学号：2009020988
研究生姓名：周慧
联系电话：136********
E-mail：16zhouhui@https://www.doczj.com/doc/595640971.html,
所在院系：化学化工与材料科学学院
硕士学位论文
论文题目：用于活细胞内功能性活性物种区域定位识别检
测的荧光探针的设计、合成及其应用
学科专业名称：分析化学
申请人姓名：周慧
指导教师：唐波教授
论文提交时间：2012年4月12日
独创声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者签名：
学位论文版权使用授权书
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学位论文作者签名：导师签字：
签字日期：20 年月日签字日期：20 年月日
山东师范大学硕士学位论文
目录
摘要.............................................................................................................................. I Abstract ........................................................................................................................ I II 第一章绪论. (1)
第一节引言 (1)
第二节细胞内功能性活性小分子的简述 (3)
第三节铜离子的生物学功能及其检测方法 (4)
第四节定位荧光探针的意义及其进展 (9)
第五节荧光染料的研究近展 (12)
第六节论文选题目的与意义 (14)
参考文献 (15)
第二章一种检测活细胞溶酶体内铜离子的新型裸眼荧光探针 (24)
2.1 引言 (24)
2.2 实验部分 (26)
2.3 结果与讨论 (29)
2.4 结论 (39)
参考文献 (40)
第三章双BODIPY桥联的环状结构荧光染料 (45)
3.1 引言 (45)
3.2 实验部分 (46)
3.3 结果与讨论 (49)
3.4 结论 (53)
参考文献 (54)
第四章定位溶酶体的新型大环荧光染料 (57)
4.1 引言 (57)
4.2 实验部分 (58)
4.3 结果与讨论 (60)
参考文献 (62)
附录一化合物的核磁共振、质谱图 (64)
附录二硕士期间发表的学术论文及参加的课题 (69)
致谢 (70)
摘要
细胞内存在着各种各样的活性小分子（如活性氧、金属离子等），它们有着特殊的生理功能，参与细胞的增值与分化、生命遗传、细胞新陈代谢等活动，对生命过程起着至关重要的作用。细胞的生命活动的顺利进行依赖各细胞器的相互协调，它们不仅形态、结构不同，而且功能也各有分工。各种细胞器相互配合，协同工作，才使得细胞这一高度精密的生命机器能够持续、高效地运转。然而在同一细胞内不同的细胞器中活性小分子存在的种类与浓度也是不尽相同的，它们的水平变化调控着细胞功能的变化，甚至会导致重大疾病的发生和发展。如果能够在亚细胞水平精确检测细胞不同区域内的活性小分子，既可以了解这些活性小分子的生物学功能，又能对疾病的预防、治疗和新药的开发具有重要的指导作用。
面对复杂多样的生物体系，如果想要对某一区域的活性小分子实现选择性好、灵敏度高的检测，荧光分析方法具有明显的优势。荧光分析法由于选择性好、灵敏度高、操作简便、对生物体损伤小等优点，近年来利用荧光探针对活体细胞中的活性小分子动态、原位可视化成像分析是目前生物学、化学及医学领域研究的前沿热点之一。据此本论文展开了题为用于活细胞内功能性活性物种区域定位识别检测的荧光探针的设计、合成及其应用的研究。
本论文的具体研究内容如下：
（一）以罗丹明B为荧光团，2-乙酰噻吩作为铜离子识别基团，设计合成了一种新型荧光探针RHAT。罗丹明B上的二甲氨基显示弱碱性，而溶酶体为弱酸性细胞器，故使得该探针还可以定位到溶酶体中，实现了对活细胞溶酶体中的铜离子的检测。当没有铜离子时，探针几乎没有荧光，为无色，当探针与铜离子作用后显示强荧光并变成粉红色，可以实现裸眼检测。由于RHAT拥有优良的光学性质，良好的选择性和光稳定性，低的细胞毒性，可以成功应用到活细胞中的铜离子检测。在人体正常的肝细胞和肝癌细胞中，通过外加铜离子和加入抗坏血酸还原内源性铜离子,实现了对细胞溶酶体外源性和内源性铜离子浓度变化的可视化成像。
I
（二）以苯乙酮和2,6-二甲醛基吡啶为初始反应物，经过一系列反应，最终合成了一种由两个BODIPY桥联而形成的环状的新型近红外荧光染料。该荧光染料的激发和发射光谱在近红外光区，有适宜的Stokes位移半峰宽很窄，并且化学稳定性和光稳定性好，不易发生光漂白，对溶剂极性不敏感，与钠、钾等一价金属离子反应展现出明显的荧光增强，该染料在活性小分子检测方面有较大的应用价值。
（三）溶酶体是细胞中重要的细胞器，内含丰富的水解酶，具有细胞内的消化功能，对细胞功能发挥着重要的调控作用。以对二甲氨基苯乙酮和2,6-二甲醛基吡啶为原料，合成了一种可以实现对溶酶体定位的新型近红外荧光染料，为细胞溶酶体定位的细胞生物学研究提供了一种潜在的有应用价值的新染料。
关键词：铜离子、定位、溶酶体、荧光染料、荧光探针、近红外
II
Abstract
There are many different kinds of function-activity species, such as reactive oxygen species and metal ions, in living cells. They take part in various life activities and play an important role in physiological and pathologic process. Cell is the structural and functional unit of life. What’s more, organelles perform distinct functions inside the cell. So, if we can design and synthesize high selectivity and high sensitivity fluorescence probe for detecting function-activity species in subcellular organelle, we can learn more about the biological function of them.
Recently, fluorescence imaging is one of the most powerful techniques for monitoring function-activity species in living systems. Considering the near-infrared (NIR) light leads to minimum photodamage, deep tissue penetration, and minimum background autofluorescence interference, in recent years, near-infrared fluorescent dyes are widely used in analytical chemistry, especially in biological analysis. They play more and more important roles during the development of life science.
Based on the research status of function-activity species fluorescence probe and fluorescent dyes, we carried out three aspects of investigation:
First, copper is the third-most abundant transition metal in the body. The copper plays a major role in various biological processes. Moreover, it has been reported that the level of copper in lysosomes is closely related to age and development of liver damage. A new fluorescent Cu2+probe was synthesized, and realized optical imaging in HL-7702 cells. The mechanism of the probe is based on a change in structure between spirocyclic (non-fluorescent) and open-cycle (fluorescent) forms. The weakly fluorescent probe showed a fluorescence enhancement response when Cu2+ binds to the ion receptor. Our research has been focused on the development of fluorescent sensors targeting the lysosomes. In addition, the off–on–type fluorescent change upon exogenous copper addition and ascorbate-reduced decrease of endogenous Cu2+ was also applied in bioimaging.
III
Second, we have developed a novel NIR fluorescent dye A with a circle structure forming by two BODIPY cores. We studied the absorption and emission spectrum of the dye. The dye has high chemical stability and photostability, and is insensitive to solvent polarity. What’s more, we also discussed its sensitivity to different pH and metal ions. It’s a ideal fluorescent probe in analytical chemistry, environmental chemistry, life science and other fields.
Third, lysosomes are cellular organelles that contain acid hydrolase enzymes to break down waste materials and cellular debris and homeostasis of iron metabolism. As is known, lysosomes have been suggested to play a crucial role in the intracellular regulation. We proposed a novel fluorescent probe, which can locate in lysosomes, because of the N, N-diethylaminophenyl matching pKa value of lysosomes. The results also provide a new approach for potential biological and clinical implications.
Keywords:Copper ·Location ·Lysosomes ·Fluorescent dye ·Fluorescent probe · Near-infrared
IV
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第一章 绪 论
生物体中存在着大量的微量或痕量的活性小分子，它们通过各种生化反应参与调控细胞的凋亡、变异与分化、信号转导等生理功能与现象，对生命过程具有重要的作用。活性小分子过多或缺失，对生物体都会造成不可忽视的影响。如果要想研究这些活性小分子在生物体的生命过程中所发挥的作用、所引起的各种生物学效应和生物学功能，就必须能够对它们实现准确实时的检测。而在目前众多的研究手段中，荧光法因为具有灵敏度高，选择性好，响应时间短，而且操作简便等优势，在活性小分子的检测中得到广泛应用。
第一节 引言
细胞作为生命的基本单元，富含有多种多样的活性小分子（如活性氧、金属离子等），适量的活性小分子是生物体所必须的物质，但如果他们过量又会对生物体带来损伤。由于生命环境的特殊性，传统的检测手段不能满足对生物体中活性小分子研究的需要，而荧光分子探针显示出了独特的优势，是现代生物技术和生命科学中必不可少的检测手段[1-7]。
图1-1. 荧光分子探针的三种类型
目前荧光分子探针基本可以分为以下三种类型：（i）探针本身没有显著的荧光，当被测物存在时，发射显著增强，这也就是常说的荧光增强型；（ii）与前一种类型相反，探针本身有荧光，当与被测物反应后，荧光猝灭，即荧光猝灭型探针；（iii）与被测物反应前后，光谱存在明显的差异，如红移或者蓝移[8]。生物体内的环境是复杂多变的，可以引起荧光探针的荧光强度降低的原因有很多，由此可见，荧光增强型分子探针可以有效地避免生物体自身环境的干扰从而提供更加可信的荧光信号，因而备受人们的关注。
众所周知，细胞内含有各种细胞器，它们不仅形态、结构不同，而且功能也各有分工。比如线粒体是细胞中的“能量加工厂”，和有氧呼吸息息相关；内质网参与蛋白质合成与转运，与脂质代谢、糖类代谢、解毒作用有关；高尔基体是内质网合成产物和细胞分泌物的加工和包装场所；而酸性细胞器溶酶体催化蛋白质、核酸、脂质、多糖等生物大分子分解，消化碎渣和从外界吞入的颗粒。与此同时，在同一细胞内不同的细胞器中生物活性小分子存在的种类与浓度也不尽相同，如果能够对不同细胞器内所存在的功能性活性小分子实现“实时、原位、动态”的区域定位检测，那么不仅可以更加详尽地了解活性小分子的产生和作用机制等生物学功能，而且又可以进一步在亚细胞水平探讨不同细胞器的功能，从而能够对这些活性小分子的产生、存在、作用机制的研究更加精细和深刻[9]。
总之，如果能够设计合成出新型荧光探针来检测细胞内活性氧、金属离子等各种功能性活性小分子，并能够特异性地与线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体等细胞器定位，进行“可视化”成像分析，这对在细胞内不同的区域详尽的了解各种功能性活性小分子的浓度和种类，对于探讨它们的产生、分布和生物学作用有着重要的意义，也成为当前生命科学研究的重要热点和难点领域之一。
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第二节细胞内功能性活性小分子的简述
动植物体内存在着大量的活性小分子，目前我们研究的大致可以分为活性氧自由基和阴、阳离子等，它们有条不紊的在生物体的新陈代谢等活动中发挥不可替代的作用，引起生物体的各种生物效应。
活性氧物种ROS作为一个总称，大致可以分为以氧为中心的自由基（如羟基自由基、过氧化羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化烷基自由基）和一些含氧非自由基的衍生物（如过氧化氢、单线态氧、脂质氢过氧化物和次氯酸等）[10-12]。ROS很活泼、半生期很短且极不稳定，可以对生物分子发起攻击而引发自由基的连续反应。在正常的生理浓度下，ROS可正常行使细胞功能[13-16]；但如果ROS过量，就会造成细胞中的DNA、脂质、蛋白质等分子过度氧化，而对细胞造成损伤，有许多研究证据显示氧化胁迫可进一步造成多种退化性疾病、老化、突变及其癌症的产生[17-22]。同时体内也有防御与清除自由基的系统来抵制自由基的供给，并具有修补系统来修复受到自由基攻击的组织。
对于阳离子目前的研究主要包括金属离子和氢离子等。金属离子是维持多相体系的渗透平衡，并作为广泛的酶反应的必要组分。有些酶类的催化活性，除了蛋白质部分外，还需要金属离子，即金属离子是酶活性中心的组成部分。细胞内金属离子中钾、钠离子的浓度最高，钠离子维持细胞外液渗透压的主要成分，钾是维持细胞内液渗透压的主要成分，钾和钠共同作用，调节体内水份的平衡并使心跳规律化。钙是构成骨骼及牙齿的主要成分，钙还是重要的信使，细胞内的信号传递依靠细胞内外钙离子的浓度差；镁是植物叶绿素不可缺少的重要元素，在人体中是维持神经、肌肉和心脏应激性的重要离子之一；锌离子广泛参与细胞生长发育、基因转录、神经传递等各种重要生命过程；此外铁、铜、钴、锰等都是生物体不可或缺的重要微量元素[23]。而H+作为特殊的阳离子，调节着人体酸碱度，维持正常的酸碱平衡[24,25]。阴离子作为与阳离子相对应的离子，同样，在生物体内，也参与许多生理过程，比如氯离子参与多种细胞活动和调节过程，如细胞增殖、凋亡、细胞兴奋性调节、pH调节、容量调节和免疫应答，生物体内的氯离子水平处于一个相对稳定的状态，参与许多重要的生理、病理过程，一旦生物体内的氯离子调控发生紊乱，将会导致许多严重的疾
3
病[26]，而次氯酸作为一种抗菌剂可以杀死吞噬溶酶体内的吞噬病原体等等[27]。
第三节铜离子的生物学功能及其检测方法
1.3.1 铜离子的生物学功能
铜作为继锌铁之后人体内最丰富的过渡元素，是生命活动中不可缺少的一种微量元素。正常成人体内含铜总量约50～150 mg ,血液中铜的含量为100～150 μg/dL (15.7-23.6 μM)[28]。铜在人体内的主要作用是进行氧化还原反应，在生物系统中作为独特的催化剂，参与造血过程及铁的代谢，参与一些酶及其黑色素的合成，对于脊椎动物在铁的代谢和氧的输送过程中,铜也起着举足轻重的作用[29-32]。在短时间内身体内的铜含量较高就会表现出胃肠功能的紊乱，而长时间处在较高水平则会严重损害肝肾功能[33]。
铜作为人类研究最早的金属之一，早在1874年铜对软体动物的重要作用就被Harless指出；1878年Ferderig从章鱼血内蛋白质配合物中将铜分离出来，并称该蛋白为血铜蓝蛋白；至1928年Hart发现铜是生物体内的必需微量元素[34]。近年来，铜对生物体的重要作用越来越受到人们的重视。一方面，适量的铜是生物体正常生理活动不可缺少的，而另一方面，铜过量则会对生物体有很大的毒害作用。WHO推荐按每天每千克体重铜的供给量是:婴幼儿80 μg，儿童和青少年40 μg，成人30 μg；美国食品与营养委员会估计的每日安全充足的铜摄入量为婴儿014～017 mg，儿童与青少年为017～25 mg，成人为115～310 mg；中国营养学会推荐的成人每天铜的安全适宜摄入量为210～300 mg[35]。
1.3.2 缺铜导致的几种疾病
铜缺乏对生物体正常的生理功能的影响不容小觑。一是，铜可以促进铁的吸收、运输及利用，如果机体内铜元素缺乏时血红蛋白的合成量就会减少，并且有寿命短促的异常红细胞产生，从而造成功能性贫血；二是，铜作为体内独特的催化剂，参与多种金属酶的合成,其中之一的氧化酶在促进心血管的基质胶原和弹性硬蛋白的合成中是必不可少的物质,基质胶原能使心肌细胞集合起来,弹性硬蛋白则可以使心脏和血管保持弹性，如果人体内铜的摄入量不足，心血管就无法维持正常的形态和功能，干扰胆固醇的正常代谢，导致血胆固醇升高，血动脉弹
性降低，产生冠心病和高血压的潜在发病机制；三是，铜还影响内分泌和神经系统的正常功能，有研究表明神经系统对缺铜十分敏感，一旦铜的供给量不足，动物脑组织的铜含量及含铜酶活性下降速度比其他组织要快，已有许多研究结果表明，铜可影响神经组织中细胞色素氧化酶、铜锌超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白等的活性，造成结构和功能受损，例如临床上表现出的阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、rvlenkes综合征、中枢神经系统疾病等；四是，人体内许多生物酶和辅酶的生成都离不开铜的参与，所以结缔组织、骨骼和骺软骨的正常新陈代谢的活动与铜的存在也息息相关，若小儿体内铜含量不足则会导致骺软骨生长停滞不前、骨胶原不能合成，进而影响小儿骨骼的生长发育以及身高；最后，铜还是酪氨酸酶的重要组成部分，而酪氨酸酶可以催化酪氨酸转变成“多巴”继而转变成黑色素储存在皮肤内，倘若铜含量过少，则酪氨酸酶的活性降低，造成黑色素生成障碍，从而导致皮肤毛发的脱色[36-40]。
1.3.3 铜对生物体的毒性
铜缺乏可以导致多种疾病，然而铜如果过量对生物体也会有毒性。自由的铜和小分子的铜盐会催化超氧阴离子和过氧化氢的反应产生羟基自由基，大量的活性氧会造成对机体的氧化损伤[41]。此外，铜还可以选择性氧化半胱氨酸上的巯基从而损害一些蛋白的活性[42]。摄入过多的铜可导致肝细胞和红细胞的损伤，会产生诸多症状如腹痛，恶心，呕吐，头痛，嗜睡，腹泻，心动过速，呼吸困难，溶血性贫血，胃肠道出血，甚至最终会因肝，肾功能衰竭而死亡。铜对机体毒性的强弱与铜进入体内的方式及剂量也息息相关。
一方面，急性铜中毒：铜可与溶酶体的脂肪发生氧化作用，从而导致溶酶体膜的破裂，水解酶大量释放引起肝组织坏死；也可由红细胞溶血引起黄疸。肝内胆汁淤积症就是急性铜中毒的一种表现，其发病原因是肝小叶因为铜过量而导致其中心性坏死。
另一方面，慢性铜中毒：长期接触铜尘的工人也会因为铜的慢性刺激而产生一系列的病症，如肺部感染，记忆力减退、容易激动、注意力不集中，食欲不振、恶心呕吐、腹痛腹泻黄疸、部分病人出现肝肿大、肝功能异常等。肝豆状核变性是慢性铜中毒的一种表现，是一种常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾
病，通常在5~10岁发病，由于肝脏内铜离子沉积达到饱和，引起急性肝功能衰竭，儿童时期表现的症状为慢性肝病症，青少年时期又出现神经系统症状，临床上表现为进行性加重的椎体外系症状、肝硬化、肾功能、精神症状损害及角膜色素环K-F环[43]。
铜中毒的另一毒理表现是损伤红细胞引起溶血和贫血。当大量的铜进入体内时，过量的铜主要在肝脏中累积，一旦超过肝脏的负荷时，铜就被释放进入血液，在红细胞中过量的Cu2+与-SH结合并大量积集，还原型谷胱甘肽减少，谷胱甘肽还原酶失活，从而导致酶系统的氧化失活，红细胞损伤，细胞膜的通透性增加，破坏细胞原有的稳定性，并使细胞质和细胞器易于受损，变性血红蛋白增加，大量的变性血红蛋白进入血液，最终导致溶血和贫血[44]。
1.3.4 检测铜离子的荧光探针
鉴于铜对生物体的重要意义，近十几年来对铜离子检测的探针层出不穷[45-52]。最早期检测铜离子的探针，还无法解决典型的过渡态金属铜存在的氧化态和自旋状态方面的可塑性引起的猝灭问题，而且选择性上也不容乐观[53-58]。加上铜离子在生物体内又是微量元素，所以还很难实现在生物体中的应用。
直到1996年，Pradyut Ghosh和Parimal K. Bharadwaj首次合成出与铜离子反应荧光不猝灭的荧光探针（图1-2），当金属离子与空腔结合后，打断了原有的N原子到蒽上的PET过程，从而荧光增强。但是这个探针的不足点就是选择性不好，对Zn2+、Ni2+等都有响应[59]。
图1-2. The structure of Cu2+ probe. (J. Am. Chem. Soc., 1996,118, 1553-1554)
图1-2. The structure of Hydrazide probe. (J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 7386-7387)
1997年Anthony W. Czarnik首次用罗丹明B酰肼作为探针，罗丹明B酰肼本身是没有荧光的，它可以有效的识别Cu2+，Cu2+促进其水解得到罗丹明B，从而荧光恢复，并且伴随着颜色上从无色到粉红色的改变（图1-3）。该探针在选择性上有很大的改善，但因为水解反应的单向性，该探针不能实现可逆性检测[60]。
2005年，纽约大学的James W. Canary等设计合成了一种新的检测Cu2+的比率探针。这个探针在350 nm和493 nm处激发分别得到两个发射峰，在435 nm处的荧光强度随着Cu2+浓度的升高而减弱，而在518 nm处的发射峰荧光强度随着Cu2+浓度的升高而增强（图1-4）。如此以来就可以定量检测水溶液中Cu2+的浓度，灵敏度也大大提升。遗憾的是，该探针没有应用到生物体中，没有做到细胞水平[61]。
图1-4. Normalized fluorescence response for the titration of probe with Cu2+.
(J. Am. Chem. Soc.,2005, 127, 1612-1613)
Hyo Sung Jung等设计合成的探针成功应用到生物体中，在原有研究的基础上，又用MTT实验验证了探针的低毒性，研究了探针的水溶性、膜透性，为生物体中的应用奠定了基础，进而用荧光显微镜实现了细胞水平的成像分析（图1-5）,然而遗憾的是该探针仍然是猝灭型探针，不能避免这种类型探针带来的弊
端[62]。
图1-5. The structure of the probe and confocal fluorescence images in LLC-MK2 cells. (J. Am.
Chem. Soc. 2009, 131, 2008-2012)
Christopher J. Chang课题组在检测Cu+方面也做出了突出的贡献。早在2005年，Chang课题组就设计出CS1，并在活细胞中通过外加Cu+实现荧光成像（图1-6）[63]。2009年，他们对CS1进行改造得到一个比率探针RCS1，它在灵敏度上有很大的提升，在活细胞成像实验上，通过外加刺激实现细胞内原有Cu+的浓度变化，并用RCS1实现对细胞内Cu+的成像检测（图1-7）[64]。
图1-6. The structure of CS1. 图1-7. The structure of RCS1.
(J. Am. Chem. Soc., 2006,128, 10-11) (J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 1194-1195) 2011年Christopher J. Chang在原有探针的基础上加入了三苯基膦实现了在线粒体中的定位（图1-8），为在亚细胞水平研究铜离子的生物功能奠定了一定的基础[65]。
图1-8. The structure of Mito-CS1. (J. Am. Chem. Soc.2011, 133, 8606-8616)
最近，唐波课题组设计合成了一种新型的花菁类近红外荧光探针，对铜离子能够高选择性、高灵敏度地响应（图1-9）。近红外荧光探针可以降低物质自吸收和自发荧光的干扰，减少对生物体的损伤，更利于活体检测。该探针最终实现了在细胞、组织以及活体的铜离子共聚焦荧光成像[66]。
图1-9. The structure of the probe and confocal fluorescence images.
(Chem. Commun.2011, 47, 7755-7757)
检测铜离子的探针屡见不鲜，但在选择性、灵敏度、适于生物应用性上还有很大的提升空间。能够应用到亚细胞水平的铜离子探针还比较少见，这还需要进一步的研究和开发。
第四节定位荧光探针的意义及其进展
细胞是生命活动的基本单位，而各项生命活动的顺利进行依赖各细胞器的相互协调，它们不仅形态、结构不同，而且功能也各有分工。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，又称"能量加工厂"，提供细胞生命活动所需的能量；内质网是由膜连接而成的网状结构，是细胞内蛋白质的合成和加工，以及脂质合成的“车间”；高尔基体是对来自内质网的蛋白质加工，分类和包装的“车间”及“发送站”；溶酶体是“消化车间”，内部含有多种水解酶，能分解衰老，损伤的细胞器，吞噬并杀死入侵的病毒或细菌；核糖体是由RNA和蛋白质构成的微小颗粒，是合成蛋白质的场所。它们在功能上也是既有明确的分工，又有紧密的联系。各种细胞器相互配合，协同工作，才使得细胞这台高度精密的生命机器能够持续、高效地运转。然而在同一细胞内不同的细胞器中活性小分子存在的种类与浓度也是不尽相同，比如线粒体是超氧阴离子等活性氧产生的高发部位，细胞质和质膜是Fe2+或Fe3+的主要存在部位，酸性细胞器如溶酶体的H+浓度较高，神经细胞突触的囊泡中存在较高浓度的Zn2+[67]。因此，如果对生物体内的活性小分子能够区域定位到亚细胞水平，即能够在更精细的细胞结构内了解这些活性小分子对人体的各种作用，又能够对这些亚细胞结构有一个更深层次的了解。因此，近年来区域定位
的小分子荧光探针也是一个研究的热点。
图1-10. The structure of Zn2+ location probe.(J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 15776-15777) Lippard课题组利用蛋白的表达实现了在高尔基体和线粒体的定位，实现了对这两种细胞器中锌离子的检测，探针上的DPA实现对Zn2+的检测，探针上烷基化鸟嘌呤转移酶与线粒体内的半乳糖转移酶进行表达实现了线粒体内的定位，与高尔基体内的细胞色素氧化酶进行表达实现了对高尔基体的定位（图1-10）[68]。利用蛋白，抗体抗原结合而实现的亚细胞器的定位也都有报道。
图1-11. The structure of MitoPY1. (J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 9638-9639)
图1-12. The structure of Zn2+ location probe.(Chem. Eur. J. 2012, 18, 1050-1054)
2008年美国科学家Christopher J. Chang设计合成的探针（MitoPY1）利用在荧光团上引入三苯基膦实现了小分子荧光探针对线粒体中过氧化氢的定位检测（图1-11）[69]。线粒体中负电位比较高，而三苯基膦带有正电位，利用正负电位的结合实现了探针的线粒体定位。三苯基膦作为线粒体的定位基团也被应用到诸
多定位线粒体的探针中。例如，2011年J. Am. Chem. Soc.上发表了实现对线粒体中Cu+的定位监测。2012年欧洲化学上这篇文章利用DPA来识别Zn2+，用三苯基膦实现对线粒体的定位，最终实现对线粒体中Zn2+的定位监测（图1-12）[70]。
图1-13. The structure of Fe3+ probe. (J. Med. Chem. 2008, 51, 4539-4552) Sarah Fakih在探针上连入二甲氨基，从而实现了在溶酶体中定位检测Fe3+，溶酶体作为酸性细胞器成弱酸性，而二甲氨基成弱碱性，从而实现在溶酶体中的定位（图1-13）[71]。2011年Yoshinori Kawazoe等设计合成出定位到线粒体膜上的探针，这为线粒体中物质能量迁移的研究奠定了一定的基础（图1-14）[72]。
图1-14. Chemical structures of molecules.(Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 5581-5583)
然而，目前报道的实现细胞内区域定位的检测细胞器内单一活性小分子的小分子荧光探针还是比较少的，若要研究开发能够定位到各个细胞器又能实现对单一活性小分子检测的小分子荧光探针，这就需要该探针即存在能够与细胞器或者某一区域特异结合的官能团，又需要能够单一识别某一活性小分子的官能团，同时满足以上两个条件才能实现区域定位检测细胞内单一活性小分子的要求。这才能为在细胞内不同的区域详尽的了解各种功能性小分子的浓度和种类，探讨活性小分子的产生、分布和生物学作用奠定基础。
第五节荧光染料的研究近展
荧光染料是各种领域的重要工具，而且作为荧光分子探针的荧光母体一直备受关注，在罗丹明类，花菁类，BODIPY类及香豆素等已有染料的基础上，荧光量子产率高、光稳定性好，斯托克斯位移大、近红外的荧光染料一直是大家追捧的热点[73]。
图1-15. Anilido-pyridine boron difluoride dyes.
(Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 123(51), 12422-12425)
BODIPY类荧光染料因为具有较窄的吸收和发射峰、较高的摩尔吸光系数、较高的光稳定性和化学稳定性以及较高的量子产率等[74-78]优点一直是研究的热点，但不足的是一般BODIPY类荧光染料斯托克斯位移都比较小。Juan F. Araneda 等人2011年在Angew. Chem. Int. Ed.发表了他们设计合成出的新型荧光探针，利用结构上的改变实现了斯托克斯位移大大增加，大于80 nm（图1-15）[79]。
图1-16. The structure of MMSiR. (J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 5680-5682)罗丹明类荧光染料作为分析化学和生物医药科学等生物技术领域中最常用的荧光染料之一[80-84]，因为具有较宽的波长范围和较高的荧光量子产率，光稳定性好等优点，故而被广泛应用在荧光标记、单个分子检测、分子遗传学、细胞生物学、分子生物学、生理学等方面[85-90]。然而不足的是波长很难达到近红外，当作为探针的荧光母体时，在生物应用方面有一定的局限性。2011年Nagano课题组把原来罗丹明氧杂蒽中的O用Si代替下来，则它的发射就达到了670 nm(图