２ 文献标志码：Ａ
Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳｍＡＲＰｆｒｏｍＳａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＺＨＡＮＧ Ｘｕａｎ，Ｋｕｌｉｍａｎ Ｑｉａｌｉｆｕ，ＷＵ Ｙｕ－ｃｕｉ，ＷＡＮＧ
Ｚｈｅ－ｚｈｉ＊
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ＮａｔｕｒａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｆｏｒ ＲｅｓｏｕｒｃｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＥｎｄａｎｇｅｒｅｄＣｒｕｄｅ Ｄｒｕｇ
ｓ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，Ｘｉ′ａｎ ７１００６２，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｆａｍｉｌｙ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ（ＳｍＡＲＰ）ｆｒｏｍＳａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄｕｓｉｎｇ ＴＤ－ＰＣＲ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｉｓ １９，０６４ｋＤ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｉｓ ８．４．Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｓ．ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｉｓ ａｎｕｎｓｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＳｍＡＲＰｃｏｎｔａｉｎ，ａｌｐ
ｈａ ｈｅｌｉｘ（３９．６４％）ａｎｄ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ（４２．０１％）．Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＳｍＡＲＰ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅａｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｆｏｌｄｓ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ａｎｔｉｐ
ａｒａｌｌｅｌα－ｈｅｌｉｃｅｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｌｏｎｇ ｌｏｏｐ．Ｔｈｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ＳｍＡＲＰ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｉｎ ｒｏｏｔｓ，ｓｔｅｍｓ，ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ
Ｓ．ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ；ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ 锚蛋白重复序列（Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐ
ｅａｔ，ＡＲＰ）是普遍存在于真核、原核及病毒中的一种蛋白质序列模体，它是蛋白质数据库中出现频率最高的氨基酸模块之
一［１
］．ＡＲＰ在许多种功能蛋白中存在，
参与了一系列的细胞学和生物学过程，如细胞周期调节、线粒体酶、
细胞骨架形成、信号转导和解毒等［２
］．ＡＲＰ作为蛋白
与蛋白相互作用的结构平台［
３
］，对于由多种信号途径调控的细胞发育过程来说可能起重要作用．
目前对植物中锚蛋白重复序列的研究主要集中在拟南芥和水稻两种植物中．在拟南芥基因组中共有１０５个基因可以编码ＡＲＰ的蛋白，
蛋白的数目达到５０９个［４］
．
从水稻中已经得到一种新的水稻抗逆
６４
陕西师范大学学报（自然科学版）第４１卷
相关基因－水稻锚定序列重复蛋白基因（Ｒｉｃｅａｎｋｙｒｉｎ－ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｒａｐ）及其编码的蛋白．这种水稻锚定序列重复蛋白基因已经证实是抗逆相关基因，尤其可以在植物品种改良和杂交育种中用于改变植物的耐盐性和／或抗旱性［５］．在其他植物如烟草［６］和苜蓿［７］等中也有少量报道．
丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）具有重要的药用价值，具有活血调经、祛瘀生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功效［８］．本文从丹参中克隆得到编码ＡＲＰ基因的ｃＤＮＡ序列，采用生物信息学方法对其推导的氨基酸序列、二级和三级结构进行了预测和分析，采用实时荧光定量ＰＣＲ检测了其在丹参不同器官中的表达特性．
１ 材料与方法
依据丹参ＥＳＴ库序列，采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０设计了ＲＴ－ＰＣＲ扩增引物ＡＲＰ－Ｓ（５｀ＣＴＡＣＡＡＴ－ＧＣＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴ３｀）和ＡＲＰ－Ａ（５｀ＣＡＡＧＧ－ＴＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＣＣ３｀）．丹参种子（采自陕西天士力植物药业商洛有限公司商州药源基地）种于含蛭石的营养钵中，放于人工气候箱（宁波江南仪器厂，型号为ＲＸＺ－５００Ｄ）中培养（温度２５±２℃，湿度４８％，光照强度２１６μｍｏｌ ｍ２／ｓ，光照时间１６ｈ／ｄ）．ＲＮＡ提取试剂ｐＢＩＯＺＯＬ购自ＢｉｏＦｌｕｘ，Ｂｉｏ ＲＴ逆转录试剂盒购于杭州博日科技有限公司．ＲＮＡ提取和第一链ｃＤＮＡ合成严格按照试剂盒说明书完成．采用降落ＰＣＲ［９］的方法进行ＰＣＲ反应，反应程序为９２℃变性３ｍｉｎ；９２℃变性３０ｓ，５９℃退火６０ｓ，每４个循环下降１℃，直到５４℃，７２℃延伸９０ｓ，９２℃变性３０ｓ，５４℃退火６０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，２０个循环．
７２℃延伸１０ｍｉｎ．扩增片段经凝胶回收（试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司）插入载体ＰＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ（宝生物公司）后，转入大肠杆菌ＤＨ５α中，送至上海捷瑞生物公司测序．依据ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／、ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／等网站提供的各类生物信息学软件进行在线分析．氨基酸序列的理化性质分析、开放阅读框（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）的查找和翻译利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ、ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ在线工具；蛋白质信号肽的预测、跨膜结构域、亲水性／疏水性、三维结构的分析利用在线工具ＳｉｇｎａＩＰ、ＴＭＨＭＭ、ＰｒｏｔＳｃａｌｅ、Ｓｗｉｓｓ ｍｏｄｅｌ完成［１０］．
以丹参根、茎、叶、花的ｃＤＮＡ为模板进行荧光定量ＰＣＲ反应．进行实时荧光定量ＰＣＲ检测时，以丹参持家基因ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓ－ｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，３－磷酸甘油醛脱氢酶）为内参（引物５′－ＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴ－３′和５′－ＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＧＡＡＣＧＡＣＡＴＡＣ－３′），检测ＳｍＡＲＰ（引物５′－ＡＣＧＣＣＣＴＡＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＴＴ－３′和５′－ＴＣＣＣＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣＡＴ－３′）的表达量．反应条件：９５℃变性３ｍｉｎ；９５℃变性１０ｓ，６０℃退火３０ｓ，４０个循环．每个样品３个重复．
２ 结果与讨论
２．１ 基因的克隆
对丹参ＥＳＴ序列进行Ｂｌａｓｔ分析，发现一条序列与锚蛋白重复序列基因有较高的相似性，在此基础上设计引物，从ｃＤＮＡ克隆到该基因的全长．该基因序列全长５８７ｂｐ，包含５１０ｂｐ的ＯＲＦ框，编码１６９个氨基酸（图１）．提取丹参总ｍＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出特异条带，用１％琼脂糖凝胶电泳检测的结果显示在５００－７５０ｂｐ间有明显条带（图２）．经测序验证该片段包含该基因完整的ＯＲＦ框，与电子克隆的序列完全吻合
．
图１ ＳｍＡＲＰ基因序列及编码的氨基酸序列
Ｆｉｇ．１ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＳｍＡＲＰ
ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．
２．２ 氨基酸序列同源性分析
使用Ｂｌａｓｔｐ用上述核苷酸序列所推导的氨基酸序列进行同源性比对的结果表明，ＳｍＡＲＰ所推导的氨基酸序列与已报道的其他植物，如水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ，ＮＰ＿００１０４５５９８）、拟南芥（Ａｒａｂｉ－ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ，ＮＰ＿５６８１８４）、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ，ＡＣＧ３２４８９）、蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ，ＸＰ＿
第４期
张璇等：丹参锚蛋白重复序列家族基因的克隆和表达分析
６
５ ００２５３１８９７）的一致性（Ｉ
ｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）分别是７３％、６７％、７１％和７６％．由此说明克隆到的基因为ＡＲＰ基因，并揭示出不同植物中ＡＲＰ基因编码的氨基酸序列间具有高度的相似性
．
图２ ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ
．２ Ｔｈｅ ｒｅｓｌｕｔ ｏｆ ＰＣＲ２．３ 蛋白质的组成和理化性质分析
用Ｐｒｏｔｐａｒａｍ和ｐＩ／ＭＶ对丹参、水稻、拟南芥的ＡＲＰ基因编码的氨基酸序列进行分析的结果（表１）表明，各植物中ＡＲＰ基因编码的氨基酸序列长度变化不大，等电点、分子质量和理论等电点也基本一致，并且编码的蛋白都属于稳定蛋白分子．说明Ｓ
ｍＡＲＰ与其他植物的ＡＲＰ基本性质是相似的．而动物中ＡＲＰ基因编码的氨基酸序列较长、分子质量大，等电点偏碱性．
用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ程序对ＳｍＡＲＰ编码的氨基酸序列进行亲水性疏水性分析的结果（图３）表明，第２１位天冬氨酸（Ａｓｐ）亲水性最强（分值为－２．８４４），第１２０位天冬酰胺（Ａ
ｓｎ）疏水性最强（分值１．３１１）从总体上看，大部分氨基酸分值为负值，属于亲水性氨基酸．所以ＳｍＡＲＰ编码的氨基酸序列属亲水蛋白．
表１ 不同植物ＳｍＡＲＰ的理化性质比较
Ｔａｂ．１ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳｍＡＲＰ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐ
ｅｃｉｅｓ植物名注册号推导的氨基酸残基数分子质量／ｋｄａ理论等电点蛋白质不稳定系数丹参—
——１６９ １９ ０６４．４ ８．４７ ５３．４１拟南芥
（１）ＮＰ＿５６８１８４ １７５ １９ ２５６．７ ６．２５ ４１．１７（２）ＮＰ＿２００９３１
１７４ １９ ２０６．５ ７．８３ ５６．０７玉米ＡＣＧ３２４８９ １６６ １８ ４９６．９ ７．０５ ５４．７５蓖麻ＸＰ＿００２５３１８９７ １７７ １９ ７４４．３ ６．５３ ３２．０５水稻
ＮＰ＿００１０４５５９８
１６６
１８ ４６３．７
７．０６
４５．４６
用Ｓｉｇ
ｎａｌＰ ３．０工具对ＳｍＡＲＰ蛋白进行信号肽预测，预测结果显示该蛋白无信号肽．用ＴＭ－ＨＭＭ ２．０对ＳｍＡＲＰ氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，结果显示该蛋白无跨膜区域
．
图３ ＳｍＡＲＰ疏水性／亲水性的预测Ｆｉｇ．３ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ
／ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ
ｏｆ ＳｍＡＲＰ２．４ 蛋白质的空间结构预测
用ＳＯＰＭＡ对该基因所编码的氨基酸进行蛋白质二级结构预测．蛋白质二级结构预测显示该蛋白主要由３９．６４％的α螺旋，４
２．０１％的无规卷曲构成
．图４ ＳｍＡＲＰ蛋白的三维结构预测
Ｆｉｇ
．４ Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＳｍＡＲＰ
６
６ 陕西师范大学学报（自然科学版）第４１卷
采用Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ程序对ＳｍＡＲＰ基因编码蛋白进行三级结构建模分析．并采用ＭＯＬＭＯＬ １．２视图软件进行视图，结果如图６所示．ＳｍＡＲＰ基因编码蛋白三维结构模型中每个ＡＲＰ折叠成两个反向平行的α－螺旋，每两个α－螺旋中间形成一个长环．这个重复序列模块是很规范的螺旋－环－螺旋结构，重复序列的数量为３个．Ｓｅｄｇ
ｗｉｃｋ和Ｓｍｅｒｄｏｎ利用Ｘ射线得到的ＡＲＰ结构［２］中每个ＡＲＰ折叠
成两个反向平行的α－螺旋，
中间形成一个β发夹或一个长环．每个ＡＮＫ重复都有一个非常完美的结
构：除了在主环区域有一些例外的插入序列外，这个重复序列模块几乎都是很规范的螺旋－环－螺旋－β－发夹或环．含ＡＮＫ重复的各种蛋白中，其ＡＮＫ重复数目变化范围在０－３３个，
但大多数的含量少于６个［１］
．说明ＳｍＡＲＰ基因编码蛋白具有典型的ＡＮＫ
ｒｅｐ
ｅａｔ．用Ｂｌａｓｔ－Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｅａｒｃｈ分析ＳｍＡＲＰ基因编码蛋白结构域的结果显示，在２２－
１４０位氨基酸间含有ＡＮＫ结构域，该蛋白属于ＡＲ
Ｐ超家族．将ＳｍＡＲＰ与拟南芥、水稻、玉米、蓖麻中ＡＲＰ氨基酸序列利用ｃｌｕｓｔａｌｘ１．８３进行多序列比对，分析的结果表明，这４种植物中的ＡＲＰ氨基酸序列从２
２位氨基酸开始同源性很高，这与功能结构域分析的结果是一致的．２．５ 基因表达分析
以丹参ＧＡＰＤＨ基因为内参，进行ＳｍＡＲＰ基因的荧光定量分析，结果显示（图５），该基因为构成型表达基因，在丹参的根、茎、叶中均有表达，以花中表达最丰富，根中表达量最低
．
图５ ＳｍＡＲＰ基因表达的实时定量分析结果Ｆｉｇ
．５ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ＳｍＡＲＰ ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ３ 结论
本研究从丹参中克隆到了ＳｍＡＲＰ基因．对ＳｍＡＲＰ基因和水稻、拟南芥的ＡＲＰ基因编码的氨
基酸序列进行同源性比对，发现有较高的一致性，而且它们编码的蛋白都属于碱性不稳定蛋白．这表明丹参ＡＲＰ基因的功能可能与在水稻、拟南芥中的相似，即在防御系统中起作用．关于ＡＲＰ基因在植物防御系统中的具体作用有待进一步的研究．参考文献：
［１］Ｌｅｉｌａ Ｋ，Ｔｏｂｉｎ Ｊ，Ｄａｎｉｅｌ Ｃ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐ
ｅａｔａｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，１３：１４３５－１４４８．［２］Ｓｔｅｖｅｎ Ｇ Ｓ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ Ｓ．Ｔｈｅ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ：ａ ｄｉｖｅｒｓｉ－ｔｙ
ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９９，２４（８）：３１１－
３１６．［３
］杜海宁，胡红雨．锚蛋白重复序列介导的蛋白质与蛋白质相互作用［Ｊ］．生物化学与生物物理进展，２００２，２９（１）：６－９．［４］Ｃｒｉｓｔｉａｎ Ｂ，Ｔｏｒｂｅｎ Ｊ，Ｐｅｒｅ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐ
ｅａｔ－ｃｏｎ－ｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏ－ｖｅｌ ａｎｄ ａｂｕｎｄａｎｔ ｇｒｏｕｐ
ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｋｙｒｉｎ－ｔｒａｎａ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００４，３４０（１）：１１１－１２１．［５
］林鸿宣，晁代印，施敏，等．水稻抗逆相关基因－锚定序列重复蛋白基因及其应用［Ｐ］．中国专利，２００４１００８９３８１，２００４－１２－１０．［６］Ｉｎｇｅｌａ Ｆ，Ｊｅｆ Ｇ，Ａｎｔｈｏｎｙ
Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＴＩＰ，ａ ｎｏｖｅｌ ｈｏｓｔ ｆａｃ－ｔｏｒ ｌｉｎｋｉｎｇ
ｃａｌｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｍｏｖｅ－ｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ－Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎ－
ｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２００３，１６（２）：１３２－１４０．［７］Ｄｅｌｐｈｉｎｅ Ｃ，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｍ，Ｍａｎｕｅｌ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｋｙ
ｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｇ
ｅｎｅ ｗｈｏｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ａｌｆａｌｆａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，５１（３）：５５５－５６６．［８］Ｌｉ Ｙｏｎｇｇｕｏ，Ｓｏｎｇ
Ｌｏｎｇ，Ｌｉｕ Ｍｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｉｎ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｅ Ｒａｄｉｘ ｅｔ Ｒｈｉｚｏｍａ（Ｄａｎｓｈｅｎ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａ，２００９，１２１６（１１）：１９４１－１９５３．［９］万兵，闫杰，季明春，等．一种新的ＰＣＲ方法—
——降落ＰＣＲ扩增目的基因［Ｊ］．江苏临床医学杂志，２００２，６（２）：１２７－
１２９．［１０］李桂源，钱骏．基于ｗｗｗ的生物信息学应用指南［Ｍ］．
长沙：中南大学出版社，２００４：１４３－
１４６．〔责任编辑 王 勇〕
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.doczj.com/doc/586646473.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/586646473.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
DNA结构与复制中的相关计算的三种常用方法 一、特值法： 先按照碱基比例假设DNA片段中碱基总数为100或200等整百数，再根据碱基互补配对原则（A－T，C－G）图解分析求解。 例：一个DNA分子中，G和C之和占全部碱基数的46％，又知在该DNA分子的一条链中，A和C分别占碱基数的28％和22％，则该DNA分子的另一条链中A和C分别占碱基数的（）。 A．28％、22％B．22％、28％C．23％、27％D．26％、24％ 【解析】假设DNA每条链的碱基数为100，依题意得：（图略） ∵甲链: A=28, C=22,G+C=46, ∴甲中G=24, T=100-28-46=26。则乙中A=26，C=24。故选D。 练习：分析某生物的双链DNA，发现腺嘌呤与胸腺嘧啶之和占全部碱基的64％，其中一条链上的腺嘌呤占该链全部碱基的30％，则对应链中腺嘌呤占整个DNA分子碱基的比例是（） A．17％B．32％C．34％D．50％
二、首尾法： 根据DNA复制的过程与特点可以知道：一DNA分子复制n次后，将得到2n个DNA分子，其中保留原来母链的DNA 数目为2个。在处理与此相关的计算题过程中，我们只需要考虑开始和结尾的差异就可以顺利求解，笔者习惯于称之为首尾法。 例：假如一个DNA分子含有1000个碱基对（P元素只是32P）,将这个DNA分子放在只含31P的脱氧核苷酸的培养液中让其复制两次,则子代DNA分子的相对分子量平均比原来( )。 A.减少1500 B.增加1500 C. 增加1000 D.减少1000 【解析】每个碱基对应一个脱氧核苷酸，含1个磷酸基，即1个磷原子。复制两次后形成4个DNA分子，8条单链。其中两条含32P，6条含31P，因而相对分子量减少6000，4 个DNA平均减少1500。故选A。 练习：已知14N-DNA和15N-DNA的相对分子量分别为a和b。现让一杂合DNA分子在含14N的培养基上连续繁殖两代，则其子代DNA的平均相对分子量为（） A.(3a+b)/4 B.(a+3b)/4 C.(7a+b)/8 D.(a+7b)/8 三、公式法： 基于DNA的半保留复制，我们可以归纳出公式：X=m(2n-1)。
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/586646473.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.doczj.com/doc/586646473.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
学号：班级：姓名： 《生物化学与生物分子学实验》 ——分子生物学设计性实验开题报告 实验课题：绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 指导老师： 作者姓名： 所在院系： 小组编号： 小组成员： 完成时间：
成都医学院 Cheng Du Medical College 题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。 3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中
疾病基因克隆的策略及主要方法 申海鹰周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042） 摘要疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略——定位克隆策略、功能克隆策略——及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。 关键词基因；定位克隆；消减杂交 学科分类号Q785 Strategies and methods for cloning pathogenic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (C enter of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Milit ary Medical University, Chongqing 400042) Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome stu dy, while it is the disease background which decides the selection of the strategies. Tw o strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the obje ctive gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analysis, suppressio n subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PC R), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), com parative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly. Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive hybridization 基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类5~10万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自1911年Wilson将色盲基因定位于X染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组DNA、分子杂交以及PCR技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及mRNA差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有5000个遗传性状被定位，其中400多个为致病基因［1］。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）： 目前人类基因克隆的主要策略有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过RFLP、微卫星D NA等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛
重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L A TP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。