转基因技术及其在植物育种中的应用
一、概述
从70年代重组DNA技术创建，到1983年第一株转基因烟草获得以来，国际上对转基因作物就存在着截然不同的观点：接受？抵制？随着技术日趋成熟，转基因作物由实验室进人大田中试，不少作物已向商品化发展。与此同时，转基因作物的生态风险，可能带来的环境问题、转基因产品作为食品对人体健康问题、产品贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。转基因技术实际上已由学术观点分歧，发展到知识产权问题、环境问题、经济问题甚至政治问题
二、什么是转基因技术
转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。又名"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"。
三、几种常用的植物转基因方法
遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中国科学家提出的。
1．农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研究。
2．花粉管通道法
在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由中国学者周光宇提出，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
3. 基因枪法
利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。
四、转基因植株的检测
标记基因(包括选择标记基因及报告基因)用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化
的细胞、组织和再生植株。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，转化细胞由于有抗性，可继续成活、分裂并分化成植株。选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因等，其中用得最多的是抗生素抗性标记基因。报告基因包括葡糖醛酸苷酶(gus)、荧光素酶(1uc)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、以及绿色荧光蛋白(gfp)基因等。标记基因通常与目的基因构建在同一植物表达载体上，一起转人植物，但标记基因本身有时也可作为目的基因，如除草剂抗性基因提供除草荆抗性。
（一）报告基因的捡测
报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，因而易于进行转化后的筛选。利用酶法分析、通过同位索放射性自显影技术及底物的颜色反应可以快速鉴定报告基因的表达，从而有效地检测出重组细胞或组织。根据报告基因编码特点，大致分为两类：抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因。
1 抗性基因的酶活性检洲（新霉索磷酸转移酶(NIT—II)、氯霉索乙酰转移酶(CAT)、PPT乙酰转移酶(PAT)是常用的3种抗性酶，因其易于检测，编码基因常用作报告基因。）
2 腑脂碱和章鱼碱的测定
3 荧光素晦活性检洲检
4 GUS晦活性检测
（二）PCR法检测转化植株
PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达到ng乃至旭水平，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，谟化乙锭染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。
（三）点杂交和Southern杂交
点杂交是将提取DNA或RNA不经酶切，直接点到硝酸纤维膜或尼龙膜上与探针进行杂交的技术。利用点杂交，可以初步鉴定转化体中是否有整和的外源基因。罗云渡等Ⅲ用DNA、RNA 的点杂交技术对转基田植株进行鉴定。取得与田间表现一致的结果。但点杂交的特异性差，阳性植株譬进一步作Southern杂交验证。
Southern杂交是将经酶切DNA转移到杂交膜上与探针杂交的技术
（四） Northern杂交
Northern杂交是将试材RNA与探针杂交的技术，用于检测基因在转录水平上的表达。Northern杂交的主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上，用特定的DNA探针来检测RNA
（五） Western杂交
Western{缸交技术是将蛋白质从SDS-PAGE胶中电转移至固相支持体上，彝}；后对固定化蛋白质进行免疫学测定的方法。Western杂交灵敏度极高．髂达到标准的固定相放射免疫水平
Western杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果．髂直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现
四、转基因作物研究进展
（一）国际转基因作物的研究进展
自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与产业应用快速发展。
中国是国际上第一个商品化种植抗黄瓜花叶病毒(CMv)和抗烟草花叶病毒(TMv)双价转基因烟草的国家，但后劲不足。美国发展很快。
发展态势：
1是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息学等学科的发展，转基因技术研究日新月异，研究手段、装备水平不断提高，基因克隆技术突飞猛进，一些新基因、新性状和新产品不断涌现。品种培育呈代际特征，目前全球转基因生物新品
种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变，多基因聚合的复合性状正成为转基因技术研究与应用的重点。
2是产业化应用规模迅速扩大。截至2009年底，全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积，由1996年的2550万亩发展到2009年的20亿亩，14年间增长了79倍。美国仍然是最大的种植国，2009年种植面积9.6亿亩；其次是巴西，3.21亿亩；阿根廷，3.195亿亩；印度，1.26亿亩；加拿大，1.23亿亩；中国，5550万亩；巴拉圭，3300万亩；南非，3150万亩。值得一提的是，2000年以来，美国先后批准了6个抗除草剂和药用转基因水稻、伊朗批准了1个转基因抗虫水稻商业化种植；加拿大、墨西哥、澳大利亚、哥伦比亚4国批准了转基因水稻进口，允许食用。
3是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿美元。
4转基因柞物中发展得最快的是大豆，全球1997年为510万公顷，到1998年猛增到1450万公顷。其它依次为转基因玉米、棉花、油菜，转基因马铃薯仅占很小一部分面积。
5以转基因的性状而论，发展得最快的是抗除草剂转基因作物，l997年全球面积为690万公顷，1998年猛增1290万公顷，达到l980万公顷，其次是抗虫转基因作物，由1997年的400万公顷发展到770万公顷，此外抗虫与抗除草剂双价转基因作物也有所发展。
（二）我国转基因作物的研究进展
我国是世界上转基因作物第一个商品化种植的国家且前经农业部审查并经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的抗虫转基因棉花(＆棉及＆ +CpTI棉)、美国Monsanto公司开发的有＆棉、延迟成熟期的转基因番茄、抗(Mv转基因番茄、抗cMv转基因甜椒及转查尔酮合酶(CHS)基因矮牵牛，但除转基因抗虫棉已经大面积生产外，后几种作物面积仅在1公顷左右。
五、转基因技术在作物育种中的应用
1 抗病毒抗病毒方面目前以转移病毒外壳蛋白(CP)基因的技术最为成功。1986年首先将TMV外壳蛋白导入烟草和番茄，使转基因植物获得了对TMV的抗性。至今除TMV外壳蛋白基因外，还把CMV、PVX、SMV、ALMV等多种病毒的外壳基因导入烟草、番茄、马铃薯、大豆等多种作物中，在不同程度上减轻了病症，推迟了发病时间。
2 抗细菌和真菌从抗病植物中克隆出抗病基因再导人易感病的植物中，从而提高后者的抗病性。例如已转育成功的抗白粉病、赤霉病和黄矮病的小麦，但这些基因只能对特异的病原菌生理小种有一定抗性，当新的生理小种占优势后就会丧失其抗性，因此这类基因的转育效果并不理想。
3 抗虫抗虫方面目前应用最广泛的是苏云金杆菌的Bt杀虫晶体蛋白基因和豇豆等作物中的胰蛋白酶抑制基因。转Bt基因的作物已有烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米和棉花等，均有较好的杀虫效果。
4 抗除草剂目前利用转基因技术获得抗除草剂作物的途径有二条，其一是改变除草剂靶物的敏感性，其二是导入编码降解除草剂的解毒酶基因，对相应的除草剂呈现出一定的的抗性。
5 改善植物品质主要是通过转基因技术改变植物中氨基酸组成和含量，提高植物品质。其他，如分别导入抗寒基因、热休克蛋白基因和耐盐的相关基因，从而提高转基因植物的抗寒、耐热和抗盐能力。此外转基因技术还获得了一些雄性不孕植物、果实延缓成熟的番茄、改变了花颜色的矮牵牛等。
六、转基因作物的利弊分析
（一）.转基因技术有如下优势：
1拓宽可利用的基因资源；
2培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径；
3可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择
4可以大大提高选择效率，加快育种进程。
5生产转基因药品。将一种有治疗作用的基因植入某种食品，人们只需吃食物就能预防或治疗疾病。
（二）转基因作物的潜在风险
1转基因作物本身可能变为杂草；
2转基因作物通过基因流可使野生近缘种变为杂草；
3可能产生新的超级病毒或新的病害；
4作为人工制造的转基因作物，可能成为自然界原来不存在的外来品种，若干年后可能对环境造成破坏；
5对非目标生物有伤害，对生物多样性形成威胁
6转基因产品的毒性，能引起人的过敏反应。
（三）基因水平转移(Horizontal gene transfer)的可能性
目前的结论是：这种可能性非常小，除非在特倒中需加考虑。理由是：
1．DNA从植物细胞中释放出来后，很快被降解成小片段，甚至核苷酸，因此植物DNA在进入有肠道微生物存在的小肠下段、盲肠及结肠前已被降解。
2．即使DNA 完整地存在，DNA转移并整合进受体细胞也是一个非常复杂的过程，包括许多步骤：(1)DNA 必须与细胞结舍，穿过细胞膜进入细胞，且不被宿主细胞内的核酸酶及修饰系统降解。(2)受体细胞必须呈感受态。(3)为与受体细胞的基因组发生重组，供体和受体至少要有一段2O bp的DNA完全同源。(4)要有合适的调控系统才能表达。(5)标记基因的表达只有在筛选压下才有优势，对抗生素标记而言，只有在口服抗生素后才有这种选择压。(6)目前尚不知在消化系统中有植物DNA转至微生物的机制，上皮细胞又因新陈代谢、半衰期很短而被不断取代，不可能保存下来。
七、转基因作物作为食品的安全性问题
经济发展合作组织(OECD)1993年提出了“现代生物技术食品的安全性评价：概念和原则”的报告，报告中引入了一个“实质等同性”(substantial equivalence)的概念。
1996年9月30日至1O月4日第二次FAO／WHO专家咨询会议于意大利罗马举行，就生物技术与食品安全性问题作了进一步讨论，会议将转基因植物、动物、微生物产生的食品分成三类：(1)与市售传统食品具有实质等同性；(2)除某些特定的差异外，与传统食品具有实质等同性}(3)与传统食品没有实质等同性“。
当前有的转基因食品已经上市，应该在上货架时对该食品要贴标签，让公众对是否愿意购买食用转基因食品有选择的自由
八、转基因作物的专利保护
国外出售的玉米种子都是杂交种，只能种一年，由于第二年会发生大量分离而收获的种子不能作种用，农民每年得向种子公司购买种子。这本身也就起到了专利保护的作用。而其它如水稻、大豆、棉花、小麦卖的都不是杂交种，应用高技术得到转基因作物种子的农民可以把收获到的种子留作种用，这样，遗传工程技术公司就赚不到高额的利润。
1“终止子技术”这项技术的大致程序是，科学家用遗传工程的技术把终止子基因插入到作物中得到转基因作物的种子；种子公司在种子出售前再加上一种诱导剂，农民播种后长出正常的植株，收获成熟的种子。这种种子在油脂、蛋白质等各方面分都是完全正常的，但
不能种用。因为在诱导剂的作用下，加入的毒素基因启动产生了毒素，在种子成熟收获前就杀死了胚胎，因此这种种子不能发芽当生产用种。
为了保护对世界食品的保障，要求禁止终止子技术。明确提出5点：农民留种的重要性，特别对贫穷的农民尤为重要；终止子技术对遗传多样性的影响；为了发展持续农业农民育种的重要性；由于外观上分不清终止子技术生产的种子，可能出售或交换不能发芽的种子，播种后对生产造成不可弥补的损失；通过花粉非故意传播造成生物安全的风险。
2“特殊性状的遗传利用限制技术” T— Gurt种子是科学家经过基因遗传修饰后产生特殊的性状，例如耐盐或耐旱的性状。如农民需要这种种子则必须到有关公司去买专卖的化学品去喷洒种子活化这种性状。与终止子技术根本不同的是种子本身还是活的，
九、几点建议
1 加强优质、高产厦提高各种抗逆性转基因作物的研究
2 加强“生物安全”问题的研究
3 建立“生物安全”的临测制度
4 利用基因工程技术保护知识产权
5遵守已有的法律法规和国际性安全标准。
6，设立伦理审查委员会，规范科学家、技术使用者和生产者的行为。
7，建立一套合理的、规范的、严密的科学检测、评估制度
8加强关于转基因技术的宣传、普及、教育工作，并设立较完善的咨询服务机构。
基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。?在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。?随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。? 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。?目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面
植物转基因技术（transgenic?technology）又称遗传转化技术（genetic?transformation），通常是指将已经克隆、分离的外源或者内源基因构建到特定的载体上，然后借助生物、化学或物理的手段转移到受体植物细胞基因组中，使目的基因能够在受体内遗传，实现在新背景下稳定表达和遗传，并赋予植物人们所需要的农艺性状（如抗病、抗虫、抗逆等）的方法。转基因技术不仅为基因的表达调控和遗传的研究提供了一个理想的试验体系，尤其重要的是为植物特别是农作物的定向改良和分子育种提供了一个有效的途径和方法。自1983年转基因植物问世以来，在这短短的近三十几年的时间里，转基因技术发展十分迅速，至今已有数百种植物转基因获得成功。文章简要介绍常见的几种植物基因转化的方法、转基因技术的应用及其发展前景。 1?植物转基因技术的方法 迄今为止转基因技术大致可划分为两类：一种是载体介导法，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，如农杆菌介导法、病毒介导法等，其中主要的方法就是农杆菌介导法；另一种是DNA直接摄取法，即将裸露的DNA通过物理或化学的方法直接转入植物细胞，如基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法、花粉管通道法、电击法、显微注射法、超声波导入法等。目前较常用的几种植物转基因技术有农杆菌介导法、基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法及花粉管通道法。 1.1?农杆菌介导法? 农杆菌介导法是目前双子叶植物遗传转化最常用的方法［1,2］。它是将植物表达载体转入根癌农杆菌，以根癌农杆菌工程菌为介导，通过侵染受体植物后能将它所携带的Ti-质粒上的一段目的DNA 插入到受体细胞基因组中，从而实现新基因的导入与整合。根癌农杆菌Ti-质粒转化系统是目前研究最多，技术方法最成熟的基因转化途径。然而长期以来农杆菌介导转化方法仅局限于双子叶植物，直到近年来才在单子叶植物上有了重大突破［3，4］，如水稻［5］、玉米［6］和大麦［7］等。 1.2?基因枪法 基因枪法于1987年由Sanford提出［8］，是指用钨粉或金粉包裹外源DNA，然后利用火药的爆炸、高压放电或高压气体驱动力，将制备好的钨粉或金粉颗粒加速，射击真空室中的细胞或组织从而导入外源基因，进而达到目的基因在受体细胞中稳定遗传和表达的目的。该方法对靶细胞、受体材料来源基本无严格要求，小到细胞大至组织、器官等均可作为受体实现转化。目前，通过基因枪技术，很多植物如水稻［9］?、玉米?［10］、小麦?［11］、大豆［12］、土豆［13］、棉花［14］等均已获得成功。此外，基因枪技术还能将外源基因转化线粒体和叶绿体，使转化细胞器成为可能［15］。 1.3?聚乙二醇介导法? 目前最常用的化学诱导物质是聚乙二醇（PEG），PEG能与原生质体融合，通过改变原生质体膜的通透性，进而提高原生质体对外源DNA的吸收效率，达到基因转化的目的。该方法具有以下几个优点：首先对细胞伤害小；其次也是最主要的优点是充分 植物转基因技术及其应用 黄?珊 （福建省农业科学院水稻研究所，福建福州350018） 摘?要：植物转基因技术是研究植物基因功能及对植物各种农艺性状进行改良的重要手段之一。近几十年来，植 物转基因研究已成为国内外植物分子遗传学研究的热点并取得显著进展。文章综述了植物转基因技术的原理及迄 今为止在植物中常见的转基因技术的方法，概括了植物转基因的应用现状与前景。 关键词：植物；转基因技术；应用 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1008?-?9799（2012）01?-?0084?-?04 收稿日期：2012?-?02?-?14 作者简介：黄珊（1980－），女，助理研究员，研究方向：水稻遗 传育种。
植物转基因技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
生物工程的导论论文之植物转基因技术 生物1002班郭雅莉 201041006 摘要：目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。为此，我将对植物转基因技术及其应用、和当代社会发展的概况进行系统阐述，同时对转基因食品的安全性问题进行系统的讨论。 关键词：国际状况转基因技术应用安全性问题 自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 然而由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食 品”[1]。 一、国际植物转基因技术状况简介 转基因技术已在多种植物上获得成功，转基因的棉花、大豆、玉米、水稻、烟草、番茄、油菜等重要粮食作物和经济作物已作为商品投入市场。其进入田间实验的种类不断增加，除转基因粮食作物之外，转基因蔬菜、瓜果、牧草、花卉、林木及特用植物数量逐渐增加，基因种类和来源日益丰富，转基因性状日趋多样复杂。 在所涉及的转基因方法中，农杆菌介导法占50种，基因枪轰击法24种，DNA直接转移法2种，电击介导法2种，化学介导法1种[5]。已把一
植物叶绿体基因工程发展探析(一) 摘要从叶绿体的概念、转化优点、转化主要过程及方法等方面概述了叶绿体基因工程的发展情况,介绍了叶绿体基因工程的应用,包括提高植物光合效率、合成有机物质、生产疫苗、增强植物抗性及在系统发育学中的应用等,并提出叶绿体基因工程存在的问题,对其未来发展进行了展望。 关键词植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年Baur和Correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣1]。1988年Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体(atPB基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。 1叶绿体基因工程概述 1.1叶绿体简介 叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列(分别位于A链和B链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。 1.2叶绿体基因组转化优点 叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。 1.3叶绿体转化的主要过程 叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物4]。 1.4叶绿体转化的主要方法 依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株5]。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。 2叶绿体基因工程的应用 2.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量6]。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子
关于植物转基因技术的一些读书报告 在生物工程导论课上，我了解到了一些关于植物转基因技术的知识，对此产生了浓厚的兴趣，加上自己的专业在以后会有这方面的学习和发展，所以查阅了一些相应的资料，有了一些感想。 世界上首次使用植物转基因技术是1983年美国获得了转基因烟草，自 此以后，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用。目前，转基因技术已经成熟，转基因作物也已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。植物转基因技术主要应用于农业，生物和医学等领域。进行植物品种的改良，新品种的培育以及作为生物反应器生产生物药物和疫苗等。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。因此，人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。这次技术革命将使全球农业生产发生深刻的变革，使人们看到消除饥饿与贫穷的希望。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 但是，像其它新生事物的发展过程一样，由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性问题 就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食品”。甚至当前，一些电视、广播、报纸等新闻媒体为了某些利益也对公众进行炒作和误导，夸大转基因作物的风险，使人们对转基因技术及其转基因食品由最初的争论演变为恐慌甚至存在一定的抵触 情绪。如某电视广告中所提到的：某某食用油，不含转基因成分，为健康加油；某网站新闻报道：湖北某超市惊现转基因大米等等，使人们对当前社会上对转基因技术存在的一些偏见。 在此我希望可以尽量避免偏见，对植物转基因技术的应用和当代社会发展的概况进行一些比较系统的阐述，对植物转基因技术与当代社会发展的关系进行一点探讨。 植物转基因技术的基本概念和原理 基因是生命体具有的特定遗传信息和遗传效应的核苷酸序列，存在于DNA （脱氧核糖核酸）上，是控制生物性状遗传的结构和功能单位。转基因是指利用分子生物学手段，将人工分离和修饰过的某些生物的基因转移到其它物种，以改造该物种的遗传特性。植物转基因技术又称植物基因工程，是把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因转移到植物的基因组中，即对植物进行遗传转化，使其在性状、营养和消费品质等方面满足人类需要的技术。应用转基因技术构建的植物为转基因植物，又叫基因修饰植物，其中发展最快的是转基因植物食品。 植物转基因技术的内容包括：目的基因的分离和鉴定、植物表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、转化细胞的筛选、转基因植物细胞的鉴定以及外
我对转基因作物应用的看法 我对转基因作物应用持支持态度。理由如下： 1.转基因作物的优势。 与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势。主要体现在： (1)转基因育种技术体系的建立使可利用的基因资源大大拓宽。实践表明，从动物、植物、微生物中分离克隆的基因，通过转基因的方法可使其在三者之间相互转移利用。 (2)转基因育种技术为培育高产、优质、高抗，适应各种不良环境条件的优良品种提供了崭新的育种途径。这既可大大减少杀虫剂、杀菌剂的使用，有利于环境保护，也可以提高作物的生产能力、扩大作物品种的适应性和种植区域。 (3)利用转基因育种技术可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择，同时随着对基因认识的不断深入和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规育种中是难以想象的。 (4)利用转基因技术可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，通过转基因的方法，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。 2.转基因作物的安全性 2.1环境影响及生态效应 2.1.1反对者认为现在存在的都是合理的，基因改良是反进化。其实这种观点本身恰恰是违反了进化论,因为进化并不是一成不变。现在的物种是长期自然选择和人工选择进化的结果。农业本身与生俱来就不是自然活动,今天的作物已没有一种像它们的野生祖先,它们已经过数千年的选择而使其更能适应生境和更加高产。因此,GMC仅仅是人类活动的逻辑延伸,并不比我们实践了多个世纪的活动更违反自然。以Bt抗虫作物而言,试想还有什么样的作物能像GMC一样只需很少或根本不需喷农药而对环境更友好? 2.1.2转基因作物的生态效应 以我国大量种植的转基因作物Bt棉为例，来说明转基因作物的生态效应（1）对靶标生物的影响。Bt棉花的种植能够有效控制棉铃虫对多种寄主作物的危害，减少化学杀虫剂的使用。吴孔明等通过比较我国Bt棉花种植前后15年间田间棉铃虫的发生量，发现棉田棉铃虫的种群数量随着Bt棉花的推广种植而显著减少。 （2）对非靶标生物的影响。吴孔明等1998年~1999年在河北、河南抗虫棉田中对害虫的种群数量作系统调查后发现,瓢虫类、草蛉类、蜘蛛类捕食性天敌的数量在抗虫棉田中大幅度增加,它有效地控制了蕾铃期棉蚜种群的发展。 （3）靶标害虫的抗性。Bt棉花在我国自1997年推广种植以来，虽有抗性风险的报道，但至今田间没有大规模抗性的发生，远远低于一般化学农药的抗性产生风险。而针对害虫对转基因棉的抗性，我国采用了天然庇护所来延缓害虫Bt抗性的发展。 2.2 食品安全性 （1）转基因食品在上市之前都会做风险的评估来证明它的安全性，这个评估的体系是目前在食品安全评估中使用的最严格的一套体系。在评价转基因食品安全性的时候采取的一个原则，叫做实质性等同原则，即如果转基因食品跟同类的非转基因食品的安全性是一样的，就认为它是安全的。我们不可能去认定某一
1转基因植物安全评价的意义 转基因植物育种,是利用遗传工程的手段,有目的地将外源基因或DNA构建导 入植物基因组,通过外源基因的直接表达,或通过对内源基因表达的调控,甚至通过直接调控植物相关生物如病毒的表达使植物获得新的性状的一种品种改良技术,可最大限度地满足人类的需要[1]。 与此同时,转基因技术使物种的进化速度远远超过生物自然变异与选择的速度,对于这种急剧的生物物种变化,自然界能否容纳和承受?自然界的其他组成部分是否会因此受到伤害或破坏?转基因植物及其产品被人们食用时,是否会向人体肠道微生物发生基因转移?是否会出现由于某种新物质的形成对人体健康产生危害或潜在影响?要消除这些疑虑就要进行转基因植物的安全性评价。要经过合理的实验设计和严密科学的实验程序,积累足够的数据,根据这些数据判断转基因植物的大田释放和大规模商业化生产是否安全,对实验证明安全的转基因植物正式用于农业生产,对存在安全隐患的加以限制,避免危及人类生存及破坏生态环境[2]。因此,制定科学完善的安全性评价的原则与方法,对确保人类健康和环境安全及转基因技术的健康发展具有十分重要的意义。 2转基因农产品安全评价的内容 2.1转基因植物的环境安全性 转基因植物的环境安全性评价要解决的核心问题是转基因植物释放到田间后是否会将基因转移到野生植物中;是否会破坏自然生态环境,打破原有生物种群的动态平衡[2]。 转基因植物演变为农田杂草的可能性:转基因植物可通过传粉进行基因转移,可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草,如果杂草获得了这些抗性,就会变成超级杂草,使农田杂草难以控制。 基因漂移到近缘野生种的可能性:在自然生态条件下,有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交,从而将栽培植物中的基因转入野生种中。在进行转
吉林农业科学 2001,26(5):26-30 Journal of Jilin Agricultural Sciences 文章编号:1003-8701(2001)05-0026-05 转基因植物的研究与应用 程焉平 (四平师范学院生物系,吉林四平136000) 摘 要:介绍了转基因植物的主要研究方法及其在各个领域中的应用现状,并对其今后的应用前景加以展望。 关键词:转基因技术;转基因植物;遗传转化;生物安全 中图分类号:Q94312文献标识码:A 自1983年第一株转基因植物问世以来,转基因植物的研究和应用在世界各国蓬勃开展。所谓转基因植物就是植物细胞或组织经遗传转化后,进行组织培养长出愈伤组织,再经诱导所分化出来的完整植株。转基因可以使优良的生物基因在不同种生物之间进行交流,从而弥补单一生物种类中的遗传资源不足,丰富种质库。转基因植物的研究在目前的生物技术领域中最为活跃,具有十分广泛的应用前景。 1 植物转基因技术 111 土壤农杆菌介导转化技术 革兰氏阴性菌根瘤农杆菌(Agrobcterium tumer f aciens)是一种植物病原菌,通常只能感染双子叶植物的受伤部位。农杆菌携带一种称为T i的质粒(tum or-inducing plasmid),该质粒含有一段NDA,称T-DNA(trans fer-DNA),它能转移并整合到植物组织中,并导致冠瘿瘤(crown2 gall)的形成。不含有T i质粒的土壤农杆菌不能诱导冠瘿瘤产生。 利用T i质粒对植物进行遗传转化的最基本方法是将目的DNA片段插入T-DNA区,然后通过土壤农杆菌和T i质粒将其送入受体植物并整合到植物细胞的基因组内,使之得到遗传转化。 土壤农杆菌介导的基因转移是目前最常用的获得转基因植物的方法。由于近几年来在载体系统和转化方法上的不断完善,土壤农杆菌介导的基因转移不仅局限于其天然寄主双子叶植物范围内,在转化水稻、玉米和小麦等单子叶植物上也取得了重大的突破。例如, Ishida等1996年在玉米上获得了5%～30%的转化率,Hiei等1994年在水稻上获得了29%的转化率。就目前的情况看,土壤农杆菌介导的基因转化关键在于找到合适的组织培养和再生技术。 112 基因枪技术 由于土壤农杆菌转化技术在单子叶植物上的局限性,目前,多数研究者倾向于使用基因 收稿日期:2001-03-26 作者简介:程焉平,(1954-),男,四平师范学院生物系副教授,从事遗传学教学。
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1 以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T—DNA是质粒上一段10—30kb 的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB，pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在V irD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质
转基因技术及其在植物育种中的应用 一、概述 从70年代重组DNA技术创建，到1983年第一株转基因烟草获得以来，国际上对转基因作物就存在着截然不同的观点：接受？抵制？随着技术日趋成熟，转基因作物由实验室进人大田中试，不少作物已向商品化发展。与此同时，转基因作物的生态风险，可能带来的环境问题、转基因产品作为食品对人体健康问题、产品贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界性的所谓“生物安全”的论战。转基因技术实际上已由学术观点分歧，发展到知识产权问题、环境问题、经济问题甚至政治问题 二、什么是转基因技术 转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。又名"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"。 三、几种常用的植物转基因方法 遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可分成两大类，第一类需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介导转化法、基因枪法；另一类方法不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中国科学家提出的。 1．农杆菌介导转化法 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研究。 2．花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由中国学者周光宇提出，中国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 3. 基因枪法 利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。 四、转基因植株的检测 标记基因(包括选择标记基因及报告基因)用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ， 100ml ，Agar (琼脂) 100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=。 2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-
第五章转基因植物 是指利用基因工程技术，在离体条件下，对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重载体转入受体中，并使其在体内表达的植物。 转基因植物通常具有高产优质、抗病虫、环境抗性、抗除草剂、耐储存、提高某些成分的含量等优良性状。 第一节植物转基因技术 一、植物细胞培养技术 植物组织培养的重要理论基础是植物细胞的全能性。植物细胞全能性(totipotency)，就是植物体细胞或性细胞，在人为控制的培养条件下都具有再生成新个体的潜能，因而在适宜的条件下可以被诱导生长分化形成完整植株。 二、植物转基因技术的基本路线 1.目的基因的分离 2.载体构建 3.导入细菌并利用细菌繁殖扩增重组DNA 4.对植物组织或细胞进行转化 5.植株再生 6.转基因植株的鉴定 7.转基因植株的种植 三、转基因的受体系统 1．植物组织受体系统： 受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞，并形成愈伤组织。愈伤组织可以培养成完整的转化植株。该受体系统转化率高，可获得较多的转化植株，取材广泛、适用性广。但再生植株无性系变异较大，转化的外源基因稳定性差，嵌合体多。 2．原生质体受体系统： 是植物细胞除去细胞壁后的部分，是一个质膜包围的“裸露细胞”。原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作，互相之间可以发生细胞融合，而且还可以直接高效的捕获外源基因，嵌合体少。但缺点是遗传稳定性差，培养周期长，难度大，再生频率低。 3．生殖细胞受体系统： 它是以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。目前主要以两条途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养，诱导愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。由于该受体系统与其它受体系统相比有许多优点，如：具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果；利用植物自身的受粉过程，具有操作方法方便、简单。不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制；只能在短暂的开花期进行，且无性繁殖的植物不能采用。 4.叶绿体转化系统 外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达，而且还具有许多优点： （1）便于外源基因定位整合 （2）基因为多拷贝，表达量高 （3）导入的外源基因性状稳定性高 （4）能直接表达原核基因 四、外源基因导入植物的方法 （一）DNA直接转移法 1.化学刺激法 植物原生质体借助一些化学试剂（如PEG、氯化钙等）的诱导能吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。 此法对细胞伤害少，可避免嵌合体产生，易于选择转化体，受体细胞不受种类限制。 2.电击法 首先是将原生质体在溶液中与DNA混合，利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，这对于那些难以从原生质体再生植株的植物或许有更大意义。 3.显微注射法
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2013, 48 (1): 10–22, https://www.doczj.com/doc/532778060.html, doi: 10.3724/SP .J.1259.2013.00010 —————————————————— 收稿日期: 2013-01-03; 接受日期: 2013-01-09 基金项目: 转基因专项(No.2008ZX08001-004) E-mail: ccchu@https://www.doczj.com/doc/532778060.html, 转基因生物技术育种: 机遇还是挑战？ 储成才 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101 摘要 转基因生物技术是一项全新的育种技术, 也是当前国际上进展最快、竞争最激烈的研究领域之一。自20世纪90年代生物技术育种诞生以来, 转基因作物的商品化应用及由此引发的一系列问题就引起公众的广泛关注。该文就世界上转基因生物技术育种及产业化现状、几个主要转基因作物安全性案例及最终结果, 以及如何科学推进我国转基因作物的产业化等提出了自己的思考, 以期帮助公众科学地理解和面对转基因生物技术所带来的育种技术上的革命。 关键词 作物, 转基因作物, 生物技术育种, 商业化, 生物安全 储成才 (2013). 转基因生物技术育种: 机遇还是挑战? 植物学报 48, 10–22. 矮秆育种的推广和杂交水稻技术的应用, 使我国粮食产量从20世纪60年代中期到90年代中期连续30多年稳步提高。然而近10多年徘徊不前的粮食单产表明, 传统的育种技术已难以承载我国未来粮食安全面临的巨大挑战。我国人口的不断增长和人民生活质量的不断提高、可用耕地和水资源的日益紧缺、生物及自然灾害的频繁发生、生态环境压力的持续加大以及农业生产劳动力数量的急剧下降等国情都时时警醒我们, 中国已进入更加依靠科技创新以保障粮食供给、促进现代农业可持续发展的历史新阶段。诞生于20世纪80年代的转基因技术经过短短30年的发展, 已成为新的科技革命的主体之一, 相关研究的进展和突破也大大加速了农作物更新换代的速度及种植业结构的变革, 转基因技术因此也被认为是继工业革命、计算机革命后的第3次技术革命(Abelson, 1998), 正推动生物经济的形成: 一个基因一个产业, 一项技术一项产业。正因为如此, 美国、德国、瑞士等发达国家以及大型跨国公司如孟山都(Monsanto)、杜邦-先锋(DuPont Pioneer)、先正达(Syngenta)、拜耳(Bayer)及巴斯夫(BASF)等投巨资开展新基因的挖掘、转基因技术研发以及水稻(Oryza sativa )、玉米(Zea mays )、大豆(Glycine max )等基因组学研究, 目的就是取得并控制基因及相关技术的知识产权。一些发展中国家更是抓住生物技术发展的良好机遇大力 发展转基因育种产业。因而, 农业生物技术已成为国际科技竞争乃至经济竞争的重点, 同时也被认为是发展中国家赶超世界科技前沿难得的突破口。 1 转基因技术是发展最为迅速的农业生 物育种技术 转基因技术是通过将人工分离和修饰过的基因导入生物体基因组中, 借助导入基因的表达, 引起生物体性状可遗传变化的一项技术。1983年, 几个实验室几乎同时通过农杆菌方法成功获得转外源基因植物(Bevan et al., 1983; Fraley et al., 1983; Herrera- Estrella et al., 1983; Murai et al., 1983)。到1987年, 短短4年时间, 第1例抗虫转基因番茄(Solanum lyco- persicum )就在美国进行了田间实验。1994年美国农业部(USDA)和美国食品与药品管理局(FDA)批准了第1例转基因作物——延熟保鲜转基因番茄进入市场。1996年, 全球转基因作物种植面积达到160万公顷。在随后的十几年中, 转基因技术的应用得到了迅速发展, 已成为近代育种史上发展最快、效率最高的作物改良技术。2011年, 全球转基因作物种植面积已超过1.6亿公顷, 比1996年增加94倍, 16年累积种植面积为12.5亿公顷。按种植面积计算, 全球75%的大豆、82%的棉花(Gossypium hirsutum )、32% 的玉米