TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测ERCC1变异剪接体
检测平台的建立
前言
对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。在TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术( TaqMan real-time quantity RT-PCR)出现前，传统的检测方法有4种[1, 2]：（1）Northern blot; (2)核酶保护分析；（3）相对定量RT-PCR，（4）竞争定量RT-PCR这些方法都有其内在的局限性。Northern blot耗时，随时面临RNA降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的RNA 才能检测出来，仅仅适合相对定量分析[3]。核酶保护分析比Northern blot相对灵敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的RNA才方便检测[4-8]。相对定量RT-PCR 则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析，由于每个样本的起始拷贝数不一致，很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。而且此方法需要将PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加了污染的可能性[9]。竞争定量RT-PCR则需要根据不同的目的基因片断构建相应的竞争子，然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例，不仅仅耗时而且繁琐，更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性，而是是一件极其艰难的工作[10, 11]。这些传统技术不仅繁琐耗时，而且对mRNA的质量要求较高，结果不稳定。而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性，导致研究结果不十分可靠，各研究机构之间的结果差异较大。
应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术则可以分别精确检测各个变异剪接体的表达量，结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理，几无污染[1, 12-14]。本研究拟建立对切除修复交叉互补基因1即ERCC1（excision repair cross-complementation group 1）变异剪接体的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测平台，为深入研究ERCC1的变异剪接奠定基础[15]。
TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补的一段寡核苷酸作为TaqMan探针，在此探针的5’端标记报告基团（如FAM），
在3’端标记淬灭基团（如TAMRA）。当探针完整时，报告基团所发射的荧光通过荧光共振能量传递（FRET）被淬灭基团所吸收，从而不能检测到其荧光。Taq 酶则具有5’外切酶活性，在PCR的延伸阶段，可以从探针的5’端将报告基团水解掉，并将整个探针完全水解，使得报告基团和淬灭基团的原有空间结构被打散，荧光共振能量传递不复存在，从而可以探测到反应体系中报告基团所发射的荧光。随着PCR循环的增加，荧光也不断的累加，从而反映产物的生成情况[16-18]。在研究变异剪接时，只需要将TaqMan探针设计在发生了变异剪接的外显子的前后邻近两个外显子处，即跨在前一个外显子的末端和后一个外显子的前端，便可检测到目的变异剪接体的表达量。在不同的探针上标记不同的荧光物质，便可以在同一个反应体系中同时检测各个变异剪接体的表达量[12, 19-21]。
变异剪接（alternative splicing）是真核生物中广泛存在的一个现象[22-27]，可以调节基因的表达水平[28]，增加蛋白质的多样性[29, 30]，并对肿瘤的生物学行为有很大的影响[22, 27, 31-34]，和肺癌[13]、乳腺癌[35-37]、卵巢癌等的发生发展存在一定的关系。
ERCC1是核酸切除修复系统NER（nucleotide excision repair）的一个关键基因，在以铂类为基础的化疗中扮演着重要角色。铂类药物通过与细胞DNA形成加合物（Pt-DNA adducts）从而杀伤肿瘤细胞，NER则可以通过切除加合物并修复被损伤的DNA，从而降低化疗的效果。研究表明ERCC1的mRNA表达量与肿瘤患者的化疗敏感性和生存时间具有一定的相关性[38]。
ERCC1基因共10个外显子，细胞中存在不同比例的两种形式的剪接体，为含10个外显子的全长剪接体mRNA (full length, FL),和缺失第VIII外显子（长72bp），仅含9个外显子的变异剪接体mRNA( alternative splicing, AS)[39-41]。
1 ERCC1基因结构特征分析（文章写作不规范，[ERCC1基因结构特征分析]一节是属于材料方法，还是前言部分？我认为这部分ERCC1在GenBank的背景，可以放在综述里）
根据GenBank数据库提供的信息，ERCC1基因ID为GeneID: 2067，位于19号染色体长臂，处于19q13.2-q13.3位置。
ERCC1在染色体的位置：chromosome: 19; Location: 19q13.2-q13.3
Official Symbol ERCC1 and Name: excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 1 (includes overlapping antisense sequence) [Homo sapiens]
Other Aliases: COFS4, UV20
Other Designations: excision repair cross-complementing 1; excision repair protein Chromosome: 19; Location: 19q13.2-q13.3
Annotation: Chromosome 19, NC_000019.8 (50604712..50619017, complement) MIM: 126380
GeneID: 2067
ERCC1是研究比较多的基因，ERCC1在染色体的位置图可以在文章中不列出，而且ERCC1基因的染色体位置，与其外显子剪切无关。
基因组全长14306 bp，转录为含有10个外显子的mRNA全长为1101bp，编码氨基酸的mRNA序列从147开始至1040结束，共计894bp是编码氨基酸的序列，以ATG作为起始密码子，以TGA作为终止密码子（任何一个蛋白质都是与ATG 为起始密码子，以TGA作为终止密码子，这句多余）。产物ERCC1蛋白含297个氨基酸。编码核酸序列占基因组核酸的6.25%。每个外显子的长度在100bp左右，最长外显子是第III外显子，长216bp,最短外显子是第IX外显子，长69bp，平均外显子长度是110bp。
ERCC1基因内含子与外显子的序列
Exons and Intron of ERCC1 Gene
成熟的全长ERCC1 mRNA含有10个外显子，全长1101bp，从1至146bp是3’非编码区3’UTR (3’ untranslated region)，从1041到1101是5’非编码区5’UTR (5’untranslated region)
The structure of ERCC1 mRNA
使用BLAST在人基因组和转录子库里面比对ERCC1的mRNA序列，可以发现ERCC1的mRNA序列是非常特异的。（在人基因组和转录子库里比对，应用的是贪婪比对法则，而且只与人的基因组比对，当然只有ERCC1可比对，这些与
外显子检测无关，可删除）
ERCC1基因的BLASTA同源性比对
Homology of ERCC1 gene using BLASTA software（删除）
第八外显子72bp序列GTGACTGAATGTCTGACCACCGTGAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGTCA GACCCTCCTGACCACATTTGGA
2. ERCC1全长及缺失第VIII外显子变异剪接体TA质粒的构建（这一节属方法部份，放到方法里）
试验流程如下：
TRIZol 提取RNA PCR 产物克隆至pMD18-T 载体
Oligo (dT)18逆转录cDNA
转化入感受态大肠埃希氏菌并筛选扩增
TaqMan 实时荧光定量PCR 新鲜卵巢癌组织
PCR 扩增ERCC1的CDS 序列，beta-actin
目的片断
抽提质粒，稀释成不同浓度作为标准品
2.1 材料与试剂
2.1.1 标本
标本组织来源来自正常卵巢组织（标本来源单位，时间，何种病人，正常人是不可能被切卵巢的），标本切下后迅速置于液氮中保存直至提取RNA 时取出。 质粒与菌株
大肠埃希菌（DH-5à） Escherichia Coli ，E.Coli 为本实验室保存留种。 pMD18-T TA 克隆质粒够自日本Takara 公司[42, 43]。其结构如下：
pMD18-T质粒结构和酶切位点示意图
The structure and enzyme site of pMD18-T Vector
2.1.2 主要仪器
超速低温离心机德国西门子公司（本实验室没有该品牌）TGL-16C台式高速离心机上海安亭科学仪器厂
Gel doc 2000凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司（本实验室没有该品牌）紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司
PCR扩增仪美国热电公司Thermo electron corporation
电动玻璃匀浆机宁波玻璃仪器厂
OLYMPUS光学显微镜日本OLYMPUS公司
恒温水浴箱国产
冰浴加样盒国产
桥式水平电泳仪槽北京崇文东方仪器厂
DYY-型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂
Eppendorf管国产
微量移液器美国Gilson公司
超低温冰箱中国海尔公司
荧光定量PCR管0.2ml--------------薄壁美国Cepheid 公司Smartcycler ？？？/ 2.1.3试剂
(1) TRizol 试剂购自Invitrogen公司
(2)First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒购自MBI Fermentas 公司，内含：
M-Mulv 反转录酶
Oligo(dT)18 (0.5μg/μl)
高浓度dNTP 10mM dNTP
RNA酶抑制剂Rnasin inhibitor
5×reaction buffer
(3) Taq PCR Master Mix 购自TIANGEN生物有限公司
(4)DNA片段纯化回收试剂盒购自日本宝生物TaKaRa公司
(5)氨苄青霉素贮存液(100μg/ml) -20℃保存备用
(6)LB培养基：
NaCl 10g; Yeast extract 5g; Tryptone 10g; 加蒸馏水溶解,用5M NaOH调至7.0,定容至1000ml，高压灭菌消毒20min。若加氨苄青霉素到终浓度为100μg/ml 则为AMP(+)，不加氨苄青霉素为AMP(-)。
(7)SOC培养基：
Tryptone 2.0g；Yeast extract 0.5g；NaCl 0.05g；0.25M KCl 1.0ml；5M NaOH 调节PH值至7.0，加蒸馏水至100ml，高压消毒。使用前加入2mol/L MgCl2 0.5ml 和1M 葡萄糖2ml（过滤除菌）。
(8)感受态细胞制备CaCl2: 连云港润泰化工有限公司
(9)LB培养板：
营养琼脂15g，加LB培养基100ml，高压灭菌，冷却至50℃-60℃时，加入氨苄
青霉素使终浓度为100μg/ml，每只无菌平皿中（直径φ10cm）倒入15ml，超净台中紫外灯照射下冷却，即为Amp(+)，同时制备不含氨苄青霉素的LB培养板，为Amp(-)，作为对照使用。
(10)DL2000 DNA Marker 购自大连宝生物公司
(11)异丙醇、无水乙醇国药集团化学试剂有限公司
(12)焦碳酸二乙酯(DEPC) 上海生物工程公司
(13)三氯甲烷（氯仿）东风化工厂
(14)溴化乙锭EtBr 上海生物工程公司
(15)琼脂糖上海捷瑞生物技术公司
(16) 50×TAE BIOWEST AGAROSE公司
2.1.4 试剂配置
(1) 0.1%DEPC水配制
0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）是RNA酶的强烈抑制剂，所有接触RNA的器具均需经过含0.1%的DEPC的水浸泡过夜以便去器具上面沾染的RNA酶，浸泡后高温高压消毒。
1000ml双蒸水中加入1ml DEPC，充分震荡混匀，配制成含0.1%DEPC的水备用。含0.1%DEPC的水放置过夜，大概16小时后，吸取100ml，经高温高压30min 后，即可除去DEPC，成为不含RNA酶的水。可用于RNA的提取和逆转录。
(2) RNA酶的去除
RNA酶可以降解RNA, 破坏RNA的完整性,影响试验结果，所以在提取RNA的整个过程都要严防RNA酶的存在。为减少RNA酶的污染，所用的Tip头、Eppendorf离心管等塑料制品均先用0.1%二乙基焦碳酸酯(DEPC水)浸泡过夜，后高压消毒除去残存的DEPC，进口塑料管已经过射线消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后
200℃干烤4-6小时，方能使用。所以物品均现配现用。
(3) EtBr溶液的配制
溴化乙锭EtBr是有毒物质，皮肤不可以直接接触，整个配置过程都要戴橡胶手套，在通风厨中进行。配置的溴化乙锭贮存浓度为10mg/ml，工作液的浓度为200μg/ml。
首先将溴化乙锭0.5g溶解于50ml三蒸水中，充分搅拌溶解后放置于棕色瓶中4℃避光保存。使用时取10mg/ml的贮存液200μl稀释于10ml三蒸水中。
（4）50×TAE电泳缓冲液的配制
Tris 12.1g
0.5mmol/L EDTA(PH=8.0) 5.0ml
冰醋酸 2.9ml
首先称取Tris12.1g加入40ml三蒸水中，依次加入0.5mmol/L EDTA(PH=8.0) 5.0ml，冰醋酸2.9ml，充分搅拌溶解后用三蒸水补足至50ml，高压灭菌后室温保存，作为贮存液。使用时，取20ml加蒸馏水至1000ml，即得1×TAE的工作液。
（5）不同浓度琼脂糖凝胶配制
①1.0％琼脂糖凝胶50ml
琼脂糖0.5g
1×TAE 50ml
②1.5％琼脂糖凝胶50ml
琼脂糖0.75g
1×TAE 50ml
称取所需剂量的琼脂糖粉末，加入所需体积的TAE缓冲液中，置于微波炉中间
断加热，使琼脂糖完全溶解，其间不断缓慢摇动锥形瓶，使贴于壁上的琼脂充分溶解。冷却至50℃左右，加入200μg/ml溴化乙锭(EB液)125μl混匀(使终浓度为0.5μg/ml)。
（6）SOB培养基
将下列组分溶解在0.9L水中：
蛋白胨20g
酵母提取物5g
氯化钠0.5g
1 mol/L 氯化钾2.5ml
用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。
(7) SOC培养基
成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml 的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g 葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。
(8) IPTG溶液配制方法
IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
（9）X-gal溶液配制方法
X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的
20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。
3 方法
3.1 总RNA提取
3.1.1RNA提取原理
RNA是极易受到RNA酶的降解，在提取RNA过程中最关键的是抑制RNA酶活性,所以的用具均需经过含0.1%DEPC的水浸泡过夜后高温高压消毒。RNA提取基本原理是通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。已经有商品化的RNA提取试剂盒出售，如美国Invitrogen公司的TRIZol和日本Takara公司的RNAiso。本试验采用美国Invitrogen公司的TRIZol试剂提取RNA。TRIZol为高浓度强变性裂解液，可迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，同时Trizol试剂还含有Rnase 抑制剂使细胞内RNA酶失活，RNA不被降解，同时氯仿能将细胞碎片、DNA、蛋白质与RNA分离开来，得到纯化的总RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一种强烈的RNA酶抑制剂，用它来浸泡实验所用器具，及配制70%乙醇，保证实验过程不产生RNA酶污染，并且使所得RNA有较高的纯度，几乎不含有基因组DNA[44, 45]。
3.1.2实验步骤：
本次研究采用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂一步法[44, 46, 47]提取卵巢组织总RNA，以便得到高质量的RNA用于目的基因的克隆。
(1) 手术切除的卵巢癌组织约200mg迅速置于液氮中，在液氮中使用研钵将卵巢癌组织研磨成粉末后加入Trizol 试剂1mL，充分混匀。
(2) 将全部匀浆液转入1.5mL离心管中，加0.25mL氯仿，充分振荡混匀，冰浴15min。
(3) 在4℃低温下13000rpm，离心15min。
(4) 小心吸取上层水相至另一1.5mL离心管中，RNA存在于上层水相，在吸取时注意不要吸到蛋白层或有机相，以免蛋白等杂质的污染。加等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min，在4℃低温13000rpm，离心15min，沉淀RNA。
(5) 加70%乙醇漂洗沉淀，5000rpm，离心10min，小心弃去乙醇，空气中干燥10min。
(6) 加入50μl 经DEPC处理过的，不含RNA酶的水完全溶解总RNA。
3.13 总RNA的定量及纯度测定：
为了检测所提取RNA的纯度和质量，使用紫外分光光度计测量RNA溶液的吸光值，并使用琼脂糖凝胶电泳检测条带。
(1) 总RNA定量分析：用ddH2O稀释3μLRNA样品至150μL，充分混匀；用紫外分光光度仪测总RNA的OD260、OD280的吸光值，计算OD260/OD280比值，比值大于1.80，表明纯度符合要求，如低于此值，表明存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。通过OD260值计算RNA总浓度：
总RNA浓度(ug/μL)=(A260 ×40×稀释倍数)/1000
(2) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性：选用专用电泳槽、制胶板、梳子，先用无水乙醇擦洗，晾干后用0.1％DEPC处理过的ddH2O彻底冲洗，再用无水乙醇洗一次，待乙醇挥发后即可使用。制备1％琼脂糖凝胶，其中含有0.5μg/ml的溴化乙锭以便使PCR产物在紫外灯下显色。取2μL总RNA溶液加1μL上样缓冲液点样，以5V/cm稳压电泳，紫外灯下可见28s、18s两条清晰的条带，但是有时5s条带并不能总是理想的显示，但是本次提取的总RNA是从新鲜的卵巢癌组织中提取所得，5s条带显示较好。Bio-rad凝胶成像仪成像，使用quality-one 软件分析知其28S条带亮度是18S亮度的2倍（看不出来）。结果见图。
28s rRNA
18s rRNA
5s rRNA
3.2 逆转录cDNA
3.2.1引物的选择：
以提取到的总RNA作为模板，使用引物和逆转录酶逆转录成cDNA.通常可以选用的引物有三种：
1. 胸腺嘌呤寡聚体Oligo（dT）18
2. 随机六聚体引物random hexamer primer
3. 序列特异的引物sequence-specific primer
细胞内的mRNA在3’端为polyA，Oligo（dT）18作为引物与polyA互补，使用Oligo（dT）18作为引物能够将所提取的总RNA中含有polyA 的mRNA逆转录为cDNA，所得到的cDNA利于后续的PCR扩增基因全长，利于构建基因全长的载体，而且对于引物与总RNA的比例要求不严体，不需要对引物与总RNA 的比例进行优化。
随机六聚体引物为四种脱氧核糖核酸(A,T,G,C)的随机组合，使用此引物逆转录的cDNA长短不一，随机六聚体引物与总RNA的物质的量的比例对所得到的cDNA 长度有关键性的影响，提高引物与总RNA的比例能够得到较短的cDNA产物，
通常小于500bp; 如果降低引物与总RNA的比例则使长的cDNA产物增长。因此实验前对随机六聚体引物与总RNA的比例进行优化是必要的。
序列特异的引物则适用于单管RT-PCR(one tube),逆转录的引物是针对目的基因而设计的。Oligo（dT）18与随机六聚体引物适用于两管RT-PCR。(tow tube).
本研究采用两管（步？）RT-PCR法，使用Oligo（dT）18作为逆转录引物以便克隆得到目的基因ERCC1基因的全长序列。
3.2.2逆转录酶的选择
目前广为使用的逆转录酶是四种，具体如下：
1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
本次研究采用Fermentas公司的Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase，(M-MuLV RT),此酶具有低的RNase H活性,以便从较长的模板（最长可达13kb）中得到全长cDNA序列。
3.2.3具体步骤详细叙述如下：
所有操作均在冰上进行。在0.5ml Eppendorf管内加入以下反应体系：
①总RNA 0.5-5μg
Oligo(dT)181μl
RNase free水至总体积12μl
稍离心混匀后，70℃反应5分钟，立即置于冰上冰浴5分钟
②依次加入以下各成分：
5×Reaction Buffer 4μl
10mMdNTP Mix 2μl
RNA酶抑制剂(RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/μl) 1μl
稍离心混匀各成分，37℃下反应5分钟
③加逆转录酶M-MuLV(200u/μl) 1μl
42℃反应60分钟
72℃10分钟灭活逆转录酶
④迅速置于冰浴中5分钟，以防cDNA结合成双链
⑤-20℃保存。
⑵质量检测：制作含有0.5μg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，然后加入逆转录产物4μl及上样缓冲液2ul，电泳使溴酚蓝前移2cm左右，凝胶成像分析仪可见较宽的电泳区带呈片状。
这个图更象基因组的DNA的电泳图，cDNA产物应是弥漫状的，建议不要。3.3引物设计
根据GenBank提供的信息，ERCC1基因mRNA序列号：NM_001983.2，分析ERCC1基因的序列同源性，可以发现ERCC1序列比较特异，与其它基因相似性较小。使用Primer-BLAST设计引物，为了得到ERCC1基因编码序列CDS全长，设计引物时，使上游引物恰好处于编码起始位置，下游引物处于编码结束位置，同时避开单核苷酸多态性SNP位点，避免非特异性扩增。
product length = 894
Forward primer 1 ATGGACCCTGGGAAGGACAAAG 22
Template 147 (168)
Reverse primer 1 TCAGGGTACTTTCAAGAAGGG 21
Template 1040 (1020)
1 CCGGAAGTGC TGCGAGCCCT GGGCCACGCT GGCCGTGCTG GCAGTGGGCC
51 GCCTCGATCC CTCTGCAGTC TTTCCCTTGA GGCTCCAAGA CCAGCAGGTG
101 AGGCCTCGCG GCGCTGAAAC CGTGAGGCCC GGACCACAGG CTCCAG ATGG
151 ACCCTGGGAA GGACAAAG AG GGGGTGCCCC AGCCCTCAGG GCCGCCAGCA
201 AGGAAGAAAT TTGTGATACC CCTCGACGAG GATGAGGTCC CTCCTGGAGT
251 GGCCAAGCCC TTATTCCGAT CTACACAGAG CCTTCCCACT GTGGACACCT
301 CGGCCCAGGC GGCCCCTCAG ACCTACGCCG AATATGCCAT CTCACAGCCT
351 CTGGAAGGGG CTGGGGCCAC GTGCCCCACA GGGTCAGAGC CCCTGGCAGG
401 AGAGACGCCC AACCAGGCCC TGAAACCCGG GGCAAAATCC AACAGCATCA
451 TTGTGAGCCC TCGGCAGAGG GGCAATCCCG TACTGAAGTT CGTGCGCAAT
501 GTGCCCTGGG AATTTGGCGA CGTAATTCCC GACTATGTGC TGGGCCAGAG
551 CACCTGTGCC CTGTTCCTCA GCCTCCGCTA CCACAACCTG
CACCCAGACT
601 ACATCCATGG GCGGCTGCAG AGCCTGGGGA AGAACTTCGC CTTGCGGGTC
651 CTGCTTGTCC AGGTGGATGT GAAAGATCCC CAGCAGGCCC TCAAGGAGCT
701 GGCTAAGATG TGTATCCTGG CCGACTGCAC ATTGATCCTC GCCTGGAGCC
751 CCGAGGAAGC TGGGCGGTAC CTGGAGACCT ACAAGGCCTA TGAGCAGAAA
801 CCAGCGGACC TCCTGATGGA GAAGCTAGAG CAGGACTTCG TCTCCCGGGT
851 GACTGAATGT CTGACCACCG TGAAGTCAGT CAACAAAACG GACAGTCAGA
901 CCCTCCTGAC CACATTTGGA TCTCTGGAAC AGCTCATCGC CGCATCAAGA
951 GAAGATCTGG CCTTATGCCC AGGCCTGGGC CCTCAGAAAG CCCGGAGGCT
1001 GTTTGATGTC CTGCACGAG C CCTTCTTGAA AGTACCCTGA TGACCCCAGC
1051 TGCCAAGGAA ACCCCCAGTG TAATAATAAA TCGTCCTCCC AGGCCAGGCT
1101 C
//（用Vector软件将序列排版，太难看，以下均同）
ERCC1引物扩增CDS全序列，斜黑体下划线表示引物序列
所得引物在GenBank中比对，特异性较强，最大得分MaxScore 44.1，总得分Total Score86.2, 期望值E值为0.007。
3.3.1内参基因的选择
为了去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因应具备的条件理想的内参基因应该满足以下条件:
①不存在假基因(pseudogene),以避免基因组DNA的扩增;
②高度或中度表达,排除太高或低表达;
③稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量是近似的,无显著性差别;
④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;
⑤其稳定的表达水平与目标基因相似;
⑥不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响。
排除内参基因的条件则为:
①在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异;
②呈现细胞周期依赖的表达;
③定位于X染色体。
本次研究选择人beta-actin作为内参基因，可以满足以上条件。
3.3.2内参引物设计
根据GenBank提供的人beta-actin (ACTB, Homo sapiens),序列信息，NM_001101.2，分析beta-acti基因的序列同源性，可以发现beta-actin序列比较
特异，与其它基因相似性较小。使用Primer-BLAST设计引物，设计人β-actin 的引物，同时避开单核苷酸多态性SNP位点，避免非特异性扩增。以便在定量PCR中作为内参照使用。
1 CGCGTCCGCC CCGCGAGCAC AGAGCCTCGC CTTTGCCGAT CCGCCGCCCG
51 TCCACACCCG CCGCCAGCTC ACCATGGATG ATGATATCGC CGCGCTCGTC
101 GTCGACAACG GCTCCGGCAT GTGCAAGGCC GGCTTCGCGG GCGACGATGC
151 CCCCCGGGCC GTCTTCCCCT CCATCGTGGG GCGCCCCAGG CACCAGGGCG
201 TGATGGTGGG CATGGGTCAG AAGGAT TCCT ATGTGGGCGA CGAG GCCCAG
251 AGCAAGAGAG GCATCCTCAC CCTGAAGTAC CCCATCGAGC ACGGCATCGT
301 CACCAACTGG GACGACATGG AGAAAATCTG GCACCACACC TTCTACAATG
351 AGCTGCGTGT GGCTCCCGAG GAGCACCCCG TGCTGCTGAC CGAGGCCCCC
401 CTGAACCCCA AGGCCAACCG CGAGAAGATG ACCCAGATCA TGTTTGAGAC
451 CTTCAACACC CCAGCCATGT ACGTTGCTAT CCAGGCTGTG CTATCCCTGT
501 ACGCCTCTGG CCGTACCACT GGCATCGTGA TGGACTCCGG TGACGGGGTC
551 ACCCACACTG TGCCCATCTA CGAGGGGTAT GCCCTCCCCC ATGCCATCCT
601 GCGTCTGGAC CTGGCTGGCC GGGACCTGAC TGACTACCTC ATGAAGATCC
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR具体实验步骤 关键词：实时荧光PCR2012-03-09 16:43来源：互联网点击次数：46738 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。具体计算如下： RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21
实时荧光定量 PCR技术原理与应用 admin 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT 值（ threshold value ）（如图 2 所示）。
实时荧光定量原理taqman探针简介实时荧光定量 PCR技术原理与应用 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值( threshold value )(如图2 所示)。 图 2. 荧光定量标准曲线 CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值(如图3 所示)。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 图 3 阈值线和 CT 值 荧光探针和荧光染料
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：
（3）Ct值： CT值的重现性：
5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异 一、实验目的 1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。 2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。 二、实验原理 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。本实验中采用非特异性 SYBR Green I 染料法，SYBR Green I 是一种结合于所有 ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。 三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪 实验材料：MCF7细胞 实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒 四、实验步骤 MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus） 1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA； 2)9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直 至裂解液中无明显沉淀，室温（15-30℃）静置5分钟； 3)加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈 乳白色，室温静置5min； 4)12,000 g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为 三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。 5)吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。 6)向上清中加入倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，
荧光实时定量PCR 结果分析问题 荧光实时定量PCR结果分析问题2010-01-22 13：08Line Gene实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响 目的探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响。方法用Line Gene FQD 33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA 77份，分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析。结果发现两种分析方法的总体相关性较好(r=0.978)。但HBV DNA拷贝数含量 <105时，两种模式的相关性差(r=0.706)，此时，最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低(t=2.61,P<0.05)，且易出现假阴性结果。结论虽然样点拟合法步骤较多，但其结果更可靠，因此进行结果分析时，建议使用样点拟合法。而且当样本中HBV DNA拷贝数<105时只能使用样点拟合法进行结果分析。 实时荧光定量；聚合酶链反应；质量控制 7.数据分析：(1)相对定量：使用△Ct法计算目的基因在不同组间的表达差异。(2)绝对定量：将样品的Ct值代入标准曲线，以对目的基因进行定量。 (3)熔解曲线分析：确定产物特异性。主要实验步骤：1.设计并合成Real time PCR引物。2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR Green)的PCR反应优化。3.客户样品RNA抽提。a.实验对象为组织样品，取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，匀浆后抽提RNA。b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106~1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂 Trizol(Invitrogen)，裂解后抽提RNA。4.RNA质量检测a.紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。b.使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA 纯度及完整性。5.使用逆转录酶(Promega)进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。6.制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。7.标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司)，进行RealTime PCR扩增和检测。8.检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。9.提供实验报告，包括详细的实验方法及实时荧光
实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
实时荧光定量PCR仪技术参数 主要用途： 用于基因表达分析研究，对转基因植物的评价和目的基因的定量分析，进行SNP单核苷酸多态性和突变位点的分析检测。 1.工作条件 1.1电源：AC 200-240 V，50－60HZ 1.2温度：15－32℃ 1.3湿度：20-80%(32℃时) 2.主要技术参数 *2.1加热方式：采用半导体加热方式，并结合银质散热模块 *2.2最大升温速度：≥4.8 ℃/s 2.3最大降温速度: 2. 5℃/s(升降温速率连续可调) *2.4控温误差:≤0.1 ℃ *2.5温度均一性:±0.1 ℃ * 2.6扩增速度:35循环反应:96孔检测≤60分钟；384孔≤40分钟 *2.7孔间检测的重复性:CV≤0.15% (50nmol/l荧光浓度) 2.8样本容量：96孔板为10－100ul，384孔板为3－20ul *2.9光源：高强度白色固态光源（寿命不低于20000小时） 2.10激发波长：5通道 *2.11检测通道：6通道 *2.12光学检测系统：冷CCD *2.13灵敏度：可检测单拷贝基因
2.14动力学范围：1-1010个拷贝，10个数量级。 *2.15样品通量：96个样本/次，可自行更换模块，更换后无需校准。 2.16检测模式：至少支持以下各种模式：HybProbe杂交探针、SimplProbe单探针、Taqman 水解探针、荧光染料（SYBR Green I）2.17高分辨率熔解曲线HRM：支持，并提供不少于150篇文献目录2.18 颜色补偿功能：具备 2.19软件：具有定性定量（绝对定量、相对定量）、自动报告熔解温度、自动报告基因分型结果、高分辨率熔解曲线分析等功能，配套的运行和结果分析软件，能够针对观察到的扩增情况随时增加循环数目，实时动态监测，扩增和检测同时进行 *2.20校正：无需ROX染料校正 2.21试剂支持：开放平台，可使用国产或进口的各品牌试剂。 *2.22装机指标：区分1000拷贝和2000拷贝模板浓度的差异。 2.23维护：日常免维护，机器移动后无需校正光路系统。 2.24 扩展性：具备LIMS（实验室信息管理系统）接口，可以实现远程控制并可以结合自动装载微孔板的工作站。 *2.25 临床认证：提供有效期内的SFDA注册证 三．仪器配置： 3.1 96-wells主机一台，96孔模块一个 3.2 操作手册 3.3 软件安装光盘 3.4 控制单元：设备配套原装进口电脑一套
实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1、PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。 2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
实时荧光定量PCR简介 荧光定量PCR检测技术从诞生到现在已经有8 年了，但是其应用在近四年才迅猛增长。在Medline 数据庫中，用“ Taqman” 或”real time PCR” 作为关键词检索，在1996 年仅有19 篇，在1997 年仅有28 篇，在98 、99 、2000 年分别达到了52 、157 、409 篇，2003 年已经达到2984 篇，相信在不久的将来会有更多的文章发表。针对实时PCR 这一热点领域，闪晶公司对它进行了深入细致的研究，并且及时地为广大科研人员推出这项技术服务。 荧光定量PCR基本原理 ?Taqman 技术：该技术以美国ABI 公司为代表。PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；PCR 扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的5' －3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。
?Beacon 技术：该技术以美国人Tagyi 为代表。也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在PCR 的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。 ?FRET 技术：该技术以Roche( 罗氏公司) 为代表。它的基本原理是：两条直线型寡核苷酸探针，其中一条的3 …端标记荧光激发基团，另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号；而当有靶序列时，即在PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。