AO-MBR工艺及膜性能影响因素研究
摘要：介绍了国内外MBR的应用现状，分析了膜材料、膜孔径对膜能量及膜污染的影响，阐述了温度对膜过滤性能的影响。与其它工艺相比较，MBR工艺具有较好的应用前景。
关键词：MBR 膜特性膜污染
引言
MBR技术是活性污泥法与膜技术相结合的一种集成技术[1]，在水处理中的应用及其研究正备受人们关注。同时由于膜对难降解大分子有机物和专属功能微生物的截留作用使得MBR处理难降解有机废水的效果明显优于传统工艺。由于膜的分离作用，生物反应器内的活性污泥浓度较传统的生物处理法要高，这就提高了污水的处理效率与出水水质，同时降低了运行过程的能耗。膜生物反应器日益得到重视也正源于此。但膜生物反应器中膜污染以及使用寿命等依然是该技术需要解决的难题。所以对膜性能影响因素的研究仍然是现阶段的一个重点内容。综合来讲，该工艺仍是一种新型高效的很有发展前景的污水处理工艺[2,3]。
1、MBR国内外的应用现状
1.1国外应用现状
目前，越来越多的国家将MBR用于生活污水和工业废水的处理。表1列出了一些发达国家近年来MBR的应用情况。
表1膜生物反应器在国外应用的情况
注: 1)污水处理厂仍在设计建设中；2)原文中单位为人口当量(Population Equivalents，PE)，此处按照1 PE=0.5 m3/d估算。
1.2国内的应用现状
1998年，大连大器公司设计的200 m3/d的中水回用装置就己在大连投入运行；天津清华德人环境公司和天津大学共同研制的MBR已有了一些应用实例。以处理天津某写字楼排放的污水为例，该写字楼的建筑面积约为17000m2, 采用了日处理能力为25m3的装置，设备本体占地3.2m2，投资10余万元，能耗为0.8 kW?h/m3。处理出水可用作冲厕、绿化及洗车等。清华永新双益环保有限公司开发研制的一体化膜生物反应器先后在“北京汇联食品有限公司食品加工废水处理工程（250m3/d）”,“清华大学东区浴池中水回用工程（200m3/d）”中应用，其中“北京汇联食品有限公司食品加工废水处理工程”于2002年4月24日通
过北京顺义环保局验收，工程处理后出水水质远远优于《生活杂用水质标准》，无色、无味、清澈、透明，完全达到了《北京市水污染物排放标准―排入地表水体及其汇水范围的水污染物排放标准》（试行）的二级排放标准，现出水主要用于厂区绿化灌溉等。
2、膜性能影响因素
2.1膜材料和孔径对膜性能的影响
K.H.Choo[4]等在研究中发现，膜的类型对通量变化影响甚微，膜的内部污染是造成通量衰减的重要因素。膜表面张力的分散组分越大，越容易发生粘附污染。通过对聚飒膜、纤维素膜和聚偏氟乙烯膜的污染比较，认为PVDF膜污染趋势最小。膜自身的疏水性
和进液组分与膜作用的程度不甚明显，这和Nagaoka H 等关于细菌对不同固体粘附特性比较的结论是一致的。方绪亮[5]等研究了膜材料的亲疏水性对膜通量衰减
速率的关系，认为表面形貌越粗糙的膜片其通量衰减越快，化学清洗恢复越困难。膜亲疏水性对于通量衰减影响不是特别明显。疏水性越强，膜初始阶段水通量衰减越快，但由于初始水通量不同，即使有较小的初始通量的膜仍在污染较轻的状况下仍有较大衰减幅度，使得膜材料亲疏水性影响膜通量衰减的结论难以成立。而在膜组件经过长期运行后，膜表面己经被污
染物覆盖，亲疏水性更不会影响膜污染的形成。膜材料和膜孔径对污染的影响见图1。
图1 膜材料和膜孔径对膜污染的影响
2.2温度对膜过滤性能的影响
水温对膜的性能也会产生影响。一些MBR小试研究表明：在一定的温度范围与压力条件下，温度每升高1℃，膜通量增加了1%～2%[6]。
图2 温度对膜抽吸压力平均上升速率的影响
张洪林[7]等采用恒定膜通量的运行方式，膜污染可通过膜过滤压差的变化来间接表征。由图2可见，膜污染速率随温度下降呈加速趋势。温度在15℃时膜过滤压差的上升速率为2.23 kPa/d，是35℃时0.83 kPa/d的2.68倍。由此可以认为，温度是影响MBR膜污染的重要因素，在低温条件下，膜污染速率过快会直接影响系统的正常运行、产水能力及出水水质。
3、结论
由于膜生物反应器有膜的强制截留作用，可以在不排泥的情况下长期运行，从而使反应器中污泥浓度最大限度的增长，反应器中的污泥浓度能维持很高。另外，MBR中PVDF膜的作用使出水维持相对的稳定[8]。所以MBR相对于其它生物处理工艺而言，具有很强的抗冲击负荷的能力。
参考文献：
[1]李根锋，吴楠. MBR技术在废水处理回用中的
应用[J].环境科技，2010，23（1）.
[2]Lopez-Ramirez J．A．，Coello Oviedo M．D．，Quiroga Alonso J．M．Comparative studies of reverse osmosis membranes for wastewater reclamation．Desalination，2006，191(1-3)：137-l47.
[3]孙秀云，王连军，田爱军．MBR在污水处理中的应用[J]．污染防治技术，2003，16(4)：39-41．
[4]K．H．Choo，C．H．L．Effect of anaerobic digestion broth composition on membrane permeability [J]．Water Science and Technology，1996．34(9)：173-179．
[5]方绪亮，何义亮，徐培．膜特性对厌氧膜生物反应器膜污染的影响[R]．第一届中国膜科学与技术报告会．2005．
[6]刘锐．一体式膜生物反应器处理洗浴污水[J]．中国给水排水，2001，17(1)：5-8.
[7]张洪林,周磊,陈小刚等．A/O-MBR工艺处理生
活污水及膜性能的研究[J]．辽宁石油化工大学学报，2010，30(3)：1-5.
[8]Chang I．S．，Clech P．L．，Jefferson B.and Judd．S．，
Membrane fouling in membrane bioreactors for wastewater treatment [J].Environ. Fngrg.2002，128 (11)：1018-1029．
细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。
科技成果：电镀填孔工艺影响因素 电子产品的体积日趋轻薄短小，通盲孔上直接叠孔(viaonHole或Viaonvia)是获得高密度互连的设计方法。要做好叠孔，首先应将孔底平坦性做好。典型的平坦孔面的制作方法有好几种，电镀填孔(ViaFillingPlating)工艺就是其中具有代表性的一种。 电镀填孔工艺除了可以减少额外制程开发的必要性，也与现行的工艺设备兼容，有利于获得良好的可靠性。 电镀填孔有以下几方面的优点： (1)有利于设计叠孔(Stacked)和盘上孔(via.on.Pad)： (2)改善电气性能，有助于高频设计; (3)有助于散热; (4)塞孔和电气互连一步完成; (5)盲孔内用电镀铜填满，可靠性更高，导电性能比导电胶更好。 电镀填孔是目前各PCB制造商和药水商研究的热门课题。Atotech、Shipley、奥野、伊希特化及Ebara等国外知名药水厂商都已推出自己的产品，抢占市场份额。 2电镀填孔的影响参数 电镀填孔工艺虽然已经研究了很多，但真正大规模生产尚有待时日。其中一个因素就是，电镀填孔的影响因素很多。如图1所示，电镀填孔的影响因素基本上可以分为三类：化学影响因素、物理影响因素与基板影响因素，其中化学影响因素又可以分为无机成分与有机添加剂。下面将就上述三种影响因素一一加以简单介绍。 2.1化学影响因素 2.1.1无机化学成分 无机化学成分包括铜(Cu2+)离子、硫酸和氯化物。
(1)硫酸铜。硫酸铜是镀液中铜离子的主要来源。镀液中铜离子通过阴极和阳极之间的库仑平衡，维持浓度不变。通常阳极材料和镀层材料是一样的，在这里铜既是阳极也是离子源。当然，阳极也可以采用不溶性阳极，Cu2+采用槽外溶解补加的方式，如采用纯铜角、CuO粉末、CuCO3等。但是，需要注意的是，采用槽外补加的方式，极易混入空气气泡，在低电流区使Cu2+处于超饱和临界状态，不易析出。值得注意的是，提高铜离子浓度对通孔分散能力有负面影响。 (2)硫酸。硫酸用于增强镀液的导电性，增加硫酸浓度可以降低槽液的电阻与提高电镀的效率。 但是如果填孔电镀过程中硫酸浓度增加，影响填孔的铜离子补充，将造成填孔不良。在填孔电镀时一般会使用低硫酸浓度系统，以期获得较好的填孔效果。 (3)酸铜比。传统的高酸低铜(Cw+：Ccu2+=8～13)体系适用于通孔电镀，电镀填孔应采用低酸高铜(Cw+：Ccu2+=3～10)镀液体系。这是因为为了获得良好的填孔效果，微导通孔内的电镀速率应大于基板表面的电镀速率，在这种情况下，与传统的电镀通孔的电镀溶液相比，溶液配方由高酸低铜改为低酸高铜，保证了凹陷处铜离子的供应无后顾之忧。 (4)氯离子。氯离子的作用主要是让铜离子与金属铜在双电层间形成稳定转换的电子传递桥梁。 在电镀过程中，氯离子在阳极可帮助均匀溶解咬蚀磷铜球，在阳极表面形成一层均匀的阳极膜。在阴极与抑制剂协同作用让铜离子稳定沉积，降低极化，使镀层精细。 另外，常规的氯离子分析是在紫外可见光分光光度计进行的，而由于电镀填孔镀液对氯离子浓度的要求较严格，同时硫酸铜镀液呈蓝色，对分光光度计的测量影响很大，所以应考虑采用自动电位滴定分析。 2、1.2有机添加剂 采用有机添加剂可以使镀层铜晶粒精细化，改善分散能力，使镀层光亮、整平。酸性镀铜液中添加剂类型主要有三种：载运剂(Carrier)、整平剂(Leveler)和光亮剂(Brighte ner)。
摘要 动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。 关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略
目录 摘要 ................................................................................................................................................... I 1引言 .. (1) 2基础理论概述 (1) 2.1细胞培养的概念 (1) 2.2原代细胞培养的概念 (1) 2.3传代细胞培养 (2) 3影响细胞体外培养的因素 (2) 3.1细胞分离方法 (2) 3.1.1直接分离法 (3) 3.1.2酶消化法 (3) 3.2细胞培养温度 (3) 3.3细胞培养基的成分 (3) 3.3.1天然培养基 (3) 3.3.2合成培养基 (3) 3.4接种密度 (4) 3.5培养基的pH值 (4) 3.6细胞的冻存与复苏 (4) 3.6.1细胞冻存 (4) 3.6.2细胞复苏 (5) 4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5) 4.1无菌室的彻底消毒 (5) 4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6) 4.2.1清洗 (6) 4.2.2消毒灭菌 (6) 4.3培养试剂的分装与保存 (7) 4.4对操作者的要求 (7) 5结语 (8) 参考文献 (9) 致谢 (10)
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
2011秋季国际PcB技术/信息论坛孔化与电镀Hole Processing and Plating 填孔电镀品质可靠性的研究和探讨 Paper Code:S-021 彭涛田维丰刘晨姜雪飞彭卫红刘东 深圳崇达多层线路板有限公司 摘要填孔电镀是满足PCB高密度化、更小化、更便宜的一种重要途径。随着电子行业和PCB 行业的高速发展,填孔电镀的需求量增长迅速,填孔电镀的应用也日广泛,填孔电镀 的生产难度也相应增加。填孔电镀是一种新工艺流程,相对普通电镀铜而言,其反应 机理复杂,过程控制更难监控,品质可靠性低。本文主要讲述填孔电镀反应机理,并 通过DOE试验来探讨如何提升填孔电镀工艺能力和品质可靠性。 关键词填孔电镀i填充率 中图分类号:TN41文献标识码:A 文章编号:1009—0096(2011增刊-0153-06 The research and investigation of filling plating quality and reliability PENG Tao TIAN Wei-feng L1UChert JIANGXue-fei PENG Wei-hong L1UDong
Abstract In the process of PCB jointing brigade,the via air ladder Call bring on the jointing solder air and it will debase the jointing intension and quailty dependability,because of above.more and more customers require the via ofHDl circuitry board should be done by filling?in plating.In the relafiv9ly ofnormal plating,the reaction mechanism offilling—in plating is more complex,the process control is moFe difficult to be watched,and the quailty dependability is worse.The letterpress tell of the reaction mechanism of filling—in plating,discuss the way how to step up the technical ability offilling—in plating by DOE experiment and quailty dependability. Key words filling plating;filling ratio 1为什么需要填孔 1.1PCB高密度化、高精细化的发展趋势 随着电子产业的高密度、高精细化,HDI板焊盘直径和间距的逐渐减小,使盲孔孑L径也逐渐减小,盲孔厚径 比随之加大,普通的电镀药水和传统的电镀工艺不能达到盲孔镀铜的效果,为保证盲孔d6质的可靠性,更多生 产厂家选择专用盲孔电镀药水或增加填孔流程。 .】53. 孔化与电镀HoIeProcessing and Plaling 2011秋季国际PcB技术,信息论坛 圉1盲孔高厚径比使品质可靠性降低
静电纺丝工艺条件对复合材料中纤维形貌影响 赵小龙1,2 (1. 北京石油化工学院环境材料研究中心，北京102617；2. 北京化工大学材料科学与工程学院，北京100029） 摘要：静电纺丝是一种简单、方便的生产微米、纳米纤维的技术，其中可纺丝的材料主要包括聚合物、聚合物的混合物、聚合物与无机物的混合物。静电纺丝制得的纤维毡，具有孔隙率高、比表面积大等优点，可以用在夹心净化材料上，使过滤材料的过滤性能大大增强。本文首先简要介绍电纺丝制备原理及设备，并详细阐述下静电纺丝的主要工艺参数聚合物溶液浓度、纺丝电压、接收距离、溶剂性质和挤出速度对纤维形貌影响。 关键词：静电纺丝；纳米纤维；聚合物溶液浓度；纺丝电压；接收距离；溶剂性质；挤出速度 1 静电纺丝原理 静电纺丝是在溶液干法纺丝与熔体纺丝的基础上发展起来的，通过静电纺丝可以制备纳米或亚微米级的纤维。静电纺丝技术与传统纺丝技术有着明显的不同，即静电纺丝技术通过静电力作为牵引力来制备超细纤维。静电纺丝装置主要由三部分组成，即高压静电发生器、供给系统和接收装置，静电纺丝装置如图1所示[1]。从图中可以看出在静电纺丝工艺过程中，将聚合物熔体或溶液加上几千至几万伏的高压静电，从而在毛细管和接地的接收装置间产生一个强大的电场力。当电场力施加于液体的表面时，将在表面产生电流。相同电荷相斥导致了电场力与液体的表面张力的方向相反。这样，当电场力施加于液体的表面时，将产生一个向外的力，对于一个半球形状的液滴，这个向外的力就与表面张力的方向相反。如果电场力的大小等于高分子溶液或熔体的表面张力时，带电的液滴就悬挂在毛细管的末端并处在平衡状态。在电场力增强的过程中，喷丝口表面的液滴就会从球状液滴被拉长为锥状，这个锥就是所谓的“泰勒锥”(Taylor cone) [2]。当电场强度增加至临界值时，电场力克服液滴的表面张力，从Taylor 锥中喷出，从而产生出一个震荡、不稳定的喷射流，喷射流在喷射过程中被快速拉伸变形，在此过程中溶剂迅速挥发，在接收板上最终得到成形的纤维。Fong[3]将静电纺丝过程分为三个阶段：(1)喷射流的产生和延伸；(2)鞭动不稳定性的形成和喷射流的进一步拉伸；(3)喷射流固化形成纳米纤维。 图1 静电纺丝装置示意图 2 纳米纤维 纳米纤维主要包括两个概念：一是严格意义上的纳米纤维，是指纤维直径小
皮肤细胞培养影响因素的探究 陕西师范大学朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀 （1.朱影陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062； 2.张瑞张晓张秀秀李晓陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；） 指导老师：吴民耀副教授 【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。 【关键词】：大鲵干细胞培养 1.皮肤类干细胞的来源 目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表皮。Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有8~10个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。 Bickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。 2.皮肤类干细胞的生物学特性 目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell T A细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation unit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一T A细胞一终末分化细胞。在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。 表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0\G1期,其分裂增殖活动相对静止。在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保持不变,而其
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
霍尔槽实验在电镀填孔中的应用 程军 (麦德美(苏州)科技有限公司，江苏苏州：215121) 摘要通过对霍尔槽规格设置和填孔铜槽液调整，用霍尔槽实验确认电镀铜填孔糟光泽和 和整平剂深度。 关键词霍尔槽；电镀填孔：标准片：光泽剂；整平剂 中图分类号：T-1，TN41文献标识码一A文童编号:1009-0096(2013)01—0024—03 1前言 随着HDT板的发展。电镀填孔成为PCB重要的艺制程之一。电镀填孔的有机光泽剂有湿润剂、泽剂、整平剂一般的霍尔槽实验无法判断光剂的浓度。目前电镀填孔光泽剂采用CVS （循环伏安剥离法)分析，但由于分析时间较长，准确性也不稳定。且成本较高，因此使用受到定限制。本文主要介绍通过规范霍尔槽规格以及标净化铜槽槽液浓度，用霍尔槽实验判断填扎槽液中光泽剂和整平剂的浓度，为管控槽浓度提供方法。 2霍尔槽介绍 霍尔槽又称“哈氏槽”、“赫尔槽”，是一种对电镀溶液既简单又实用的试验槽，0，Huil先生在1939年所发明的。有267ml、534ml及1000ml二种型式，以267m1最为常用。可用以实验各种镀液，在各种电流密度下所呈现的镀层情形，以找出实际操作最佳的电流密度，属于一种“经验性”的试验[1]。霍尔槽已成为电镀研究、电镀工艺控制不可缺少的工具。 霍尔槽常用有机玻璃或硬聚氯二烯等等绝缘材料制成，底面呈梯形，阴、阳极分别置于不平行的两边(见图1)。 图1霍尔槽俯视图（体积：267mI，深底：／75Cm) 目前普通电镀使用霍尔槽对打气量没有管控，只要有打气效果即可。本实验所使用崔尔槽要求打气孔在0.2mm~0.4mm之间，打气泵可以从无到大调整气量。在制作霍尔片时必须选择合适的气量，目的是得到均匀、稳定、持续的打气效果。 3普通铜槽霍尔片制作及判断 普通电镀霍尔槽实验一般是取生产中铜槽槽液直接测试，不需要做调整即可得到实验结果，然后判断光泽剂浓度，对槽液进行调整。实验如下。 (1)试验需求。铜槽槽液、少许光泽剂、霍尔槽、整流器、打气泵、秒表、阳极磷铜块、霍尔片、微量取样器及吸管。 (2)试验方法。 ①将铜槽槽液装入267ml霍尔槽中，液位平齐标线； ②霍尔片酸洗1mini： ③将霍尔片作为阴极，铜板作为阳极，接打气泵并打开，电流强度为2A，镀5min，等待槽液霍尔片完成后水洗、吹干。 (3)判断。 ①霍尔片左侧为高电流区，在此区域，烧焦宽度小于5mm为合格，若烧焦宽度大于5mm，则可以以微量吸管添加光泽剂，再重复试验(注：铜槽药水一次最多只能镀(3～4)次，再多则失效[2])。 ②若高电流区完全没有烧焦，而霍尔片右侧低电流区现云雾状态，说明光泽剂过量。 4电镀填孔铜槽霍尔片制作及判断 电镀填孔槽液一般采用高铜低酸型(硫酸铜：200g／L；硫酸：100g／L；氯离子：70×10-6)，而光剂成分较为复杂，一般为三剂型，分别为润湿剂、光泽剂和整平剂。其中湿润剂相对比
影响PA6静电纺丝的因素： 溶剂甲酸 浓度不同所需要的电场力也不同,浓度越高,所需要的电场力越大,所需施加的临界电压值也越大,以克服表面张力而达到喷出纤维的目的。 电压影响 当电场足够强时,电场力就克服表面张力使其与电场力达到平衡的临界状态,在喷丝头顶部的聚合物溶液微滴成为锥状,同时形成纤维喷出。超过临界电压时,微滴的锥状体变小,喷射更有力,所得纤维的直径有所变化。当电压值从8kV增加到12kv时,纤维的平均直径明显变小。但当电压达到15kV后,再增加电压纤维平均直径没有太大变化,且在实验中还发现,电压过大时,有静电火花产生,因此,宜选择电压值为15kV。 距离的影响 TCD对纤维平均直径的影响与电压对纤维平均直径的影响有类似的结果。当TCD超过5Cm 时,纤维平均直径有所变小,TCD大于10cm后,纤维的平均直径变化不大。但当TCD大于25。m时,收集板就难以收集到纤维。这可能是因为TCD超过一定范围后,电场的强度减弱,喷射出的纤维失去了电场的控制所致。另外,在纺丝过程中发现,较近的纺丝距离容易使纺丝液的微滴喷到收集板上。因此,宜选择TCD值为20cm. 结论： 溶液浓度是影响PA6溶液静电纺丝的主要因素。溶液浓度过小,喷出微小的液滴,得不到连续的纤维,浓度过大,在所施加的电场力范围内,也难得到纤维或得到的纤维直径过大。较低浓度纺丝时,有纺锤状纤维产生,随溶液浓度提高,纺锤状纤维消失。在一定条件下,当PA6质量分数为5%一n%时,可得到直径小于100nm的纤维。不同浓度对应不同的临界电压值,浓度高临界电压值就高;在电压和纺丝距离较小时,纤维直径较大。 最佳纺丝条件：PA6溶液质量分数为8%、电压值为15kV、TCD值为20。m为PA6静 电纺丝的最佳工艺条件。 稀土PA6电纺的影响因素 用盐酸加甲酸为溶剂 固定溶液浓度为16 % ，溶剂总体积为8 0m l ，络合比为0. 1。静电参数中，外加电压为 17 k v，泵速度为0 .0 4 mm / mi n ，摆动速度为10 . 0 0c m / m i n 。调整溶剂配比，盐酸与甲酸比为 1 :3 、1: 4 、1: 5 、1: 6 。 随着溶剂比减小，盐酸含量减少，纤维的直径逐渐变大。 不同浓度对PA6/Gd的影响 固定溶剂比为1 :3 ,溶剂总体积为8 0m l ，络合比为0. 1 。静电参数中，外加电压为17 kv ， 泵速度为0. 04 m m / mi n ，摆动速度为 1 0. 0 0c m / m i n 。改变溶液浓度，自制PA 6 浓度变化为4% 、6 %、8 % 、1 0 % ，切片PA 6 浓度变化为12 % 、1 4 % 、16 % 。
细胞培养中常见的污染情况总结如下: 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所
电镀盲孔填孔不良分析 目前多阶HDI板的层间互连大多采用微孔叠孔及交错连接方式设计，一般采用电镀铜填孔方式进行导通，但电镀填盲孔技术与传统电镀有一定差别，且在工艺参数，流程设计，设备方面更有严格要求，填孔过程中出现空洞、凹陷、漏填也是厂内控制的难点，下面将厂内填孔缺陷进行分析，提供些填孔不良的思路； 一、填孔不良分析： 针对厂内填孔不良切片分析分类，统计如下： 二、原因分析： 通过切片分析确认，不良主要为凹陷、漏填、空洞，其中凹陷、漏填比例较高，其次为空洞，现针对厂内填孔不良可能原因进行分析. 2.1添加剂浓度失调：盲孔的填孔主要是通过添加剂中各组成分的协调作用、吸附差异平衡化完成，浓度失控势必会造成添加剂在盲孔内吸附平衡的破坏影响填孔效果. 2.2打气喷管堵塞：填孔槽打气大小直接影响到填孔过程中孔内药水交换效果，若打气效果差必然会造成孔内药水交换导致填孔效果欠佳凹陷值偏大.
2.3导电性不良：夹头或挂具损坏、飞靶和V型座接触不好，导致电流分布不均，板内电流小区域必然会出现盲孔凹陷或漏填现象. 2.4填孔前微蚀异常：填孔前微蚀不足均可能导致个别盲孔孔内导电不良，孔内电阻偏高，在填孔时不利于添加剂分布导致填孔失败. 2.5板子入槽时变形导致局部盲孔突起，局部盲孔漏填或凹陷. 2.6泵浦吸入口漏气，必然会造成大量空气进入槽内，通过过滤泵循环过滤将起泡带入整个槽内通过气流进入盲孔，阻碍孔内药水交换导致盲孔漏填现象. 三、效果验证： 实验前通过对药水调整至最佳状态，检查打气管道、夹头（挂具）、打气状况，维修设备接触不良处并用稀硫酸清洗、微蚀速率控制在20—30u”,保证板为垂直状态后进行填孔测试，测试结果无异常. 四、结论： 通过改善前后对比可以看出：厂内填孔不良主要为药水浓度、打气、导电性、填孔前微蚀量异常及槽内有气泡导致填孔异常，当然影响盲孔填孔异常的因素还有很多，只有平时做到长期监控，细心维护设备，认真排查造成填孔不良的每一个可能因素，才能真正运用好填孔技术，解决厂内填孔异常.
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法 细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度