淀粉酶类的生产
淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉（包括糖原，糊精）中糖苷键水解的一类酶的统称。它是研究较多，生产最早，产量最大和应用最广泛的一种酶。几乎占整个总产量的50％以上。根据淀粉酶对淀粉的作用方式不同，淀粉酶可分为四种主要类型，即a-淀粉酶，β-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。此外，还有一些应用不是很广泛，生产量不大的淀粉酶，如环状糊精生成酶，及α-葡萄糖苷酶等。
表5—1 淀粉酶的分类
E.C编号系统名称常用名作用特性存在
E.C.
3.2.1.1 α-1，4葡聚糖-
4-葡聚糖水解酶
α-淀粉酶，液化
酶，淀粉-1，4-
糊精酶，内断型
淀粉酶
不规则地分解淀粉
糖原类物质的α-1
4糖苷键
唾液，胰脏，麦芽，
霉菌，细菌
E.C.
3.2.1.2α-1，4葡聚糖-
4-麦芽糖水解酶
Β-淀粉酶，淀粉
-1，4-麦芽糖苷
酶，外断型淀粉
酶
从非还原性末端
以麦芽糖为单位
顺次分解淀粉，
糖原类物质的α
-1，4糖苷键
甘薯，大豆，大
麦，麦芽等高等
植物以及细菌等
微生物
E.C.
3.2.1.3α-1，4葡聚糖葡
萄糖水解酶
糖化型淀粉酶，
糖化酶，葡萄糖
淀粉酶，淀粉-1，
4-葡萄糖苷酶，
淀粉葡萄糖苷酶
从非还原性末端
以葡萄糖为单位
顺次分解淀粉，
糖元类物质的α
-1，4糖苷键
霉菌，细菌，酵
母等
E.C.
3.2.1.9支链淀粉6-葡聚
糖水解酶
异淀粉酶，淀粉
-1，6-糊精酶，
R-酶，茁酶多糖
酶，脱支酶
分解支链淀粉，
糖元类物质的α
-1，6糖苷键
植物，酵母，细
菌
淀粉酶的种类不同，对直链淀粉和支链淀粉的作用方式也不一样。各种不同的淀粉酶对淀粉的作用有各自的专一性。
淀粉是自然界中分布极广的碳水化合物，它是由葡萄糖基相连接聚合而成的，根据连接方式不同一般可将其分为直链淀粉和支链淀粉两种。直链淀粉的葡萄糖基几乎都是以α-1，4键相互连接成的直连，聚合度为100—6000个葡萄糖单位不等，最近研究认为直链淀粉分子中也有极少量的分枝结构存在。支链淀粉则较复杂，除有较多的α-1，4键连接外，还在分子内有α-1，6键连接成树枝状，聚合度也比直链淀粉高。
表5—2 常见淀粉中直链与支链淀粉含量
淀粉品种直链淀粉/％支链淀粉/％
玉米27 73
马铃薯23 77
甘薯20 80
木薯17 83
大米17 83
糯玉米0 100
糯高粱0 100
糯米0 100
5.1α-淀粉酶的生产
α-淀粉酶作用于淀粉时，可以随机的方式从分子内部切开α-1,4葡萄糖苷键而生成糊精和还原糖。其水解位于中间的α-1,4键的概率比水解位于分子末端的概率大，不能水解支链淀粉的α-1,6键，也不能水街紧靠1,6分支点的-α-1,4键，不能水解麦芽糖，但可以水解含有3个或3个以上α-1,4糖苷键的低聚糖。由于水解产物的还原性末端葡萄糖残基C1碳原子为α构型，故称α-淀粉酶。
目前，国内外生产α-淀粉酶所采用的菌种主要有细菌和霉菌两大类，典型的与芽孢杆菌和米曲霉。米曲霉常用固态曲法培养，其产品主要用作消化剂，产量较小，芽孢杆菌则主要采用液体深层通风培养法大规模地生产α-淀粉酶，如我国的枯草杆菌BF—7658.
5.1.1α-淀粉酶的性质
几种微生物α-淀粉酶的性质见表5—3
表5—3 各种α-淀粉酶的性质
作用机制
酶来源———————————耐热性/℃pH稳定性适宜Ca2+的保护作用淀粉分解限度/％主要水解产物（15min）（30℃，24h pH
枯草杆菌糊精，麦芽糖
（液化型）35 （30％）葡萄糖6％65~80 4.8~10.6 5.4~6.0 +
枯草杆菌
（糖化型）70 葡萄糖（41％）
麦芽糖（58％）
麦芽三糖，糊精55~70 4.0~9.0 4.8~5.2 —
枯草杆菌
（耐热型）35 糊精，麦芽糖，
葡萄糖75~90 5.0 +
米曲霉48 麦芽糖（50％）55~70 4.7~9.5 4.9~5.2 +
黑曲霉48 麦芽糖（50％）55~70 4.7~9.5 4.9~5.2 +
黑曲霉
（耐酸性）麦芽糖（50％）55~70 1.8~6.5 4.0 +
根霉48 麦芽糖（50％50~60 5.4~7.0 3.6 ————————————————————————————————————————
1.pH对酶活性的影响
一般α-淀粉酶在pH5.5~8稳定，pH4以下易失活，酶活性的最适pH5~6，即在此pH条件下酶的催化反应速度最快，另外酶的催化活性和酶的稳定性是有区别的，前者指酶催化反应速度的快慢，活性高反应速度快，反之则反应速度慢，而后者表示酶具有催化活性而不失活。酶最稳定的pH不一定是酶活性的最适pH，反之，酶活性的最适pH不一定使酶最稳定。在霉菌中，黑曲菌α-淀粉酶耐酸性强，黑曲霉NRRL330α-淀粉酶的最适pH为 4.0，在pH2.5,40℃处理30min尚不失活，然而在pH7.0时，55℃处理15min，几乎没有损失，而在pH2.5处理则完全失活。
枯草杆菌α-淀粉酶作用的最适pH为5~7.嗜碱细菌中存在着最适pH为4.0~11.0的α-淀粉酶。嗜碱性芽孢杆菌NRRLB3881α-淀粉酶的最适pH9.2~10.5，嗜碱性假单胞杆菌α-淀粉酶的最适pH为10.。各种不同的酶的最适pH可以通过实验测定，由于最适pH受底物种类。浓度，缓冲液成分，温度和时间等因素的影响，测定时必须控制一定的条件，条件可以改变可能会影响最适pH。
2.温度对酶活性的影响
温度对酶活性有很大的影响。纯化的α-淀粉酶在50℃以上容易失活，但是有大量Ca2+存在下，酶的热稳定性增加。芽孢杆菌的α-淀粉酶耐热性增加。芽孢杆菌的α-淀粉酶耐热性较强。枯草杆菌α-淀粉酶在65℃稳定。嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的α-淀粉酶的热稳定性更强，前者经85℃处理20min，尚残存酶活70％，后者在Ca2+存在下，90℃时的半衰期长达90min。有点嗜热芽孢杆菌的α-淀粉酶在110℃仍能液化淀粉。地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶其热稳定性不依赖Ca2+，可在EDTA存在下测定酶活，以区别于非耐热性α-淀粉酶。霉菌α-淀粉的耐热性较低，黑曲霉耐酸性α-淀粉酶的耐热性比其非耐热性α-淀粉酶为高，在pH4，55℃加热24h也不失活。然而拟内孢霉α-淀粉酶在40℃以下也很不稳定。
α-淀粉酶在各种酶中是耐热性较好的酶，其耐热程度一般是按动物α-淀粉酶，麦芽α-淀粉酶，丝状菌α-淀粉酶，细菌α-淀粉酶的顺序而增强。曾对各种α-淀粉酶粗制剂的水溶液进行加热处理，每分钟升高1.5℃，直至80℃，发现各种酶的残留活性是：真菌来源的为1％，谷物来源的为25％，细菌来源的为92％。α淀粉酶的耐热性还受底物的影响，在高浓度的淀粉浆中，最适温度为70℃的枯草杆菌α-淀粉酶，在85—90℃时的活性最高。
3.钙与α-淀粉酶活性的关系
α-淀粉酶是单成分酶，大多数α-淀粉酶活性需要钙离子，钙离子对酶的稳定性起重要作用。Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性与稳定性。
钙和酶的结合牢度依次是：霉菌＞细菌＞哺乳动物＞植物。Ca2+对麦芽α-淀粉酶的保护作用最明显。枯草杆菌糖化型α-淀粉酶（BSA）同Ca2+的结合比液化型（BLA）更为紧密。向BSA中添加Ca2+对酶活性几乎不发生影响，单用EDTA处理也不能引起失活，只有在低pH（pH3.0）下用EDTA处理才能去除Ca2+，但若添加与EDTA当量的Ca2+，并将pH恢复至中性，则仍然可恢复它的活性。
除Ca2+外，其他二价碱土金属Sr2+，Ba2+，Mg2+等也有使无Ca2+的α-淀粉酶恢复活性的能力。枯草杆菌液化型α-淀粉酶（BLA）的耐热性因Ma+，C1-和底物淀粉的存在而提高，NaC1与Ca2+共存时对提高α-淀粉酶的耐热性的作用尤为显著。添加Ca2+有助于增加酶的热稳定性，但实际上淀粉中所含微量Ca2+已足够酶的充分活化所需。
5.1.3α-淀粉酶对底物的水解作用
1.α-淀粉酶的水解方式
电费是由葡萄糖单位组成的大分子。它与水在催化剂的作用下生成较小的糊精，低聚糖，直至最小构成单位——葡萄糖，这个过程称为淀粉的水解。淀粉的水解可用酸或淀粉酶作为催化剂。酶水解具有较强的专一性，不同的酶作用于不同的键，如α-淀粉酶从淀粉分子内部随机切割α-1，4键，但不能水解α-1,6键，α-1,3键，甚至不能水解紧靠分支点的α-1,4键。同时，酶催化反应具有条件温和，设备简单，副反应极少等优点。而酸水解没有专一性，同时可以水解α-1,4键，α-1,6键及α-1,3键等。另外，淀粉通过水解反应的葡萄糖，受酸和热的作用，一部分又发生复合反应和水解反应，影响葡萄糖的产率，增加糖化液精致的苦难。
α-淀粉酶对于直链淀粉的作用第一步是将直链淀粉任意的迅速降解成小分子糊精，麦芽糖和麦芽三糖，第二部缓慢地将第一步生成的低聚糖水解为葡萄糖和麦芽糖。由于α-淀粉酶不能切开支链淀粉分支点的α-1,6键，也不能切开α-1，6键附近的α-1,4键，但能越过分支点而切开内部的α-1,4键，因此水解产物中出了含有葡萄糖，麦芽糖意外，还残留一系列具有α-1,6键的极限糊精，和含4个或者更多葡萄糖残基的带α-1,6键的低聚糖。表5-5是枯草杆菌α-淀粉的水解产物分布，表中数据位不同聚合度的低聚糖占总糖分的百分率，不同来源的α-淀粉酶，水解产物存在差别。
表5-5 枯草杆菌α-淀粉酶的水解淀粉产物分布单位：％
直链淀粉支链淀粉
水解产物——————————————————————————————60min 180min 60min 180min
G1 2.3 5.3 1.4 3.3
G2 10.1 12.3 5.5 8.3
G3 12.8 22.0 8.2 10.8
G4 6.0 10.5 0.9 2.5
G5 10.2 14.8 4.9 6.7
G6 20.6 30.1 14.0 26.8
G7 14.7 5.1 9.8 9.2
高分子物质23.3 0 55.3 32.4
注：G1，G2…..表示葡萄糖聚合度。
2.α-淀粉酶的水解极限
当α-淀粉酶作用于淀粉时，随着反应的进行，溶液黏度逐渐下降而还原力逐渐增加。由于底物浓度减少，产物浓度增加，酶可能部分失活，最后导致反应速度降低，直至还原力不在增加，此时的水解率称为“水解极限”。不同来源的α-淀粉酶，水解极限各部相同，一般α-淀粉酶水解率为40％~50％，但黑曲霉ATCC15475的水解率可达95％~100％，拟内孢霉α-淀粉酶水解率可达90％，其产物均是葡萄糖。枯草杆菌糖化型α淀粉酶作用于可溶性淀粉时，水解率达70％以上，而淀粉液化芽孢杆菌所产液化型α-淀粉酶的水解率只有30％。
假定直链淀粉被彻底水解，即水解极限为100％，则成成13份葡萄糖及87份麦芽糖，而当具有4％分支的支链淀粉被彻底水解。则生成73份麦芽糖，19份葡萄糖和8份异麦芽糖。
5.1.4α-淀粉酶的工业生产
1.菌种
工业上大规模生产和应用的α-淀粉酶主要来自细菌和曲霉。芽孢杆菌所产α-淀粉酶分为液化型与糖化型两种。目前只有液化型酶有用，由于活性高，发酵周期短，酶的耐热性高，尤
其是枯草杆菌为大多数工厂所采用。我国淀粉糖工业使用的液化酶BF-7658，美国的Tenase 等属于这一种。地衣芽孢杆菌的酶耐热性比枯草杆菌为高，但产量较低。芽孢杆菌易于退化和遭受噬菌体感染而降低产酶能力。由微生物制备酶制剂，产酶量高，易于分离和精制，适于大量生产。当然亦能从植物和动物中提取α-淀粉酶，满足特殊的需要，但由于成本高，产量低，目前还不能实现工业化生产。具有使用价值的α-淀粉酶生产菌列于表5-6.
表5-6 常用的α-淀粉酶生产菌
枯草杆菌JD-32 马铃薯杆菌
枯草杆菌BF-7658 嗜热糖化芽孢杆菌
淀粉液化芽孢杆菌多黏芽孢杆菌
嗜热脂肪芽孢杆菌嗜碱假单胞菌
嗜热硬脂芽孢杆菌溶淀粉变种黑曲霉
淀粉糖化芽孢杆菌米曲霉
地衣形芽孢杆菌泡盛酒曲酶
由于不断的选育改良，现在工业生产上用的菌种产生α-淀粉酶的能力已是原始菌株的数倍乃至数十倍，例如淀粉液化芽孢杆菌ATCC23844的α-淀粉酶活性，每1mL已达456000U，地衣芽孢杆菌ATCC9789，用y射线，NTG，之外先单独或交叉处理7次后，其耐热性α-淀粉酶活性增加25倍，结合培养条件的改进而用于工业生产。紫外线处理肉桂色曲霉，耐酸性α-淀粉酶活性提高了6倍。我国生产菌株枯草杆菌BF7658-209，是由野生型菌株，经物理和化学方法交叉处理得到的变异株，其产酶活性比母株高5.0％。此外，用X射线也曾得到高产突变株。
连续使用同一诱变剂时，由于发生平顶效应（Plateau effect），诱变效果会随着处理次数而降低。此时必须更换诱变手段。在使用紫外线，y射线，快中子等为诱变剂处理米曲霉时，高剂量不一定有不利于高产变株的生成。近年来，利用转化法改良菌株，在枯草杆菌α-淀粉酶的生产菌上已取得可喜进展，例如α-淀粉酶活性高而耐热性差的枯草杆菌纳豆株的DNA 转入耐热性强而酶活低的枯草杆菌Marburg株中，结果引起了后者遗传性状的改变，其α-淀粉酶提高了14倍，蛋白酶活性提高了5倍，这个杂交种所产酶也具有亲株性能。但由于酶活性还不及生产菌株而尚未实用。又将生产菌的DNA转入枯草杆菌Marburg株，得到酶活性较高的转化株SP-38，又将SP-38DNA转入Marburg使酶活性有了进一步提高。
不同生态环境下分离的微生物，它的α-淀粉酶性质与其生长环境相适应，从温泉分离的一株耐热解淀粉假单胞杆菌，它的α-淀粉酶最适作用温度65~80℃。在55℃培养的嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，所产的α-淀粉酶在90℃下几乎不失活。分别在35℃与55℃培养凝结芽孢杆菌，所产α-淀粉酶的热稳定性55℃与43℃下培养嗜热脂肪芽孢杆菌，其α-淀粉酶的各种理化性质几乎无明显区别，此外，地衣芽孢杆菌虽在30℃培养，它的α-淀粉酶最适温度80~85℃，耐热性很强。
生产概要
霉菌的α-淀粉酶大多采用固体曲法生产，细菌α-淀粉酶则以液体深层发酵为主。
固体培养以麸皮为主要原料。酌量添加米糠或豆饼的碱水浸出液，以补充氮源。在相对湿度90％以上，芽孢杆菌用37℃，曲霉用32~35℃培养36~48h后，立即在40℃下烘干或风干，即成工业生产用的粗酶。
液体培养常以麸皮，玉米粉，豆饼粉，米糠，玉米浆等为原料，并适当补充硫酸铵，氯化铵，磷酸铵等无机氮源，此外还需添加少量镁盐，磷酸盐，钙盐等。固形物浓度一般为5％~6％，高者达15％，为了降低培养液黏度，淀粉原料可用α-淀粉酶液化，氮源可用豆饼碱水浸出液代替。以霉菌为生产菌时，宜采用微酸性，而细菌宜在中性至微碱性培养，培养温度霉菌32℃，细菌37℃，通风搅拌培养时间24~48h。当酶活达到高峰时结束发酵，离心或以硅藻
土作助滤剂滤去菌体及不溶物。在Ca2+存在下低温真空浓缩后，加入防腐剂（松油，麝香草粉，苯甲酸钠等），稳定剂（5％~15％食盐和钙盐，锌盐或山梨醇）以及缓冲剂后就成为成品。为了提高它的耐热性，也可在成品中添加少来硼酸盐。这种液体的细菌α-淀粉酶呈暗褐色，带不快之臭味，在室温下可放置数月而不失活。
为了制备高活性的α-淀粉酶，并使贮运方便，可用硫酸铵盐析或溶剂沉淀制成粉状酶制剂。在由Ca2+存在下降浓缩发酵液调节pH到6左右，加入40％左右硫酸铵静置沉淀，倾去大部分清液后，加入硅藻土助滤剂，收集沉淀于40℃以下风干，为了加速干燥，减少失活，酶泥中可拌入大量硫酸钠，磨粉后加入淀粉，乳糖，CaCl2等作稳定填充剂后即成为成品。麸曲可以用水抽提出进行盐析。为了减少色素的溶出，麸曲必须进行风干抽提液中如色素较多，可用CaCl2和NaHPO4形成不溶性沉淀而吸附除去。溶剂（酒精，丙酮等）沉淀时，为减少酶的变性，宜在低温下（15℃左右）操作，在由CaC
L2，乳糖，糊精等存在下，加入冷却的溶剂至最终浓度70％，收集沉淀用无水酒精脱水，40℃以下烘干。
有些菌株产生一定比例的蛋白酶，这样不但妨碍使用效果，还会引起α-淀粉酶在贮藏过程中失活，夹杂的蛋白酶量越大，失活就越严重。培养基中添加柠檬酸盐可抑制某些菌株产生蛋白酶，枯草杆菌发酵液中伴生的蛋白酶可可借加热50-60℃处理而消除。此外细菌α-淀粉酶尚可利用底物淀粉吸附，而同蛋白酶分开。为了提高淀粉的吸附效果，淀粉可以膨胀处理。淀粉吸附法的主要步骤如下：调节酶液的pH到6.0，加18％硫酸铵搅匀，并以玉米淀粉与硅藻土的5:1的混合物分散在18％硫酸铵溶液中，倒于漏斗上形成底层，再讲上述酶液通过滤层用15％硫酸铵液洗涤后，用含0.001mol/L CaCl2的0.04mol/L磷酸缓冲液洗脱，经DuoliteA-2树脂脱色，再用40％硫酸铵盐析或60％丙酮沉淀，这样可以制备纯度极高的产品。
3，影响α-淀粉酶生产的因素
1）固体培养
以麸皮为主要原料时，添加少量豆饼或豆饼的碱水浸出液等有机氮源对产酶有益。原料洒水以1:1:2为宜。枯草杆菌要求洒水率比霉菌稍高。固体培养时，培养基的碳氮比生产酶影响不如液体培养时明显，培养枯草杆菌时，培养基的初pH以杀菌后6.3~6.4为宜。如果适当添加米糠，保持初pH6.0~6.5可使产酶稳定。
生产α-淀粉酶的最适温度范围比较小，在整个培养过程中，品温不能有7~8℃只差。最适温度为37℃的枯草杆菌，品温达45℃时，产酶就降低。
2）液体深层培养
（1）碳源的诱导及阻遏微生物生产的α-淀粉酶可以说是半组成酶，因为大多数工业生产的淀粉酶菌种，例如淀粉也化芽孢杆菌，枯草杆菌168，地衣形芽孢杆菌以及米曲霉等，即使培养基中不含淀粉或者不含具有α-1,4键的多糖或低聚糖，仍然可以生成α-淀粉酶，但是它们的产量可收到淀粉或其他α-1,4麦芽寡糖的诱导而增加。（2）福本指出，在液体静止培养下各种碳源对淀粉也化芽孢杆菌的效果依次是：可溶性淀粉＞麦芽糖＞甘露醇＞阿拉伯糖＞葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞半乳糖＞木糖。对枯草杆菌BF-7658研究，得到类似结果（表5-7）。豆饼浸出液为氮源时，淀粉液化芽孢杆菌的最佳碳源依次是乳糖，半乳糖，淀粉，麦芽糖。用在葡萄糖与氨构成的合成培养基中，乳糖仍最适合于菌体生长，糊精则完全无效，但琥珀酸，延胡索酸几乎与可溶性淀粉一样有效，葡萄糖，果糖，蔗糖等在高浓度时抑制α——淀粉酶的生成。
表5-7 枯草杆菌BF-7658对各种碳源的利用
碳源终pH 酶活性/（U/ml）初浓度/％残糖量/％糖利用率/％可溶性段百分比（C.P.）7.5 41 3.88 1.56 59.7
糊精（实验试剂）7.5 38 4.16 2.31 44.3
蔗糖（C.P。）7.0 11
麦芽糖（C.P.）7.5 44 3.75 0.91 75.8
乳糖（C.P.）7.0 21 3.65 1.37 62.1
半乳糖（C.P.）7.0 19
葡萄糖（A.P.）7.0 14 3.56 0.97 72.8
木糖（C.P.） 4.13 4.0
-*容易利用的碳源，例如葡萄糖，果糖，蔗糖等只能促进细胞的呼吸与生长，而不利用α-淀粉酶生产，代谢愈快的糖对α-淀粉酶生产的抑制越严重，但是一些作为能源利用性很差的糖类，像糖原，乳糖，半乳糖，棉子糖等却能促进α-淀粉酶的合成，乳糖对芽孢杆菌NRRLB3881生产碱性淀粉酶却不适合。
麦芽糖与淀粉，糖原一样对米曲霉生产α淀粉酶有促进作用，麦芽四糖对嗜热脂肪芽孢杆菌，地衣形芽孢杆菌，异麦芽糖对米曲霉，麦芽糖对嗜热芽孢杆菌碱性α-淀粉酶生产的诱导作用最强。
碳源种类与α淀粉酶及胞内核糖核酸的形成有着密切关系。当核糖与淀粉共存时，α-淀粉酶的产量比单独用淀粉时高一倍。
葡萄糖等易利用碳源，在浓度高时，妨碍α-淀粉酶的生成，这是一种分解代谢物阻遏。它在α-淀粉酶的生物合成上起着一种调节作用。Schaeffer（1969）认为枯草杆菌的α-淀粉酶生产受到分解大写唔阻遏的控制。Mers等（1972）报道地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的生产可受到葡萄糖或其他低相对分子质量可代谢糖的抑制，但是Coleman报道，淀粉液化芽孢杆菌生长培养物中添加葡萄糖，并不引起对淀粉酶合成的分解代谢阻遏。Meyrath等报道，葡萄糖等易利用的糖，在浓度高时，对米曲霉α-淀粉酶的阻遏作用只发生在生长的早期。
为了提高α-淀粉酶的产量，避免分解代谢物的阻遏，除选育康分解代谢的变异菌株外，就是采用代谢慢慢的碳源，例如乳糖，乳清。但大多数工厂使用淀粉为碳源，这不仅可避免分解代谢物阻遏，还具有诱导作用。为了降低培养基的黏度，杀菌时旺旺添加α-淀粉酶液化，在液化过程中生成的葡萄糖，仍有造成阻遏的可能，因此将碳源采取流加法加入，是促进产酶的好办法。
（2-）氮源福本以淀粉为氮源，培养液化淀粉芽孢杆菌时，白蛋白，酪蛋白，大豆饼碱水抽提液，据蛋白胨为较优氮源。玉米浆与其他蛋白质并用时也是良好氮源。以酪蛋白的酸或碱水解物作氮源时，产酶不及酪蛋白本身。各种氨基酸与酪蛋白的酶水解物有利于α-淀粉酶的生成，谷氨酸促进黑曲霉α-淀粉酶的生成。
氮源时细胞合成α-淀粉酶的原料，香淀粉液化芽孢杆菌洗涤细胞用时添加碳源与氨基酸时，一些氨基酸比氨的效果好，一些氨基酸则逊于氨，另一些氨基酸则起抑制作用，混合氨基酸的效果比单一氨基酸好，天冬酰氨对生产α-淀粉酶有效，而甘氨酸由抑制。甘氨酸的抑制作用能用丙氨酸，蛋氨酸与谷氨酸接触。
酪蛋白，豆饼的热，碱水抽出物是工业上最优良的氮源。基槽废液是黑曲霉NRRL330α-淀粉酶生产的一种最好的氮源，以5％玉米粉加7°Be酒糟水，α-淀粉酶产量最高。
硝酸钠，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，醋酸铵及尿素等无机氮均可在不同程度上增加α-淀粉酶的产量，但大多喜用硝酸钠。黑曲霉NRRL330以8％的甘薯为碳源，并添加0.3％NaNO3，α-淀粉酶活性可增加10倍。用Minoda培养基（淀粉2％，麸皮4％，（NH4）2SO4 0.2％，KH2PO4 0.1％，CaCO3 2.0％）培养黑曲霉时，其耐酸性α-淀粉酶较用其他培养基时高2倍。若在添加NaNO3，则酶活性可增加3倍。NH4NO3与NH4Cl对黄曲霉生产α-淀粉酶的效果比有机氮好，NH4NO3亦是米曲霉的最佳氮源。培养液pH应保持在最适pH范围。用米曲霉生产淀粉酶时，以硫酸铵为氮源。培养液pH应保持在最适pH范围。用米曲霉生产淀粉酶时，以硫酸铵为氮源。培养液pH应保持在最适pH范围。用米曲霉生产淀粉酶时，以硫酸铵为氮源，若同时添加醋酸钠，则其浓度虽高达1.6％，发酵液的pH仍能维持在最适状态。
（3）碳氮比黑曲霉NRRL330生物合成α-淀粉酶与糖化酶时，碳氮比与产煤量之间并无一定规律。且培养液的终pH也同碳氮比无关。
以玉米与豆饼为碳氮源时，两者比例改变，对于枯草杆菌BF-7658与TUD-127生物合成α-淀粉酶由明显影响，总固形物13％~14％。以上，玉米与豆饼之比以（8~9）：5为宜。（4）无机盐α-淀粉酶活性的表现需要Ca2+，但在工业原料本身所含有的Ca2+已能够满足生长与产酶的需要，一般不需另外不加。发酵中途补加CaCl2稍稍有利于枯草杆菌TUD 产酶及残糖分的降低。添加柠檬酸盐可一直枯草杆菌BS1968产生蛋白酶而不妨碍α-淀粉酶的生产。
磷酸盐无论对细菌和霉菌的α-淀粉酶的生产都很重要。在以甘薯8％，硝酸钠0.3％构成的培养基中，培养黑曲霉NRRL330，添加K2HPO4，α-淀粉酶活性比对照高3倍（5—8）。
表5-8磷酸盐对α-淀粉酶生产的影响
磷酸盐量/％最终pH α-淀粉酶活性*
对照 4.25 120
K2HPO4 0.2 5.45 30
KH2PO4 0.2 4.60 75
*以碘反应消失所需要时间（ｍｉｎ）表示
磷酸盐的浓度与细胞内α-淀粉酶浓度有关，在低磷培养基中生长的米曲霉，α-淀粉酶几乎全存与细胞内，增加培养基中磷盐酸含量，可延长菌体生长期而促进α淀粉酶的生产。Meyrath用米曲霉生产α-淀粉酶时，培养基中磷盐浓度达4.6％~4.7％。高浓度的磷酸盐，其作用是造成一个高渗压的环境，这与添加1％NaCl或2％Na2SO4（或K2SO4）之所以能提高霉菌α-淀粉酶的产量，道理相同。
金属微量元素例如Mn2+，Zn2+，Fe2+，Na+由刺激产酶的作用，但工业原料中这些元素并不缺乏。米曲霉的合成培养基中，加入混合微量元素，可促进菌丝体生长，而降低α-淀粉酶的产量，培养基中缺少Cu2+时有利于α-淀粉酶的产量，道理相同。
金属微量元素例如Mn2+，Zn2+，Fe2+，Na2+有刺激产酶的作用，但工业原料中这些元素并不缺乏。米曲霉的合成培养基中，加入混合微量元素，可促进菌丝体生长，而降低α-淀粉酶的产量，培养基中缺少Cu2+时有利于α-淀粉酶的生成
（5）生长期与α-淀粉酶的生产α-淀粉酶的产生与芽孢的形成无直接关系。发酵过程中一些菌株的α-淀粉酶活性在菌体生长达最大值时最高。有一些菌株，对分解代谢物阻遏很敏感，在可利用糖未耗尽和达到生长静止期之前，不会大量形成α-淀粉酶。在工业上，用
粗原料生产时，α-淀粉酶在静止期内大量形成，酶的活性随菌体自溶而增加。枯草杆菌BF-7658α-淀粉酶的活性，在对死亡期最高。
（6）温度对产酶的影响枯草柑菌一般在35~37℃下培养为合适。芽孢杆菌生产α-淀粉酶的最适温度范围很小，在35℃与37.5℃下静止培养淀粉液化芽孢杆菌，α-淀粉酶的产量有明显的差别，35℃下培养的远比37。5℃为好。但是在摇瓶培养下，两种培养温度的最终产酶活性无明显区别。
液化深层培养与固体培养对温度的敏感性不同，液体培养时，一旦温度升到40℃以上，对产酶就不利。
BF-7658静止培养时，37℃的α-淀粉酶到达高峰时间比35℃的要短24h，而用30℃培养则酶活性仅为前者的一半。
霉菌液体深层培养生产，淀粉酶的最适温度较低，一般在30℃左右。降低后期培养温度，有利于黑曲霉耐酸性α-淀粉酶的生产。
（7）pH对产酶的影响福本报道，用淀粉乳酸铵，磷酸盐培养基培养产淀粉液化酶的芽孢杆菌时，最适pH范围在6.8~7.2，而用洗涤细胞做试验时，其最适pH在6.2~6.5，pH超过7.0时，α-淀粉酶生成量明显较低。枯草杆菌BF-7658以豆饼麸皮培养基发酵时，最适pH5.5~6.5，超过此范围，酶活基低。谷草杆菌TUD-127以玉米和豆饼粉为原料，最适pH 范围很宽，为5.5~8.0，以6~7.5最佳。
用曲霉素生产α-淀粉酶时，培养基原始pH以中性为佳。但最适pH也因培养基组成与浓度而异，碳源浓度高时，采用微碱性最佳。培养基PH越低，黑曲霉生产的α-淀粉酶抗酸性越强。山田等指出黑曲霉产生耐酸性α-淀粉酶的最适PH为4.0，若使培养初期PH为4.0，后期将PH升至5.5，并将温度有28℃降到20℃，可的最高产量。黑曲霉NRRL-337固体培养时，耐酸性α-淀粉酶在较低的温度（25℃）和酸性环境下形成，摇瓶培养时，最适PH4.0.耐酸性α-淀粉酶的出现迟于非耐酸性α-淀粉酶和糖化酶。当培养基中添加CaCO3时，则大量生成耐酸性α-淀粉酶，但降低培养基PH并不算黑曲霉NRRL330生产耐酸性α-淀粉酶所必需的。
培养过程的H也可借培养成分来调节。Mevrath认为用米曲霉产生α-淀粉酶时，如以醋酸铵作氮源，可使培养过程中的PH升高或保持中性，硝酸盐与蛋白质也有类似作用。醋酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐等有机酸的盐类，具有调节PH的功用，其用量视所用的碳氮源而异，在5-15g/L范围内。例如初PH为6.8，氮源是1.6%硫酸铵，由于同时添加了醋酸钠（或钾），在培养过程中随着菌体生长，PH逐渐上升，到静止期、自溶期以后能将PH保持8.3.培养基PH也可以通过补充养料来调节，枯草杆菌BF7658在产酶期间，多次补加培养基能将PH 保持在6.3-6.6，而促进产酶。
（8）其他因素影响α-淀粉酶产量的其他因素还很多，例如深层培养中的通风量、搅拌强度、接种量、种龄等。
工业上生产α-淀粉酶的微生物都是好气性菌。用深层培养时，在一定培养基中，酶的生产量主要为通风搅拌所左右。很早就发现，用500ML三角瓶装不同量培养基，摇瓶培养淀粉液化芽孢杆菌，当装液量为200ML时，它的α-淀粉酶生成量只及40mL时的1/5.使用玉米、豆饼培养基（总固体物11%-12%），摇瓶培养BF-7658和TUD-127的结果同样表明，通风量能够影响α-淀粉酶的合成。用500mL发酵罐试验，在搅拌185r/min下培养枯草杆菌BF-7658，通风量由1:0.53VVm降到0.34VVm时，α-淀粉酶活性降低1/2。培养时降低前期通风量，则促进米曲霉生长而减少产酶。枯草杆菌在对数期末，降低通风量，确可促进α-淀粉酶生产。CO2对细胞增殖与产酶有影响，当通入空气含有CO2 8%时，枯草杆菌α-淀粉酶活性可增加3倍。
在固体培养时，气体的交换比较差，但α-淀粉酶的产量并不低。
芽孢杆菌以使用对数生长期的种子最适合，接种量为发酵液量0.2%-1%，对产酶无太大影响。
培养基的灭菌对产酶有影响。Meyrath的发现，糖与其他成分合并灭菌，由于生产焦糖，有利于霉菌α-淀粉酶生产。焦糖具有螯合微量重金元素的作用，能除去碍于产酶的微量金属，特别是铜离子。向培养基添加焦糖（0.2%）可使α-淀粉酶增产6%-10%。
培养基中添加植酸钙、赤霉素、单宁酸、乙醇、聚丙烯酸Carbopol以及Tween80、TritonX 和SDS等表面活性剂对产酶具有促进作用。用乳糖为碳源时，酶的产量比用淀粉的高1倍，而拟内孢霉的培养基中添加麻油等油脂，可提高产酶活性。
5、固体培养法生产α-淀粉酶
（1）固体培养枯草杆菌JD-32产生α-淀粉酶
菌种移植在豆饼3%、麸皮5%、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH7.1）斜面，35℃培养48h，在接种入种子培养基（豆饼粉1%、酵母膏、蛋白胨各0.4%、Nacl0.05%，PH7.1-7.2），35℃摇瓶培养一定时间后，用发酵罐扩大培养，然后按接种量0.5%接种入固体培养基（麸皮70g、小麦糠2g、木薯粉10g，烧碱0.5g混合物，加水使含水量60%左右，常压蒸汽一小时后，冷却到38-40℃），在厚层通风制曲箱内通风保持品温38-41℃下，培养20h左右出曲风干。
麸曲用1%食盐水3-4倍浸泡3h后过滤，调节滤液PH5.5-6，加10℃酒精使终浓度为70%沉淀酶，沉淀经离心，浓酒精洗涤脱水后，25℃下风干粉碎即为成品。
（2）固体培养米曲霉生产α-淀粉酶
我国现用的菌种属于米曲霉的曲霉602与2120，经鉴定认为不生产黄曲霉素，制法如下：500mL三角瓶，装麸皮5、玉米粉1混合物30g，加水1:1及盐酸3滴，拌匀后，120℃灭菌30min，冷却后接种斜面菌种（菌种培养于麦芽汁或曲汁斜面）置32-34℃下培养三天，没24h扣瓶一次以防结块，待菌丝体大量生长及孢子转为黄绿色，即可作为种子用于制备种曲。种曲配料同上，原料蒸熟后冷却到30℃，接种种子0.5-1%，拌匀后盛于曲盘，摊厚1cm 左右，盘上盖以湿布，置30℃曲房培养。盖布应每隔8-12h用水浸湿，以防培养物干结而影响菌种繁殖，没24h扣盘1次，经3天后，种曲成熟，布满黄绿色孢子。
厚层通风制曲：原料是麦麸、谷壳的比例为100:5，混合，加75%-80%稀盐酸（浓度0.1%），拌匀后，常压气蒸1h，扬凉后接入种曲0.5%，置曲箱中保持前期品温30℃左右，每两小时通风30min，当品温升到36℃以上，则连续通风，保持品温在34-36℃，约28h，品温开始下降，乃通冷风时使品温降至20℃左右后出箱。
提取方法：1、直接把麸曲在低温下烘干，作为酿造工业上使用的粗制酶制剂，特点是得率高，制造工艺简单，但酶活性单位低，含杂质较多；2、把麸皮用水或稀食盐水浸出后，经过过滤或离心除去麸皮或不溶物，然后用酒精沉淀或硫酸铵盐析，酶泥滤出后低温烘干，粉碎后加乳糖填料，最后制成供作助消化药，酿造等用的酶制剂。它的特点是酶活性单位高，含杂质少，但得率较低，成本较高。
耐高温α-淀粉酶的生产
普通的细菌α-淀粉酶在水解谷物淀粉时，由于液化温度只能在80-90℃，经常残留聚合度为30-40的不溶性淀粉，妨碍了过滤并影响下一步糖化的DE值。为此，在液化时须添加相当量的钙离子以提高酶的耐热性，并采用三段法进行液化。因此工艺发杂，而且产品中含有大量无机盐。耐热性α-淀粉酶适合于高温（105-110℃）下液化淀粉，不仅反应快，淀粉不易形成难溶性颗粒，且杂质容易过滤去除，液化淀粉一步即可完成，钙离子用量少，有利于糖化精制。
耐高温α-淀粉酶的生产工艺流程与枯草杆菌α-淀粉酶生产的流程相同。高温α-淀粉酶产品均是液体，国内外生产厂家有美国的Mils公司（产品Takahern）、荷兰的Gistg公司（产品Maaxamyl）、丹麦的NOVO公司（产品Thermamy 120）和我国无锡酶制剂厂。
（1）菌种耐高温α-淀粉酶产生菌几乎都是地衣芽孢杆菌及其突变菌株，主要原因是该菌株耐热性好和产酶活力高，因此适合于工业化生产。其他研究的菌株还
有嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌、凝结芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌和高温放线菌
等。
丹麦NOVO公司Outtrup等将地衣芽孢杆菌ATCC9798为出发菌株，经物理与
化学处理多次，使产酶活力提高20-30倍。上海微生物研究所胡学智等亦以
ATCC9798为出发菌株，相继用UV、Co60和DES等反复诱变选育，突变株
A4041产酶活力提高了100-200倍，该菌株具有无芽孢、利福霉素抗性、甲硫
氨酸缺陷型以及精氨酸缺陷型的标记，并部分解除了葡萄糖代谢阻遏，可在含
葡萄糖培养基中产生高温α-淀粉酶。日本丸尾等人以地衣芽孢杆菌NYK24为
出发菌株，采用NTG诱变，挑选环丝氨酸抗性突变菌株，产酶活力为2000u/mL。
（2）发酵几种耐高温α-淀粉酶产生菌的培养基和培养条件见表5-11
表5-11 国内外高温α-淀粉酶的培养条件
国名菌株培养基和培养条件/%
我国上海地衣芽孢杆菌A4041 玉米粉2.5、豆粉2.5、玉米浆1、CaCl20.4、
Na2HPO40.3、柠檬酸0.3、PH6.8-7.0，通风
0.5-0.8VVm，40℃培养96h（种子罐配方同发酵罐，
培养24h）
美国Mils公司地衣芽胞杆菌玉米粉、大豆粉、棉子粉、柠檬酸钠、CaCl2、K2HPO4、Therm340 玉米浆为原料，接种种龄40h，种量5%，通风
0.5VVm，中途补料，培养100h
（3）提取因为该产品为液体，提取方法较简便。
A4041的发酵液于PH4.5时加入1%碱式氯化铝为助凝剂，絮凝剂为0.1%壳聚糖，缓慢搅拌，使菌体。培养基杂质絮凝，压滤后得到清液，真空薄膜蒸发器或超滤浓缩10倍，加入食盐18%，以0.1%苯甲酸钠为稳定剂。酶收得率为70%-75%，在室温保存1年失活低于10%。作用温度90℃，最适ph为5.0-7.0。
Therm340的发酵液在15℃进行压滤，滤液在10℃以下超滤浓缩到50%，再在32℃真空蒸发浓缩到20%，然后在10℃以下精滤除菌，接着加入Na2S2O3、山梨酸钾。对羟基苯甲酸甲酯为防腐剂，以醋酸钙为稳定剂，制成液体酶产品。总收得率为72%。该液体酶最适PH5.5-7.0，最适温度90-95℃。应用时用量为颠簸量的0.04%-0.06%，作用温度在30%-40%淀粉浆时为90-100℃，液化20min,其DE值为14%-20%。
α-淀粉酶综述 佚名2013-10-06 摘要：α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用发展史、分离纯化及结构的研究史、催化机制及其研究史、工业化生产和应用现状与发展趋势等。 关键词：α-淀粉酶发现应用分离纯化结构催化机制研究史发展趋势 α- 淀粉酶( α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。 1 α-淀粉酶的发现和应用史 1.1 α-淀粉酶的发现 啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖。这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚，直到淀粉的发现。 在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff（1815年）做了一个巧妙的实验。他将4份的冷水加入到2份的淀粉中，并边加边搅拌。之后加入20份的沸水使其形成一层厚厚的淀粉糊。在淀粉糊还是余温的时候，加入被粉碎的麸质（或麦芽），然后在40－60°列式温度下水浴。1－2小时后发现，淀粉糊开始缓慢液化。8－10小时后，淀粉糊被转化为一种甜的溶液。之后，他将其通过过滤和蒸发浓缩得到了糖浆，品尝后发现，其和发酵液一样甜。在操作的过程中，他注明了实验过程中仅添加了非常少的麸质，并且得到的糖浆与淀粉的量成正比。此外，如果在加入麸质前加入几滴高浓度的硫磺酸，最终就没有糖生成。从这个实验中他得到结论1）麸质是一种能够使温水中的淀粉粉末转化为糖的物质。2）作为种子发芽的结果，相比种子内的物质而言，麸质能过将更多的淀粉转化为糖。至此,Kirchhoff奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。
产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。
淀粉酶生产 淀粉酶类的生产 淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉(包括糖原，糊精)中糖苷键水解的一类酶的统称。它是研究较多，生产最早，产量最大和应用最广泛的一种酶。几乎占整个总产量的50,以上。 根据淀粉酶对淀粉的作用方式不同，淀粉酶可分为四种主要类型，即a-淀粉酶，β-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。此外，还有一些应用不是很广泛，生产量不大的淀粉酶，如环状糊精生成酶，及α-葡萄糖苷酶等。 表5—1 淀粉酶的分类 常用名作用特性存在 E.C编号系统名称 不规则地分解淀粉唾液，胰脏，麦芽，α-1，4葡聚糖- α-淀粉酶，液化霉菌，细菌 E.C. 4-葡聚糖水解酶酶，淀粉-1， 4-糖原类物质的α-1 3.2.1.1 糊精酶，内断型4糖苷键 淀粉酶 E.C. α-1，4葡聚糖- Β-淀粉酶，淀粉从非还原性末端甘薯，大豆，大 3.2.1.2 4-麦芽糖水解酶 -1，4-麦芽糖苷以麦芽糖为单位麦，麦芽等高等 酶，外断型淀粉顺次分解淀粉，植物以及细菌等 酶糖原类物质的α微生物 -1，4糖苷键 E.C. α-1，4葡聚糖葡糖化型淀粉酶，从非还原性末端霉菌，细菌，酵 3.2.1.3 萄糖水解酶糖化酶，葡萄糖以葡萄糖为单位母等 淀粉酶，淀粉-1，顺次分解淀粉， 4-葡萄糖苷酶，糖元类物质的α
淀粉葡萄糖苷酶 -1，4糖苷键 E.C. 支链淀粉6-葡聚异淀粉酶，淀粉分解支链淀粉，植物，酵母，细 3.2.1.9 糖水解酶 -1，6-糊精酶，糖元类物质的α菌 R-酶，茁酶多糖-1，6糖苷键 酶，脱支酶 淀粉酶的种类不同，对直链淀粉和支链淀粉的作用方式也不一样。各种不同的淀粉酶对淀粉的作用有各自的专一性。 淀粉是自然界中分布极广的碳水化合物，它是由葡萄糖基相连接聚合而成的，根据连接方式不同一般可将其分为直链淀粉和支链淀粉两种。直链淀粉的葡萄糖基几乎都是以α-1，4键相互连接成的直连，聚合度为100—6000个葡萄糖单位不等，最近研究认为直链淀粉分子中也有极少量的分枝结构存在。支链淀粉则较复杂，除有较多的α-1，4键连接外，还在分子内有α-1，6键连接成树枝状，聚合度也比直链淀粉高。 表5—2 常见淀粉中直链与支链淀粉含量 淀粉品种直链淀粉/, 支链淀粉/, 玉米 27 73 马铃薯 23 77 甘薯 20 80 木薯 17 83 大米 17 83 糯玉米 0 100 糯高粱 0 100 糯米 0 100 5.1α-淀粉酶的生产 α-淀粉酶作用于淀粉时，可以随机的方式从分子内部切开α-1,4葡萄糖苷键而生成糊精和还原糖。其水解位于中间的α-1,4键的概率比水解位于分子末端的概率大，不能水解支链淀粉的α-1,6键，也不能水街紧靠1,6分支点的-α-1,4
Sy-5 探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用 酶：是活细胞产生的一类具有生物催化作用的有机物。酶的作用具有专一性。 一、实验原理 淀粉和蔗糖都是非还原糖。它们在酶的催化作用下都能水解成还原糖。还原糖能够与斐林试剂发生氧化还原反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。 用淀粉酶分别催化淀粉和蔗糖的水解反应，再用斐林试剂鉴定溶液中有无还原糖，就可以看出淀粉酶是否只能催化特定的化学反应。 证明酶的专一性。 二、目的要求 1.初步学会探索酶催化特定化学反应的方法。 2.探索淀粉酶是否只能催化特定的化学反应。 三、重点与难点 1.重点 ①初步学会探索酶催化特定化学反应的方法--探索酶的特性之一(酶的专一性)的方法。 ②探索淀粉酶是否只能催化淀粉的反应。 2.难点 ①学会探索实验的设计方法和探索方法。 ②让学生学会探索实验的方法，培养学生独立实验能力和创新思维能力。 四、材料用具 质量分数为2%的新鲜的淀粉酶溶液。 试管，大烧杯，量筒，滴管，温度计，试管夹，三脚架，石棉网，酒精灯，火柴。 质量分数为3%的可溶性淀粉溶液，质量分数为3%的蔗糖溶液，斐林试剂，热水。 五、方法步骤（录象观察） 1.取材 2.实验过程 3.结论 序号项目试管 1 2 1 注入可溶性淀粉溶液2mL \ 2 注入蔗糖溶液\ 2mL 3 注入新鲜的淀粉酶溶液2mL 2mL
结论: 1号试管中出现砖红色沉淀，2号管无颜色变化。淀粉酶只能把淀粉水解成麦芽糖，不能水解蔗糖。验证了酶的专一性。 (1)做好本实验的关键是蔗糖的纯度和新鲜程度。这是因为蔗糖是非还原性糖，如果其中混有少量的葡萄糖或果糖，或蔗糖放置久了受细菌作用部分分解成单糖，则与斐林试剂共热时能生成砖红色沉淀，使人产生错觉。为了确保实验的成功，实验之前应先检验一下蔗糖的纯度。普通的细粒蔗糖往往由于部分水解而具有一些还原糖。可用市售大块冰糖，水洗去其表面葡萄糖得到纯净的蔗糖。 (2)实验中要将试管的下半部浸到37℃的温水中，因为淀粉酶在适宜的温度条件下催化能力最强。 (3)在实验中，质量分数为3%的蔗糖溶液要现配现用(以免被细菌污染变质)，取唾液时一定要用清水漱口，以免食物残渣进入唾液中。 (4)制备的可溶性淀粉溶液，一定要完全冷却后才能使用，因为温度过高会使酶活性降低，甚至失去催化能力。 (5)实验中如果2号试管也产生了砖红色沉淀，可能的原因是: 蔗糖溶液放置的时间过长，蔗糖溶液中的微生物分解成还原性糖，从而影响实验效果。这时应临时配制蔗糖溶液。 另一个可能的原因是试管不干净，所以实验之前应将试管用清水再清洗一次，试管编号要醒目。 (6)实验步骤一定要按要求的程序进行，不可随意改变。 (7)如果实验中，自己的实验结果与理论上的预期结果不一致，应再设计实验，进行进一步的验证或找出问题所在。 Ⅲ实验理论 本实验是探索类实验。主要目的是通过研究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用是否都具有催化作用，探索酶催化化学反应的特点。本实验给我们的重要启示是:设计实验时，首先要从已知人手，确定何为实验变量(自变量)，何为因变量，何为控制变量。 本实验的已知条件为题目，即“探索淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用”。 从题目可知: ①淀粉、蔗糖水解的产物，水解的速率等变化的结果，即因变量。从因变量入手我们将推知自变量(实验变量)对其的影响程度或它们之间的关系。 ②淀粉、蔗糖在实验过程中的浓度、用量、淀粉酶的浓度、用量、水解过程的温度等都为控制变量，需遵循同时等量原则，以排除控制变量对2个水解反应的影响。 ③淀粉酶本身是实验变量。通过研究确定其分别对淀粉水解作用和蔗糖水解作用的影响。 在以上分析的基础上，再安排淀粉、蔗糖、水、淀粉酶、温度、酸碱度等各变量的“出场”顺序，想必会容易许多。 Ⅳ随堂演练 1.下列关于酶的叙述，不正确的是（） A.酶的催化效率很高 B.酶是具有催化功能的蛋白质
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响 一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。 二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。 能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。 酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。 食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。 本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。 三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
α-淀粉酶的合成与应用 谷君 摘要：酶, 发酵,生产,合成,应用 关键词：生产应用 一，淀粉酶的产生菌及酶的特性 （1）淀粉酶可由微生物发酵产生，也可从植物和动物中提取，目前I业生产上都以微生物发酵法进行大规模生产淀粉酶。在 1 9 0 8年和 1 9 1 7年德国的 B o k i i n 和 F A f r o n t [ 日先后由细菌中生产出 d ．淀粉酶，用于纺织品脱浆。1 9 3 7年日本的福本口获得了产生a 一淀粉酶的括革杆菌。第二次世界大战后，由干抗生素的发明，使得微生物I业大步前进， 1 9 4 9年Ⅱ - 淀粉酶开始采用深层通风培葬法进行生产。1 9 7 3年耐热性淀粉酶投入了生产r 4 3 。随淀粉酶的用途日蓝扩大，产量日见增多，生产水平也逐步提高。近些年我们国家的酶制剂行业发展较快，从 1 9 6 5年开始应用解淀粉芽孢杆菌B F 一7 6 5 8生产淀粉酶，当时仅无锡酶制剂厂独家生产，近年在国内生产酶制剂的厂家已发展到 l 2 O多个，其中约有 4 O 左右的I厂生产淀粉酶，产品也由单一的常温I业用 d 一淀粉酶，发展到现在有I业用也有食品鼓，既有常温也有耐热的，剂型上有固体的也有液体淀粉酶。酶制剂I业现已成为近代I业生产中不可缺少的组成部门，它对社会的贡献远远超过酶I业本身。 （2）世界上许多国家都以枯草杆菌，地衣芽孢杆菌生产细菌淀粉酶和米曲霉生产的真苗淀粉酶为主要产品，在工业生产中使用的菌种，最初都是从自然中得到的，通过筛选和诱变育种工作，可改变菌种的特性，提高 n 一淀粉酶的活力。O n t t r u p 以地衣芽孢杆苗AT C C 9 7 9 8为出发菌株，用 Y射线， N T G以及 uV反复 7次 诱变，使其 n 一淀粉酶的产量为原苗株的 2 5 倍。A n d r e e v a 等将枯草杆菌孢子悬浮液经 5 0 ℃加热处理 3 0分钟，酶合成速度提高了 2 —2 、 7倍，可见采用诱变育种是行之有效的方法，但也有一定的局限性和缺点，由于发生平顶效应使之育种效果降低，利用转化法改良菌种，在枯草杆菌 n 一淀粉酶的生产苗上已 取得可喜的结果 K a z u m a s a 等采用转化和诱变结合的方法．使 n 一淀粉酶产量比亲株高 l 5 0 0 - -2 0 0 0倍近年来，随生物工程技术的发展，基因工程技术已应用到菌种的改造方面。 P a l v a r 2 等把解淀粉芽孢杆菌n 一淀粉酶基因克隆到枯草芽孢杆菌中，其 n 一淀粉酶活力比其原始的野生型苗株高 5 0 0倍。 H e n a c h a n 又把地衣芽孢杆菌耐热淀粉酶基因克隆到枯草芽孢杆苗中，美国 C P C国 际公冠的 Mo f f c t 研究中心，已获得美国食品药品管理局( F DA) 的批准，可用其研制的基因工程菌生产淀粉酶，这是第一个由 F D A 批准用基因工程菌生产的酶髑剂。。我国在利用基因重组构建耐热性一淀粉酶方面已取得一定的进展，何超刚[ 3 等将脂肪嗜热芽孢杆菌淀粉酶基因质粒带人大肠杆菌，使后者具有生 产高淀粉酶能力。任大明0 将带有淀粉酶基因的克隆片段，在枯草杆菌中得到表达。朱卫民将枯草杆菌 a淀粉酶基因在大肠杆苗中的得表达。
血、尿淀粉酶检测的临床意义 贾思公 淀粉酶(AMY或AMS)全称是1，4-α-D-葡聚糖水解酶，催化淀粉及糖原水解，生成葡萄糖、麦芽糖及含有α1，6-糖苷键支链的糊精。淀粉酶主要由胰腺和唾液腺分泌，肺、肝、甲状腺、脂肪等组织亦含有此酶。 生理变异：成年人血中淀粉酶与性别、年龄、进食关系不大，新生儿淀粉酶缺乏，满月后才出现此酶，逐步升高，约在5岁时达到成年人水平，老年人淀粉酶开始下降，约低25%。 注意事项：血淀粉酶的检验结果与进食的关系并不大，因此检验前无需刻意空腹，但若有使用避孕药或者麻醉药等则可能使得测定的数值出现偏低的情况。 参考值：血清淀粉酶28—100u/L；尿液淀粉酶0—500u/L 临床意义：淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌，可通过肾小球滤过。 (1)血清与尿中淀粉酶升高：流行性腮腺炎，特别是急性胰腺炎时，血和尿中淀粉酶显著增高。急性胰腺炎病人胰淀粉酶溢出胰腺外，迅速吸收入血，由尿排出，故血尿淀粉酶大为增加，是诊断本病的重要的化验检查。血清淀粉酶在发病后1～2小时即开始增高，8～12小时标本最有价值，至24小时达最高峰，并持续24～72小时，2～5日逐渐降至正常，而尿淀粉酶在发病后12～24小时开始增高，48小时达高峰，维持5～7天，下降缓慢。故胰腺炎后期测尿淀粉酶更有价值。一般情况下，血清淀粉酶在增高频率以及程度上都不及尿淀粉酶检测，当血清活性淀粉酶回归常态后，尿淀粉酶活性仍然可以持续６天左右，这也是尿淀粉酶检测的敏感度和特异度都高于血淀粉酶检测的原因所在。尿淀粉酶活性测定对于胰腺炎的诊
断非常有效，在患者未能及时就诊时更是如此，在条件允许的情况下，进行血尿淀粉酶联合测定效果更佳。对急性胰腺炎的诊断，血尿淀粉酶都有很高的敏感性。在遇到急腹症患者，特别是那些腹部持续剧痛，用解痉剂也无法缓解症状的病例，就应该及时给患者采取血尿点淀粉酶检测，如果病情不能确定，还可以采取CT 、B 超等手段辅助进行，早点确诊，以便下一步治疗。 急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔、慢性胰腺炎、胰腺癌、急性阑尾炎、肠梗阻、流行性腮腺炎、唾液腺化脓等血清淀粉酶均可升高，但升高幅度有限。肾功能障碍时，血淀粉酶升高，尿淀粉酶降低。 (2)血清与尿中淀粉酶降低：正常人血清中淀粉酶主要由肝脏产生，血清与尿淀粉酶同时减低主要见于肝炎、肝硬化、肝癌及急性和慢性胆囊炎等。肾功能障碍时血清淀粉酶也可降低。 血尿淀粉酶对于胰腺炎的诊断虽然很有效果，但也会存在一定的诊断不出甚至误诊的几率。胰腺炎是最为常见的急腹症，患者大多有持续性阵痛，与暴饮暴食和烟酒过度有一定关系。有一种以腹泻为主要症状的胆源性胰腺炎与急性肠胃炎临床症状极为相似，血尿淀粉酶也表现较高，容易误诊。胆结石的临床症状主要为腹疼、恶心以及呕吐、发热。常态下，存留于胰液中的胰蛋白是在十二指肠里，它变成活性胰蛋白酶需要胆汁中的肠激酶激活，这样才能够去消化蛋白质。急性胰腺炎很多都是由胆石症引起的，所以急性肠胃炎和胆结石在临床上极易被误诊为胰腺炎，需要重点关注。 总而言之，血尿淀粉酶的坚持是当前诊断胰腺炎的主要手段，其有效
万吨α淀粉酶生产车间 的设计 公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]
8万t/a α-淀粉酶生产车间的设计 摘要：本设计为年产80,000t α-淀粉酶的工厂设计，其通过枯草杆菌液体深层发酵、沉淀法提取达到分离纯化出菌体中α-淀粉酶的目的。本设计分别对α-淀粉酶的性质、用途、工艺流程及生产原理都做了相关的阐述，并对有关的物料和热量也作了相应的衡算，以及对标准设备的选型和计算，还对工艺指标、安全问题和环境保护都做了详细的阐述。通过设计得出结论：年产8万吨α-淀粉酶发酵工厂，共有18个500m3发酵罐，每月均放罐180罐，发酵周期为72小时，总提取率为82%，理论α-淀粉酶产量为吨/罐，实际α-淀粉酶产量为吨/罐。每月应投入生产总成本为3993万元，根据目前市场价格，年利润为万元。 关键词：α-淀粉酶；工厂设计；效益分析；发酵；发酵罐 Plant Design of Sixty thousand t/a α-Amylase Abstract:This project is designed by a factory which produces 60,000t α-Amylase a achieves the aim of filtration and purification of the α-Amylase by using the deep ferment of hay bacillus and settling design not only respectively illustrate the quality,use,technological process and production principle but also make a materials and heat balance,the type selection and calculation of the standard equipment,further more,illustrate the technic
微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体
淀粉酶活力测定实验报告 淀粉酶活力测定实验报告实验三、淀粉酶活性的测定实验报告 实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的: 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义; 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理: 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热，70? 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力(单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量)。 三、实验用具: 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热 恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 (1)0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液:A液:称取柠檬酸20.01g，定容至 1000ml;B液:称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml;取A液55ml与B液145ml混匀。 (2)1%可溶性淀粉溶液:1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6
的柠檬酸缓冲液; (3)1%3,5-二硝基水杨酸试剂:称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入; (4)麦芽糖标准溶液:取麦芽糖0.1g溶于100ml水中; (5)pH 6.8的磷酸缓冲液: 取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用 0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至 6.8，加水稀释至1000ml即得。 (6)0.4mol/L的NaOH溶液; (7)1%NaCl溶液。 (8)实验材料:萌发的谷物种子(芽长约1cm) 四、操作步骤 1、酶液提取:取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70?士0.5? 恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40?士 0.5? 恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40?下预热的1,淀粉溶液 2m1,摇匀,立即放入40?恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶 活动,准备测糖。
武汉轻工大学 设计α-淀粉酶的发酵生产工艺 系部食品科学与工程学院 专业粮食工程 班级粮工1002 姓名郑开旭 学号100107502 指导教师易阳 2013年6月9日
设计α-淀粉酶发酵的生产工艺 摘要:α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，α- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出了生产工艺流程图，详细的介绍了α-淀粉酶的生产工艺。 关键词：α-淀粉酶；工艺设计；发酵 正文: α-淀粉酶的生产工艺 1 α-淀粉酶的生产方法 1.1生产方法的选择 枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型α-淀粉酶菌种，国内普遍采用深层发酵法生产工业粗酶。我们从BF7658出发，用紫外光及化学药品反复交替诱变，选育适用于固体发酵的新菌体BF7658—1。该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁表面可生成菌膜，在培养基上菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、略有光泽，用碘液试之，菌落周围呈透明圈。 ?固体培养枯草杆菌BF7658—1生产α-淀粉酶 将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37℃培养三天，然后转接到种子液体培养基上（豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等），摇瓶培养一定时间，当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培养基（麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到38～40℃）在厚层通风制曲箱内，通风保持37～42℃，培养48小时出曲风干。 麸曲用1％食盐水3～4倍浸泡，3小时后过滤，调节滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40℃烘干、磨粉即为成品。 ?深层发酵法生产α-淀粉酶
高产淀粉酶菌株的筛选 一：前言 1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。 3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。 关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选 1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。 a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。 b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。 c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。 ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。 d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。 二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台 实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液 培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉 三：实验步骤 1培养基的制备及其仪器的灭菌
实验七尿淀粉酶活性测定 淀粉酶（AMY或AMS在体内的主要作用是水解淀粉，它随机地作用于淀粉分子内的 a—1, 4糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、寡糖及糊精。血清中的淀粉酶主要有胰型（P型）和 唾液型（S型）及其亚型同工酶组成，P型淀粉酶主要来源于胰腺，S型淀粉酶主要来源于唾 液腺。正常淀粉酶因分子量小，故可从肾小球滤过而由尿中排出。 【目的】 1、验证淀粉酶的催化作用。 2、观察淀粉及其水解产物分别与碘反应呈现的颜色变化。 【原理】血清及尿中的淀粉酶来源于胰腺和唾液腺，正常血清与尿中有一定活性。 Winslow 氏法测定尿和血清中淀粉酶活性是将试样作等比稀释，观察一系列试样在规定的 37C、30分钟的条件下，恰好能将0.1%淀粉溶液1ml水解（指加入碘液后不再呈蓝色）的 酶量定为淀粉酶的一个活性单位，乘以尿的稀释倍数，即可得知每项ml 尿液中的淀粉酶活性。 【器材】 试管（10mn X 100mr）、试管架、电热恒温水浴箱、吸管、洗耳球、滴管。 【试剂】 1 、 9%NaCl 2、0.3%碘液 3、0.1%淀粉溶液 【操作】 1 、准备尿液（自备）。 2、取 10支试管，编号，用吸管向管中加入0.9%NaCl 1ml。 3、用1ml吸管（注意应用刻度到头的）向第一管加尿液1ml，混合，再将试管中的液 体吸起，然后任其流回试管，如此重复三次，以便全管混匀，并借此冲洗吸管内壁。吸出此混合液1ml 移入第二管中。 4、用同法处理第二管使之混匀，并取出1ml 置于第三管中。依此类推，如此继续稀释 至第九管后，吸出1ml混合液弃之，这样既可获得分别含原尿液为1/2ml,1/4ml,1/8ml, ... 1/512ml 的不同浓度的尿稀释液。第十管不加尿液作为对照管。 5、从第十管起依次向各管迅速准确加入0.1%淀粉液2ml，迅速摇匀（是否充分混匀往
实验四、淀粉酶活性的测定 一、实验目的： 1、了解α - 淀粉酶和β - 淀粉酶的不同性质及其淀粉酶活性测定的意义； 2、学会比色法测定淀粉酶活性的原理及操作要点。 二、实验原理： 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。根据α-淀粉酶和β-淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，70℃ 15min 则被钝化。测定时，使其中一种酶失活，即可测出另一种酶的活性。 淀粉在淀粉酶的催化作用下可生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中淀粉酶活力（单位重量样品在一定时间内生成麦芽糖的量）。 三、实验用具： 1、实验设备 研钵,具塞刻度试管,离心管，分光光度计，酸度计，电热恒温水浴锅，离心机，电磁炉。 2、实验材料与试剂 （1）0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，定容至1000ml；B液：称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000ml；取A液55ml与B液145ml混匀。 （2）1%可溶性淀粉溶液：1g淀粉溶于100ml 0.1mol/l pH5.6的柠檬酸缓冲液； （3）1%3,5-二硝基水杨酸试剂：称取3,5-二硝基水杨酸1g、NaOH 1.6g、酒石酸钾钠30g，定容至100ml水中，紧盖瓶塞，勿使CO2进入； （4）麦芽糖标准溶液：取麦芽糖0.1g溶于100ml水中； （5）pH 6.8的磷酸缓冲液:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1000ml即得。 （6）0.4mol/L的NaOH溶液； （7）1%NaCl溶液。 （8）实验材料：萌发的谷物种子（芽长约1cm） 四、操作步骤 1、酶液提取：取6.0g浸泡好的原料，去皮后加入10.0mL 1%的NaCl 溶液，磨碎后以2000r/min 离心10min，转出上清液备用。取上清液1.0ml，用pH 为6.8的缓冲溶液稀释5倍，所得酶液。 2、a- 淀粉酶活力测定 (1) 取试管4支,标明2支为对照管,2支为测定管。 (2) 于每管中各加酶液lml ,在 70℃士0.5℃恒温水浴中准确加热15min ,取出后迅速用流水冷却。 (3) 在对照管中加入4m1 0.4mol/L氢氧化钠。 (4) 在4支试管中各加入1ml pH5.6的柠檬酸缓冲液。 (5) 将4支试管置另一个40℃士 0.5℃恒温水浴中保温15min ,再向各管分别加入40℃下预热的1％淀粉溶液2m1,摇匀,立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4ml 0.4mol/L氢氧化钠,终止酶
血、尿淀粉酶检测得临床意义 贾思公 淀粉酶(AＭY或ＡMS)全称就是１，４—α-Ｄ-葡聚糖水解酶,催化淀粉及糖原水解,生成葡萄糖、麦芽糖及含有α1,6—糖苷键支链得糊精。淀粉酶主要由胰腺与唾液腺分泌，肺、肝、甲状腺、脂肪等组织亦含有此酶。 生理变异：成年人血中淀粉酶与性别、年龄、进食关系不大,新生儿淀粉酶缺乏，满月后才出现此酶，逐步升高,约在5岁时达到成年人水平,老年人淀粉酶开始下降，约低25%。 注意事项：血淀粉酶得检验结果与进食得关系并不大，因此检验前无需刻意空腹，但若有使用避孕药或者麻醉药等则可能使得测定得数值出现偏低得情况。 参考值：血清淀粉酶28—10０ｕ/L;尿液淀粉酶０-500u/L 临床意义:淀粉酶主要由唾液腺与胰腺分泌，可通过肾小球滤过。 （1）血清与尿中淀粉酶升高:流行性腮腺炎,特别就是急性胰腺炎时,血与尿中淀粉酶显著增高。急性胰腺炎病人胰淀粉酶溢出胰腺外，迅速吸收入血，由尿排出，故血尿淀粉酶大为增加,就是诊断本病得重要得化验检查。血清淀粉酶在发病后１~2小时即开始增高,８～1２小时标本最有价值,至24小时达最高峰，并持续24～７2小时,2~5日逐渐降至正常，而尿淀粉酶在发病后1２～24小时开始增高，４8小时达高峰,维持5～7天,下降缓慢。故胰腺炎后期测尿淀粉酶更有价值。一般情况下，血清淀粉酶在增高频率以及程度上都不及尿淀粉酶检测，当血清活性淀粉酶回归常态后，尿淀粉酶活性仍然可以持续６天左右，这也就是尿淀粉酶检测得敏感度与特异度都高于血淀粉酶检测得原因所在。尿淀粉酶活性测定对于胰
腺炎得诊断非常有效,在患者未能及时就诊时更就是如此，在条件允许得情况下,进行血尿淀粉酶联合测定效果更佳.对急性胰腺炎得诊断，血尿淀粉酶都有很高得敏感性。在遇到急腹症患者，特别就是那些腹部持续剧痛，用解痉剂也无法缓解症状得病例,就应该及时给患者采取血尿点淀粉酶检测,如果病情不能确定,还可以采取ＣT 、B 超等手段辅助进行,早点确诊，以便下一步治疗。 急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔、慢性胰腺炎、胰腺癌、急性阑尾炎、肠梗阻、流行性腮腺炎、唾液腺化脓等血清淀粉酶均可升高,但升高幅度有限。肾功能障碍时,血淀粉酶升高,尿淀粉酶降低. (2)血清与尿中淀粉酶降低:正常人血清中淀粉酶主要由肝脏产生,血清与尿淀粉酶同时减低主要见于肝炎、肝硬化、肝癌及急性与慢性胆囊炎等。肾功能障碍时血清淀粉酶也可降低。 血尿淀粉酶对于胰腺炎得诊断虽然很有效果,但也会存在一定得诊断不出甚至误诊得几率。胰腺炎就是最为常见得急腹症,患者大多有持续性阵痛，与暴饮暴食与烟酒过度有一定关系.有一种以腹泻为主要症状得胆源性胰腺炎与急性肠胃炎临床症状极为相似，血尿淀粉酶也表现较高，容易误诊。胆结石得临床症状主要为腹疼、恶心以及呕吐、发热。常态下，存留于胰液中得胰蛋白就是在十二指肠里,它变成活性胰蛋白酶需要胆汁中得肠激酶激活，这样才能够去消化蛋白质。急性胰腺炎很多都就是由胆石症引起得, 所以急性肠胃炎与胆结石在临床上极易被误诊为胰腺炎,需要重点关注。 总而言之,血尿淀粉酶得坚持就是当前诊断胰腺炎得主要手段，其有效率高，操作也较为简便，能够更为快捷得发现胰腺炎患者,便于对症治
微生物学设计性实验报告 项目组长＿学号＿＿成员专业＿生物科学班级＿＿实验项目名称＿土壤中微生物的分离及分类＿指导教师及职称＿＿＿开课学期至学年＿＿学期上课时间 从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 一、摘要 本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的及要求 1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。 三、实验仪器设备 主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等 主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液 四、实验方案设计 （一）实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。 2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。 3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌