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It a lso i nh i b ited t he i nflo w o f i nce ll u lar C a2+i nduced by ACh.Con clusi on:AO R ex tracts coul d restrai n the contraction on the rabb it ileum, this e ffect could be re l a ted to Ca2+channe,l M-receptor,H-recept o r and d irect ac ti on.
K ey word A l p i n i ac O ffici narum Rh lizoma;BaC l
2
;hista m i ne;A ch;isolated ileu m;Ca2+channe l
云芝多糖对小鼠NK细胞与单核吞噬细胞系统的影响*
徐惠波,牛晓晖,纪凤兰,张伟,孙晓波**,李玉1
(吉林省中医中药研究院,长春130021;1吉林农业大学,长春130000)摘要目的:研究云芝多糖(C V PS)对小鼠NK细胞和单核吞噬细胞系统功能的影响。方法:体外试验为将指数生长小鼠淋巴细胞与不同浓度的CVPS共培养,用M TT法观察CVPS对小鼠NK细胞杀伤靶细胞的能力;用中性红染色法观察CV PS对巨噬细胞功能的影响。体内实验小鼠腹腔注射CV PS,用碳廓清实验检测小鼠单核吞噬细胞系统功能。结果:在体外CV PS浓度为31.25~ 500L g/m l可明显增强NK细胞吞噬K562细胞的能力及巨噬细胞吞噬中性红的能力。整体实验CVP S腹腔注射100、50、25m g/kg 时,给药组小鼠单核吞噬细胞系统功能明显增强,胸腺指数明显高于空白对照组。结论:云芝多糖体内外给药均可显著增强小鼠NK 细胞和单核吞噬细胞系统功能。
关键词云芝多糖;NK细胞;巨噬细胞;单核吞噬细胞系统
我们曾观察了CV PS对小鼠淋巴细胞的影响,证明其对小鼠T、B淋巴细胞功能有显著增强作用,对混合淋巴细胞反应有明显促进作用,对丝裂霉素C有明显拮抗作用。本文就其对NK细胞和巨噬细胞的影响进行了研究。
1材料和方法
1.1试验药物云芝多糖(Corio l us versi co l o r P o l ysaccharide, CVPS)是从担子菌杂色云芝菌Po l ystict us versicolor(L.)F r.子实体中提出的多糖,采用先进工艺,纯度可达60%以上,且不含小分子物质。棕褐色粉末,水溶性好,由吉林省中医中药研究院化学室提供。
1.2试剂RP M I-1640完全培养基为H yc l one公司产品;四甲基偶氮唑盐(M TT)为美国S i gm a公司产品;环磷酰胺(cy)为上海华联制药公司产品。
1.3动物C57BL/6小鼠及BAL b/c小鼠,雌雄不拘,体重20 ?1g,由吉林大学基础医学院实验动物室提供。昆明种小鼠,雌雄不拘,体重20?1g,由吉林省生物制品研究所动物室提供。1.4方法
1.4.1体外对NK细胞的影响[2]将小鼠脾细胞悬液(终浓度
2.5@106/m l)点于96孔培养板上,每孔100L l,再依次加入不同浓度的药液,效应细胞对照孔以R P M I-1640培养液代替,各做4复孔。培养24小时后,弃上清,每孔再加入对数生长期的K562靶细胞(1@105/m l)100L,l另做靶细胞对照孔4复孔。培养24小时后,各孔加入20L lMTT,继续培养4小时,离心,去上清,加入150L l D M SO,振荡,使结晶溶解,在酶标仪上测570nm 处各孔的A值。结果以NK细胞杀伤率表示,NK细胞杀伤率(%)=[1-(实验孔A值-效应细胞对照孔A值)]/靶细胞对照孔A值@100%。1.4.2对巨噬细胞吞噬功能的影响[1]:无菌取小鼠腹腔巨噬细胞:向小鼠腹腔内注入3m l无血清的RPM I1640培养液,轻揉小鼠腹腔1分钟,抽出腹腔液,用含10%胎牛血清的RPM I-1640培养液洗一次,用含10%胎牛血清的RPM I-1640培养液配成1@106/m l细胞悬液。将小鼠腹腔巨噬细胞悬液点于96孔培养板上,每孔100L,l培养3小时后,去除非贴壁细胞,各孔加入不同浓度药液,各做4复孔,并做阴性及阳性对照,培养24小时,弃上清,每孔加入0.072%的中性红溶液100L,l培养4小时,弃上清,每孔再加入醋酸-乙醇(1B1)细胞溶解液200L,l振荡10分钟,在酶标仪上测570n m处各孔的A值。结果以巨噬细胞吞噬率表示,吞噬率(%)=(实验孔A值-对照孔A值)/对照孔A值@100%。
1.4.3NK细胞及巨噬细胞活性的测定随机将50只昆明种小鼠分为5组,空白对照组每天i p生理盐水0.2m l/只,环磷酰胺组每天i p环磷酰胺20m g/kg,CV PS给药组每天分别给小鼠i p CVPS100、50、25m g/kg,以上各组每天均给药一次,连续5天,末次给药后半小时将小鼠处死,测定NK细胞及巨噬细胞活性,方法同1.4.1。
1.4.4对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响分组及给药方法同上,末次给药后半小时,于小鼠尾静脉注射用生理盐水稀释(1B4)的墨汁10m l/kg,在2分钟和15分钟时于小鼠眶后静脉丛采血0.05m l/只,置于5m l0.1%碳酸钠溶液中,650n m比色,并取肝、脾及胸腺称重,计算吞噬指数K和胸腺指数。
2结果
2.1体外试验CV PS对巨噬细胞吞噬活性的影响C V PS在500~31.25L g/m l浓度范围内可明显增强腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用,且具有明显的量效关系,结果见表1。
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中药药理与临床2006;22(5) *本项目为吉林省科技厅课题,课题编号20020503-12**通讯作者
表1CVPS对巨噬细胞吞噬功能的影响( x?s,n=4)
组别药物浓度(L g/m l)A吞噬率(%)
空白00.333?0.976
C VPS5001.149?0.350**424.52
2501.029?0.309**363.58
1250.754?0.012**225.33
62.50.706?0.032**200.64
31.250.603?0.041**149.17
与对照组比较*P<0.05,**P<0.01(下同)
2.2体外试验对NK细胞杀伤活性的影响由表2结果可见, CVPS可明显增强小鼠NK细胞杀伤靶细胞的能力,并在125~ 31.25L g/m l范围内有明显的量效关系。
表2CVPS对NK细胞杀伤活性的影响( x?s,n=4)
组别浓度(L g/m l)A杀伤率(%)
空白01.895?0.1670
C VPS5001.588?0.090480.61**
2501.447?0.12189.30**
1251.639?0.02077.46**
62.51.581?0.08281.04**
31.251.341?0.16295.89**
2.3体内试验CV PS对巨噬细胞及NK细胞活性的影响由表3结果看出,CVPS组的巨噬细胞吞噬中性红能力和NK细胞的杀伤能力明显高于对照组。
表3CVPS对NK及巨噬细胞活性的影响( x?s,n=10)
组别剂量(m g/kg)NK(A)巨噬细胞(A)
空白对照00.666?0.0290.242?0.076
环磷酰胺200.985?0.045**0.160?0.086*
C VPS1000.485?0.049**0.326?0.031**
500.607?0.039**0.309?0.043*
250.627?0.013**0.309?0.038*
2.4CVPS对小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响由表4结果可见,CVP S在100、50、25m g/kg剂量均可明显增强小鼠单核巨噬细胞吞噬功能,且胸腺指数也明显高于对照组。
表4CVPS体内给药对单核吞噬细胞系统吞噬功能的影响( x?s, n=10)
组别剂量(m g/kg)K胸腺指数(m g/10g)
空白对照0.064?0.01274.40?20.84
环磷酰胺200.036?0.011**30.09?10.92** CVPS1000.073?0.005*91.09?8.79*
500.078?0.010*85.90?6.92*
250.073?0.0046*92.90?9.08*
3讨论
巨噬细胞作为最重要的抗原提呈细胞,是诱发免疫应答的先决条件,另外其作为非特异性免疫细胞可以吞噬或杀伤癌细胞及外来异己细胞。CV PS促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红,提示C V PS可以增强巨噬细胞吞噬功能,进而增强机体的免疫应答和非特异性免疫反应。
NK细胞是与T、B淋巴细胞不同的杀伤淋巴细胞,它无需抗原或有丝分裂原预先刺激,也无需抗体或补体参与,能在体内、外杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞等。NK细胞在机体肿瘤监护、抵御感染及免疫功能调节中发挥重要作用。CVPS可促进NK细胞杀伤K562细胞,提示CV PS可增强NK细胞的杀伤能力,进而对机体防御起到增强作用。另外,CV PS可明显增加小鼠单核巨噬细胞功能,明显增加免疫器官胸腺的重量,吞噬指数和胸腺指数明显高于空白对照组,说明其对器官免疫和细胞免疫均有促进作用。我们前面的试验已表明CV PS对T、B淋巴细胞活性有增强作用,通过本次试验证明了其对另外的重要的免疫细胞NK细胞和巨噬细胞同样具有促进作用。同时也进一步证明了其对非特异性免疫及特异性免疫均有增强作用。.
参考文献
1张秀军,徐俭,林志彬.羧甲基茯苓多糖对小鼠免疫功能的影响.中国药学杂志,2002;37(12)B913~916
2王国勤,吴敏毓.不同剂量黄芪组方的举元煎对小鼠免疫功能的影响.中成药,1998;20(12)B27~30
生姜油的抗炎作用
王贵林,朱路
(长江大学医学院,荆州434000)
摘要目的:观察生姜油的抗炎作用。方法:用二甲苯引起小鼠耳肿胀,鸡蛋清诱导大鼠足肿胀来观察生姜油对急性炎症的作用;用小鼠纸片肉芽肿模型来观察生姜油对慢性炎症的作用;观察生姜油对2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导小鼠迟发性超敏反应模型。结果:生姜油明显抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀和大鼠蛋清性足肿胀;抑制纸片引起的小鼠肉芽肿组织增生;拮抗DNCB引起的小鼠迟发性超敏反应。结论:生姜油具有明显的抗炎作用。
关键词生姜油;抗炎;迟发性超敏反应
生姜在临床上可用于风湿痛、关节炎、咽喉肿痛等病症的治疗。生姜主要含有3类成分,即挥发油、姜辣素和二苯基庚烷。近年来应用超临界二氧化碳萃取技术,从姜中提取生姜油,可同时保留部分挥发油组分和姜辣素组分[1]。本文研究超临界二氧化碳萃取姜油对急、慢性炎症模型的抗炎作用。1材料
1.1试验药物生姜油,由芜湖杉杉生物技术有限公司提供,采用超临界二氧化碳萃取,为棕红色油状液体,相对密度(20/ 20e)0.925,折光系数(20e)1.499。布洛芬,湖北金龙福药业
26中药药理与临床2006;22(5)
山东大学实验报告2011年3月30日 姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华 科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的 了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。 二、实验原理 (一)细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定 死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。 染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括： 死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。 死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。 除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。 三、实验器材
实验一巨噬细胞吞噬功能实验 1、【实验原理】 (1)巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。 (2)此实验采用体内法，即： 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡红细胞30min 后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美蓝染色，油镜下计数吞噬鸡红细胞的百分数，及观察巨噬细胞中内因被杀死而染为蓝色的鸡红细胞的形态、数目，以判断巨噬细胞中的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。 2、【实验步骤】 （1）试验前3d，小白鼠腹腔注射6％无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。 （2）实验时，每只小鼠腹腔注射鸡红细胞液1ml，轻揉腹部，使红细胞在腹腔中分布均匀，利于吞噬 （3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用吸管取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴 0.03％xx溶液，盖上盖玻片。 （4）低倍镜下找到观察区域后，换高倍镜下进行观察，计数 3、【实验结果】 4、【结果分析】 （1）如图所示，在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可以看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。
（2）镜下可见吞噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。 (3)由于未将腹腔液和冷美蓝溶液充分混合均匀，使得视野中出现大片深染区域。 总体实验结果较好，视野中央可见清晰的吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞。 5、【注意事项】 （1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 （2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。 （3）如小鼠腹腔液过少，可注入适量生理盐水。 （4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。 （5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。实验二双向琼脂扩散实验 1、【实验原理】 （1）可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀线/环的现象，称为沉淀反应。 （2）琼脂扩散是指为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。 当对应的抗原、抗体在半固体琼脂终相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，再适当的部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散不仅用于疾病的诊断，更广泛地用于抗原成分的分析。 （3）双向琼脂扩散试验是定性实验。将可溶性抗原与相应抗体分别加人琼脂板上的孔内，两者均可扩散，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。如
抗体的制备方法与原理－单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。 表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较 单克隆抗体的制备方法如下。 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～ 1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。
小鼠骨髓的综合性实验报告 YUNNAN NORMAL UN I VER SITY 本科学生综合性实验报告 学号姓名 学院专业、班级 实验课程名称： 教师及职称 开课学期至学年学期 填报时间年月曰 云南师范大学教务处编印 一（实验设计方案 实验名称实验序号 实验室实验时间 一、实验目的 1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2、观察小鼠染色体的形态特征，统计细胞的染色体数目。 3、了解微核发生的机制； 4、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序； 6掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力
二、实验原理、实验流程或装置示意图 1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象 血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 2、微核（Micronucleus）: 染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验设备及材料 1、材料：小白鼠（2n=40） 2、器具: 注射器（ 1 ml ，5ml 各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 3、药品： 0.15mg/ml 秋水仙素，1%柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS） pH6.8。
单核吞噬细胞系统 mononuclear phagocyte system,MPS 血液中的单核细胞和由其衍生的各种组织器官中的巨噬细胞（m）的总称，组织中的巨噬细胞随所在器官的不同而有不同的名称（图1[单核吞噬细胞的分布]）。具有强大的吞噬能力。主要功能为：①通过清除损伤和衰老的细胞及变异细胞维持机体自身稳定，即在机体内起“清洁工”的作用；②非特异地吞噬和破坏侵入机体的病原体和其他异物；③在机体的特异性免疫中，处理并呈递抗原信息给淋巴细胞，诱导免疫反应和调节免疫应 答。 ..梅契尼科夫于1882年在许多动物中观察到吞噬现象，并首先提出巨噬细胞一词。K.A.Z.阿绍夫1913年把全身各处对胶体染料有强吞噬力的细胞归纳为网状内皮系统。这包括血窦及淋巴窦的内皮细胞，脾脏、淋巴结等器官中的网状细胞以及单核细胞、巨噬细胞；他认为网状细胞可能变为巨噬细胞，它们共同起源于间充质细胞。后来发现网状细胞及内皮细胞无明显的吞噬能力，并且它们的起源不同。1969年拉尔夫?范?菲尔特根据单核细胞的分化过程，提出单核吞噬细胞系统(MPS)一词，用以取代网状内皮系统一词。单核细胞是这样分化的：造血干细胞→嗜中性粒细胞和巨噬细胞集落形成细胞（CFU-GM，为嗜中性粒细胞和单核细胞的共同前体细胞）→原单核细胞→幼单核细胞→单核细胞。各种组织中的巨噬细胞均由血液中的单核细胞迁移到组织中进一步成熟而形成，从单核细胞到巨噬细胞的变化是一个连续的过程，二者的功能又相同，所以实际应用中二者常相提并论，其用名也十分混乱，后者又称吞噬细胞、组织细胞、大单核 细胞，等等。 MPS细胞的形态单核细胞是血液中白细胞的一种，占白细胞总数的3～8％(240～480个/mm)，在赖特（原译瑞氏）氏染色血涂片上,单核细胞呈圆形或椭圆形,直径10～18m，平均约15m，是最大的白细胞。细胞质为弱嗜碱性,染色浅灰蓝色，内有大小不等的直径约0.1～0.2m的嗜天青颗粒（为溶酶体），核呈肾形或马蹄形。嗜天青颗粒的过氧化物酶呈阳性，细胞核周围脂酶呈阳性，这两种组织化学染色是鉴定单核细胞的重要方法。在透射电子显微镜下，单核细胞有发育较好的各种细胞器,还可见许多小沟,可能为吞饮小泡。巨噬细胞体积大，直径超过20m，细胞内含有酸性水解酶的溶酶体。在扫描电镜下，巨噬细胞表面有很多微绒毛和伪足，吞噬和消化异物功能强。MPS细胞的膜表面抗原和受体MPS的细胞表面具有特异性抗原（如CD）,主要组织相容性类和类抗原，其中类抗原常称为Ia（免疫相关）抗原，纤维粘连蛋白，IgG的Fc段受体，补体C3b受体，淋巴因子受体和淋巴细胞受体等。这些抗原和受体都与MPS 发挥多方面的免疫功能有关。 MPS细胞的异质性表现在两个方面：①不同组织器官中的巨噬细胞的异质性，如腹腔巨噬细胞的能量代谢以糖酵解为主，而肺泡巨噬细胞的能量代谢以有氧氧化为主。大鼠的腹腔巨噬细胞对T细胞增殖有辅助作用，而肺泡巨噬细胞对T细胞增殖反而有抑制作用。另外,两者在趋化性、补体受体等方面也有一定程度的差异，这种差异是组织局部适应的结果。②同一组织中MPS细胞的异质性，根据单核细胞是否具有能与单克隆抗体Mac-120结合的表面抗原，可将人外周血中的单核细胞分为Mac-120和Mac-120两个亚群，有Mac-120的单核细胞能刺激T细胞的增殖。根据Ia抗原的有无可将豚鼠腹腔的巨噬细胞分为Ia和Ia两群,Ia的巨噬细胞具有辅助活性。 MPS的功能MPS参与非特异性免疫反应。MPS的细胞能非特异地吞入破坏多种病原体和其他异物。对颗粒性物质的吞入称为吞噬作用，对胞外液体的吞入称为吞饮作用,这些都是消耗能量的主动过程。图2[巨噬细胞对细菌的吞噬作用及其后果]示巨噬细
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数 实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理 小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。 外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各 类免疫细胞。 免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。 红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1）健康小鼠 2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3）70汇醇 4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK 5）0.2%台盼蓝 6）细胞计数板、计数器 7）离心机 8）显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏 将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。 用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液
将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用 针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。 吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。 弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。3.3 计算细胞浓度 稀释十倍，随机选取一个大方格计数 细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml 3.4 计算细胞活力 在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为： 324- 16/324 X 100%=95.1% 在理论范围之内 4 实验结果 4.1 研磨脾脏得到细胞悬液 本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。 研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2 白细胞计数
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养 1、取骨髓，对倍稀释 2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用) 3、2000转，离心30分钟 4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液 5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板） 6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml 7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞） 8、重复两至三次 9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞 离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL— 4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮 11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。 参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。即： 1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。 2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。 3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。 4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度 10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。 5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。 6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。 7. 加入新鲜的完全培养基及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。 8. 半量换液，并补足rmGM-CSF；尽量保留悬浮细胞。 9. 继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，即为富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow- derived dendritic cell, BMDC)。经鉴定，此时BMDC的纯度可达80%以上。 楼上的cherry_28提供的好像是外周血DC的培养方法。我本人没有培养外周血DC的经验，但培养了2年半的小鼠骨髓DC，有稍许体会。其中体会最深的是：强烈反对初次铺板不到24小时就去除悬浮细胞的做法，我接触的网友中用贴壁时间<48小时而养不出DC不少于15位，而延长贴壁时间就可以大大提供集落形成率。下面是我用上述方法培养的小鼠DC，供朋友们共同讨论。
单核巨噬细胞系统与正常红细胞系统详解
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单核-巨噬细胞系统 单核-巨噬细胞系统（mononuclear phagocyte system、MPS）是高等动物免疫系统的一部份，由可以进行吞噬作用的细胞组成。包括血液中的单核细胞和组织中固定或游走的巨噬细胞，在功能上都具有吞噬作用。 单核-巨噬细胞均起源于骨髓干细胞，在骨髓中经前单核细胞分化发育为单核细胞，进入血液，随血流到全身各种组织，进入组织中随即发生形态变化。当血液中的单核细胞进入组织转变为巨噬细胞后，一般不再返回血液循环。巨噬细胞在组织中虽有增殖潜能，但很少分裂，主要通过血液中的单核细胞补充。 单核-巨噬细胞系统的细胞具有吞噬能力，除了吞噬细菌等外来病原，还可吞噬自身老旧的细胞（如库普弗细胞吞噬红细胞）、抗原
抗体复合物、蓄积的脂质等，并可在吞噬外来抗原后与辅助T细胞进行抗原呈现，活化特异性免疫反应。吞噬细胞与淋巴球、肥大细胞、粒细胞等有互相促进或抑制的交互作用，单核吞噬细胞系统的失调会造成疾病。 正常红细胞系统的介绍 正常红细胞系统在成熟过程中的变化特点骨髓中幼红细胞存在 于血窝(nlst)或血岛(Island)中，形成红细胞集落，常常是中心性网状。脱核后红细胞的大小常常可作为各种原因贫血诊断依据、如巨幼细胞贫血，小细胞贫血以及正细胞贫血等。 在发育过程中其特点：(1)细胞由大逐渐变小；(2)细胞核中异染色质凝聚不断增加，核仁从明显到逐渐消失；(3)细胞成熟时整个细胞核诽出细胞外；(4)细胞质内核蛋白体、线粒体由多到少、最后消
小鼠脾细胞/胸腺细胞BD Phosflow? 操作流程 Protocol I (Detergent Method) 所需试剂： 试剂准备： 按照说明书用双蒸水或者去离子水制备1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。使用前37°C 预热15-30分钟。 按照说明书用双蒸水稀释制备1 x Perm/Wash Buffer I （货号：557885）。放置至室温后使用。 操作步骤： 1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用PBS或完全培养基制备单细胞悬液 2. 350g 离心6- 8 分钟，弃上清 3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔） 4. 以1–10 x 106 cells/mL的浓度将细胞重悬于PBS或完全培养液中。必要时可以用70μm 的滤器过滤去除细胞团块。 5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要在前处理完成后，可以在完全培养基中静息2-4小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。
6. 用适当的刺激剂处理细胞，37°C 孵育适当的时间（1到30分钟，参见操作说明）。实验需设 立未处理样本为阴性对照。 7. 刺激处理完毕后，迅速加入10倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振 荡混匀5-10次。 8. 37°C 孵育10-12分钟。 9. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 10. 振荡器低速振荡混匀细胞。 11. 细胞清洗： a．加入与Lyse/Fix Buffer相等量的stain buffer试剂（货号：554656）。 b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 c．振荡器低速振荡混匀细胞。 12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞， 但此步骤不得超过2次。 13. 于1–10 x 10^6细胞中加入1ml （最少1ml）Perm/Wash Buffer I进行细胞破膜。轻柔混匀后，室温孵育15-30分钟。 14. 600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 15．振荡器低速振荡混匀细胞。 16. 细胞清洗： a．加入与1ml Perm/Wash Buffer I。 b．600g 离心6-8分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于50μL。 c．振荡器低速振荡混匀细胞 17. 用Perm/Wash Buffer I重悬细胞，使细胞终浓度为5–10 x 106 cells/mL。 18. （选做步骤）每1 x 10^6细胞中加入0.06 μg Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。混匀 后冰浴15分钟。 19. 取100 μL 细胞悬液（0.5–1 x 10^6细胞）置于12 x 75-mm BD Falcon?试管中，参考抗体说明书推荐用量加入相应BD Phosflow抗体。
第十二章 免疫系统 一、教学大纲要求 掌握淋巴细胞的分类及各类淋巴细胞在免疫应答中的作用，掌握胸腺、淋巴结和脾脏的结构特点和功能；熟悉淋巴组织的分类及其结构特点，熟悉单核吞噬细胞系统的组成、分布和功能特点；了解抗原提呈细胞与免疫的关系，淋巴细胞再循环的概念和意义，了解扁桃体的结构特点。 二、试题部分 (一)、填空题 1.胸腺是培育形成细胞的器官，骨髓是培育形成细胞的器官，然后细胞分别迁移到相应部位。 2.T细胞可分为三个亚群.( )、( )和( )。 3.脾的白髓包括、和( )。 4.含有大量( )的组织称淋巴组织，可将其分为( )和( )两种，后者又被称为( )。 5.淋巴结的皮质由( )、( )及( )构成。 6.淋巴结副皮质区又称，位于皮、髓质交界处，主要由组成，此区含有特殊的血管，即，是淋巴细胞进入淋巴组织的通路。 7.淋巴结的皮质淋巴窦窦壁最内层有 细胞，其外有薄层和 纤维及一层扁平的细胞。 8. 脾的实质分为( )和( )。 9. 脾血窦的窦壁由一层( )的内皮细胞排列而成，细胞间隙，内皮外有不完整的( )及环行( )围绕。 10.动脉周围淋巴鞘是围绕动脉的淋巴组织，相当于淋巴结的 区，为胸腺依赖区，含有大量的细胞。 11.人类的中枢淋巴器官包括 和。 (二)、单选题 1.构成免疫系统的核心成分是( ) A.淋巴细胞 B.巨噬细胞 C.浆细胞 D.肥大细胞 E.交错突细胞 2.中枢淋巴器官的一个重要特点是( ) A.培育效应性T细胞或B细胞 B.淋巴细胞增殖不受抗原的直接影响 C.出生前结构、功能未发育完善 D.较周围淋巴器官发生早 E.均以网状细胞和网状纤维为支架 3.艾滋病病毒特异性地破坏何种细胞而导致免疫瘫痪( ) A.辅助性T细胞 B.抑制性T细胞 C.细胞毒性T细胞 D.记忆性B细胞 E.初始B细胞 4.关于单核吞噬细胞系统的描述哪项错误( ) A.具有较强的吞噬作用 B.参与免疫应答 C.分泌多种生物活性物质 D.来源于血液内的单核细胞 E.包括血窦内皮细胞和网状细胞 5.抗原提呈细胞存在于( )
骨髓细胞微核试验(保健食品) 1.实验动物 小鼠是微核试验的常规动物，也可选用大鼠。通常用7周~12周龄，体重25g~30g的小鼠或体重150 g~200 g的大鼠。每组用两种性别的动物至少各5只。动物购买后适应环境至少3天。 2．剂量及分组 受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD50，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LD50和1/8LD50 作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD50时，高剂量组则按以下顺序：a) 10g/kg体重; b)人的可能摄入量的100倍;或c) 一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口或腹腔注射(首选经口)给予。 3．操作步骤 3.1 受试物配制 一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳化液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液(或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。 3.2 实验动物的处理 经口灌胃。根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，确定取材时间。常用30h给受试物法。即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。3.3 标本制备 取胸骨或股骨,用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀,常规涂片,或用小牛血 清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片,涂片自然干燥后甲醇固定5~10min。当日固定后保存。将固定好的涂片放入Gleams应用液中，染色10~15 min，立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗、晾干。写好标签，阴凉干燥处保存。 3.4 阅片 选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域,在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。 本法系观察嗜多染红细胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致,呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20~1/5。 用双盲法阅片。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。 观察嗜多染红细胞与成熟红细胞(PCE/RBC)比值，可作为细胞毒性指标之一。一般计数200个嗜多染红细胞。受试物组未成熟红细胞占红细胞总数的比例不应少于对照组的20%。 4. 数据处理 一般采用卡方检验、泊松分布或双侧t检验等统计方法进行数据处理，并按动物性别分别统计。 5. 结果判定 试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
篇一：巨噬细胞吞噬实验&沉淀实验实验报告 实验二 一巨噬细胞吞噬功能实验 【原理】巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的主要细胞，局域活跃的吞噬功能。吞噬细胞受抗原刺激后活化，可使吞噬功能明显增强。 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡血红细胞，30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，显微镜下计数吞噬红细胞的百分数，及观察吞噬细胞内鸡红细胞的数目，以判断吞噬细胞的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异性免疫水平。 【方法】体内法： （1）实验前3小时，小鼠腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。 （2）实验时，每只小鼠注射鸡红细胞1ml，轻柔腹部，使其在腹腔中分布均匀，利于吞噬。（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用载玻片轻擦腹腔，使腹腔液均匀涂于载玻片过，再滴一滴%冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。 （4）高倍镜下进行观察，计数。 【结果】 【分析】 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。 二沉淀反应双向琼脂扩散实验【原理】将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上的孔内，二者均可发生扩散，并且随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。本实验是定性实验，常用于分析抗原抗体的纯度关系以及相互关系。 【方法】 （1）制板：将熔化的1%琼脂加在载玻片上约5ml （2）打孔：待琼脂凝固后，将载玻片置于打孔样板上，用打孔器打孔 （3）加样：在中央孔内加抗体，上下两孔加抗原1，左右加抗原二，每孔加10μl （4）结果观察：将琼脂板置于湿盒，37℃一天后观察结果。 【结果】 在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线，有抗原抗体反应，为阳性反应，说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线，说明抗原2与抗体之间不相对应。【分析】抗体与抗原发生扩散时，随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。当有沉淀线出现时，说明有抗原抗体反应。 琼脂铺板时要一次铺成，并且铺设均匀。 打孔时要注意垂直打孔，注意不要有裂隙产生。篇二：中性粒细胞吞噬功能试验(小吞噬试验)中性粒细胞吞噬功能试验（小吞噬试验） 实验目的 1.熟悉中性粒细胞的吞噬作用原理和方法。 实验原理血液中的中性粒细胞即小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等几个步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫的重要组成部分。实验材料 实验方法 片。 瑞氏染色法：取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。然后加等量蒸馏水，轻轻晃动混匀，继续染5分钟，水洗，用吸水纸吸干后镜检。 结果观察油镜检查：寻找中性粒细胞，如果染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而粒细胞的细胞浆则为淡红色。中性粒细胞吞噬试验 计数：1.吞噬百分率：观察100个中性粒细胞，计算其中吞噬有细菌的中性粒细胞数，计算出吞噬细胞百分率。 2.吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计算其中被吞噬的细菌总
脾脏单个核细胞的制备 脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混 匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计 数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 μl 的浓度。《流式细胞术检测小鼠 脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》 单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾 脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。加入2 mL RPM I- 1640完 全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织 碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至 5×10 cells /L。《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》 610 制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取: 手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈 椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出 脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。粗剪成小块, 用 注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加 人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。收集滤过的细胞悬液, 加人0.83 % 的氯化铵到滤 过的细胞中, 静置5 min , 以除去血红细胞。用RPM-ll640 培养液离心( 2500 r/min,10min) 洗涤细胞3 次, 以除去剩余的氯化铵将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培 养瓶中, 在37 ℃ 、5 % C O: 培养箱中静置培养2 h , 以除去贴壁细胞, 收集未贴壁的 细胞悬液即获得脾淋巴细胞。计数接种培养。台盼蓝染色计数, 活细胞数大于95 % 。 《从Ca2+通路研究紫草多糖促进小鼠淋巴细胞增殖的机制》 ， 14日龄健康鸡，无菌取脾脏，Hanks'液洗3 次，卡介苗注射器芯研磨，200 目筛网 过滤，制成单细胞悬液，离心( 1000r/min) ，弃上清，Tris-NH4Cl 破解红细胞，冰水浴 放置10min，离心( 1000 r /min) ，弃上清，Hanks'液洗3 次。加入无酚红1640 培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1 × 10 cell /mL。于96 孔细胞培养板培养。《马尾 藻多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及氧化应激影响的实验观察》 6
小鼠骨髓的综合性实验报告 本科学生综合性实验报告 学号姓名 学院专业、班级 实验课程名称: 教师及职称 开课学期至学年学期 填报时间年月日 云南师范大学教务处编印 一( 实验设计方案 实验名称实验序号 实验室实验时间 一、实验目的 1、学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 2、观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。 3、了解微核发生的机制; 4、掌握微核实验的一般程序和实践意义; 5、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序; 6、掌握进行实验设计的一般程序和规则，并锻炼实践能力。 二、实验原理、实验流程或装置示意图
1、骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。 2、微核(Micronucleus):染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。 嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 三、实验设备及材料 1、材料:小白鼠(2n=40) 2、器具:注射器(1ml，5ml各一支)、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 3、药品: 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液(3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配)，Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液(PBS)pH6.8。 4、生物显微镜、解剖剪、镊子、注射器、载玻片、盖玻片、塑料吸瓶、吸水纸等。四、实验方法步骤及注意事项
成纤维细胞在一般创伤修复中的表现各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。 【请教】什么是网状内皮系统？？？ 2009-05-0812:38:27A M 【请教】什么是网状内皮系统？？？ 更多相关内容请访问"医药家园论坛"万人专家团为您在线答疑 各位： 什么是网状内皮系统？？？ 我是菜鸟！希望各位指导！ 谢谢！ 在机体的免疫系统中，巨噬细胞由于其活跃的生物学功能，尤其是在免疫应答和机体防御机制中的重要作用，而一直受到重视。早期研究中常将具有高吞噬能力的吞噬细胞如巨噬细胞，及低吞噬力的网状细胞，统称为网状内皮细胞系统，认为他们在体内承担着防御和清除代谢产物的功能，现在的研究表明，具有这种功能的细胞主要为单核－巨噬细胞，因而改成为单核－吞噬细胞系统。 搜索google,第一条 单核细胞及由单核细胞演变而来的具有吞噬功能的巨噬细胞，称为单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocytic system，MPS）。单核细胞发生于骨髓的多能干细胞，循环于血液中，穿透血管内皮进入组织内，转变为巨噬细胞。单核吞
小鼠脾细胞的体外培养及形态观察 黄殿玲,李核,何文琴,李霞,杨佩,王纯 摘要：用组织块法和冷消化法对小鼠脾细胞在含血清培养液中进行原代培养,并对正常细胞形态进行观察。结果表明组织块法和消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群,细胞呈典型的成纤维形态。 关键字：脾细胞原代培养形态 多细胞生物的细胞可以分离出来，在适宜的培养液以及培养箱中存活，并在一定的时间内，保持其形态、生理、生化特性，经过一定时间还可以观察到一定量的细胞。直接从身故体内分离的细胞，如小鼠的脾细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。 在生物体内或体外，正常的细胞只能分裂一定的次数，然后停止分裂，最终死亡。这一过程称为衰老，此为正常的现象。只有细胞被转化后，细胞可以无限增殖，就称为细胞系/株。细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。这就要为细胞的培养创造适宜的环境，使细胞更容易存活或生长。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。 超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。细胞培养是细胞生物学研究的中心技术。通过细胞培养可以观察研究细胞的某些生理特性，同时在体外进行细胞培养，也打破了以往的细胞只能在生物体内增殖、分裂。其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。 1 材料与方法 1.1 实验材料 取出生一周的小鼠，采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。取一只小鼠置于解剖盘中，抓住小鼠的尾巴，确保小鼠的前爪在解剖盘中，慢慢的安抚使小鼠安静下来；用剪刀或手术钳紧紧的按住小鼠的颈的后部，用力向后拉小鼠的尾巴；切记不要