生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ?研究报告?２００８年第４期
收稿日期：２００８－０２－２１
基金项目：河南省科技攻关项目（０６２４４２００１６）
作者简介：竺俊鑫（１９７９－），男，硕士研究生
通讯作者：孟丽（１９５９－），女，汉族，河南睢县人，教授，硕士生导师，主要从事植物资源及利用的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｉｓｔｍｌ＠１６３．ｃｏｍ
前言
紫杉醇的国际通用名为Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，商品名Ｔａｘｏｌ［１］，是１９７１年美国学者Ｗａｎｉｅｔａｌ［２］从短叶红豆杉（ＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａＮｎｔｔ．）的树皮中提取的一种四环二萜类化合物。作为一种天然的次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效［３￣５］。紫杉醇是近年来在抗癌领域的最重大发现之一，已于１９９２年被美国食品和药物管理局（ＦＤＡ）批准为治疗转移性卵巢癌的新药并已上市。
红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究
竺俊鑫１
李勇超２孟丽２（１河南师范大学生命科学学院，新乡４５３００７；２河南科技学院生物技术系，新乡４５３００３）
摘要：目的探讨红豆杉不同部位在内生真菌分离效率以及产紫杉醇菌株筛选率方面的规律性，为红豆杉产紫
杉醇内生菌菌株的分离与筛选提供一定的理论依据。方法从根、茎、叶３个器官取大小和表面积相同的太行山野生红豆
杉（Ｔａｘｏｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）材料，用组织块法分离红豆杉内生真菌，计算各部位内生真菌的分离效率；用高效液相法对分离到的内生真菌发酵液提取物进行紫杉醇含量分析，计算各部位产紫杉醇内生真菌的筛选率。结果
共分离到１０９株红豆杉内生真菌，根部、茎部和叶部分离效率指数分别为０．９０、０．６３和０．２８；其中有２８株产紫杉醇，紫杉醇菌株筛选率分别为３１．４８％、２１．０５％和１７．６５％。结论
在内生真菌的分离效率及其产紫杉醇内生真菌的筛选率上，均为根部﹥茎部﹥叶部，即根部在内生真菌分离效率和筛选产紫杉醇内生真菌效率上均具有明显的优势。
关键词：内生真菌紫杉醇高效液相色谱分离部位ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰａｒｔｓｏｆＴａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃＦｕｎｇｉｆｒｏｍＴ．ｃｈｉｎｅｓｉｓｉｎＴａｉｈａｎｇＭｏｕｎｔａｉｎ
ＺｈｕＪｕｎｘｉｎ１ＬｉＹｏｎｇｃｈａｏ２ＭｅｎｇＬｉ２
（１ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｉｔｕａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｏｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴａｘｕｓｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＴａｘｏｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｃｅｒｔａｉｎｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｎｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｍａｔｅｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｓｉｚｅｆｒｏｍｒｏｏｔ、
ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅａｃｈｐａｒｔｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＴｈｅｔａｘｏｌｃｏｎｔｅｎｔｓｆｒｏｍｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｌｉｑｕｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨＰＬＣ．ＡｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ１０９ｓｔａｉｎｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＴ．ｃｈｉｎｅｓｉｓｇｒｏｗｉｎｇｉｎＴａｉＨａｎｇｍｏｕｎｔａｉｎ，ｔｈｅｉｒｉｓｏｌａｔｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｄｅｘｅｓｗｅｒｅ０．９０，０．６３ａｎｄ０．２８ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｉｇ，ａｎｄ２８ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｓｔｒａｉｎｓｃａｎｐｒｏｄｕｃｅｔａｘｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔａｉｎｓｗｅｒｅ３１．４８％，２１．０５％ａｎｄ１７．６５％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｆｏｌｌｏｗｅｄｌｉｋｅｔｈｉｓｒｏｏｔ＞ｓｔｅｍ＞ｌｅａｆ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｎｔｈａｔｒｏｏｔｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｄｖａｎｔａｇｅｏｎｉｓｏｌａｔｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔａｘｏｕｓｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ，ａｎｄａｌｓｏｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｎｄｏｐｈｔｉｃｆｕｎｇｉＴａｘｏｌＨＰＬＣＩｓｏｌａｔｉｏｎｐａｒｔｓ
生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ２００８年第４期１９２
目前紫杉醇主要从红豆杉中提取。红豆杉属于濒危树种，生长又极慢，大量砍伐势必造成红豆杉资源的枯竭。因此寻找生产紫杉醇的替代原料，已成为摆在人类面前的重大课题。１９９１年Ｓｔｉｅｒｌｅ与Ｓｔｒｏｂｌｅ［６］首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌Ｔａｘｏｍｙｃｅｓａｎｄｒｅａｎａｅ，其紫杉醇含量为２４～５０ｎｇ／Ｌ，为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径。
目前，产紫杉醇内生真菌的分离部位茎叶研究居多，根部研究得较少；而且，分离和筛选产紫杉醇内生菌尚缺乏系统的研究，特别是不同部位内生真菌产紫杉醇菌株的数量和紫杉醇含量方面的规律性尚未见报道。以太行红豆杉的不同部位为材料，分离培养其内生真菌，并对其含紫杉醇菌株含量规律进行了测定，初步探讨了红豆杉中不同部位产紫杉醇内生真菌的数量及紫杉醇含量的规律性，以期为红豆杉产紫杉醇内生菌菌株的分离与筛选提供一定的理论依据。
１材料与方法
１．１材料
分离材料来源于河南省太行山辉县八里沟的野生红豆杉，经鉴定为红豆杉Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ，分别采集根、茎、叶３个不同部位的组织为供试材料。
１．１．１培养基固体培养基为ＰＤＡ培养基，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，在超净工作台内倒平板。
液体培养基也为ＰＤＡ培养基，只是不加入琼脂，分装至２５０ｍｌ三角瓶中，每瓶６０ｍｌ，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。１．１．２药品紫杉醇标品购买于ＳＩＧＭＡ公司，ＨＰＬＣ流动相甲醇为色谱纯，水为三蒸水，其他试剂均为分析纯，均购买于天津科密欧化学试剂有限公司。
１．２方法
１．２．１内生真菌分离将采集到的红豆杉根皮和树皮切成与叶片大小大致相同的小段，叶片大小自然，分别经７５％的酒精消毒５ｍｉｎ和０．１％升汞消毒８ｍｉｎ，然后用无菌水冲洗３遍，接种于ＰＤＡ固体培养基平皿上，每一部位的材料接２０皿，每皿均放３小段，共接６０皿。放置于２５℃恒温箱中培养，待长出菌落后，按无菌操作程序挑出，在ＰＤＡ斜面培养基上纯化３次以上，然后将纯化后保存在ＰＤＡ斜面培养基上的菌株放入冰箱中４℃保藏备用。
１．２．２内生真菌的液体培养将分离纯化后得到的内生真菌进行摇床液体培养，培养３ｄ后取６ｍｌ接入２５０ｍｌ三角瓶中，２８℃，２２０ｒ／ｍｉｎ每瓶６０ｍｌ培养７ｄ。
１．２．３紫杉醇含量的检测
１．２．３．１样品溶液制备用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的二氯甲烷萃取，取水相部分再用等体积的二氯甲烷萃取１次［８］，菌丝部分经液氮研碎，超声３０ｍｉｎ，静置过夜后用等体积的二氯甲烷萃取，重复处理１次，将所有的二氯甲烷萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在３５℃下减压蒸馏至干，溶解于少量甲醇中，用０．４５μｍ滤膜过滤，定容至１０ｍｌ备用。
１．２．３．２标品溶液配制精确称取紫杉醇标准品１．０ｍｇ，用１０ｍｌ甲醇溶解，配成１００ｍｇ／Ｌ母液备用。将母液稀释成４，８，１６，３２，６４ｍｇ／Ｌ的系列标准品溶液。
１．２．３．３色谱条件日本岛津ＨＰ２０１０Ｃ高效液相色谱仪，Ｃ１８柱（１５０ｍｍ×４６ｍｍ）；流动相，甲醇：水（ｖ／ｖ）＝６０：４０；流速０．７ｍｌｍｉｎ［９］，检测波长２２８ｎｍ，灵敏度，０．１ＡＵＦＳ，柱温３５℃，进样量２０μｌ。
２结果与分析
２．１内生真菌的分离结果
从红豆杉组织中共分离内生真菌１０９株，根、茎、叶分别为５４、３８、１７株，所占百分比分别为４９．５％，３４．９％，１５．６％，分离效率值分别为０．９０，０．６３，０．２８（表１）。
由于在实验中每个部位均接２０皿，每皿放３个小段，即各分离部位材料总数完全一致，所以各部位分
２００８年第４期离菌株数占分离到的总菌株数的百分比和分离效率
值能反映出该部位分离内生真菌的能力，进而体现
该部位在分离内生真菌数量上的优势。从表１明显
看出，无论是所占百分比还是分离效率值，根﹥茎﹥
叶，表明在同样条件下，根在分离内生真菌的数量和
效率方面具有明显优势。２．２紫杉醇含量的检测结果
２．２．１标准曲线的确定取所配的紫杉醇标准品溶液，以峰面积
对浓度进行得出标准曲线，其回归方程为Ｙ＝２．６９８７１４ｅ－００５）Ｘ＋
０．２７６６１２９Ｒ＝０．９９９９９０４。结果表明，紫杉醇在４～６４ｍｇ／Ｌ范围内呈
良好的线性关系（图１）。
２．２．２发酵提取物的检测结果紫杉醇标准品和１０９株内生真菌
发酵提取物的ＨＰＬＣ检测结果见表２、
图２和图３。在相同色谱条件下，紫杉醇标准品的保留时间为２９．１４１ｍｉｎ，共有２８株内生真菌
发酵提取物在标品保留时间处，有一对应峰出现，即检测到２８株
产紫杉醇的内生真菌。表１根、茎、叶内生真菌的分离结果注：分离效率指数＝分离到的菌株数量÷分离材料小段总数
图１紫杉醇标准曲线图
图２紫杉醇标准品的色谱图图３含紫杉醇的内生真菌发酵提取物的色谱图
由表２可知，产紫杉醇的菌株分别来自于根、茎、叶的数量为１７、８、３；由表１和表２可计算出根、茎、叶产紫杉醇菌株筛选率分别为３１．４８％、２１．０５％和１７．６５％；紫杉醇含量平均含量分别为２３５．８４μｇ／Ｌ，１３３．７６μｇ／Ｌ，９９．７４μｇ／Ｌ，３个部位产紫杉醇菌株筛选率和紫杉醇平均含量比较见图４。从上述数据可知，根部分离的内生真菌产紫杉醇菌株筛选率最高，达３１．４８％，且紫杉醇含量也较高。
表２２８种内生真菌紫杉醇含量测定结果
图４产紫杉醇内生真菌菌株的筛选率和
紫杉醇的平均含量
竺俊鑫等：红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究１９３
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３讨论
自从１９９１年Ｓｔｉｅｒｌｅ与Ｓｔｒｏｂｌｅ［６］筛选出第一株产紫杉醇内生真菌以来，国内外学者相继开展了筛选产紫杉醇内生真菌的研究，例如，邱德有等［５］分离出一株产紫杉醇内生真菌，产率非常低；马天有等［１０］分离得到一株能产紫杉醇的内生真菌，产量为１４１．２０μｇ／Ｌ；；周东坡等［１１］产紫杉醇的内生真菌，产量可达５１．０６～１２５．７０μｇ／Ｌ；胡凯等［１２］分离到三株紫杉醇产生菌，最高一株产量为２７６．７５μｇ／Ｌ。综观以往研究，产紫杉醇菌株的产率较低，仍达不到真菌发酵工业化生产紫杉醇的盈亏平衡点（１ｍｇ／Ｌ）。以往研究中红豆杉材料的采集部位几乎都集中在树皮和小枝，根部极少涉及，仅李长田等［１３］较全面地从东北红豆杉根、茎、叶中分离到７８株内生真菌，经检测有４株含有紫杉醇，但均不属于根部内生真菌。可见根部组织在筛选产紫杉醇内生真菌菌株方面的研究工作还比较薄弱。
从试验结果可以看出，从根部分离和筛选出的含紫杉醇内生真菌在数量和紫杉醇含量上与茎、叶相比均具有明显的优势（表１、表２和图４），与李长田［１３］等研究结果相比，从根部不仅分离到产紫杉醇的多个内生真菌菌株，而且多属于高产菌株，其中一株产量高达５１５．２０μｇ／Ｌ，为迄今报道的产紫杉醇内生真菌产量最高的野生菌株［９￣１３］（此研究结果将另文发表）。由此可见根部的内生真菌更有研究价值。红豆杉根部产紫杉醇内生真菌的高产性可能与其属于菌根菌有关，菌根菌作为真菌和植物根的互利共生体，能提高宿主植物抗逆性，紫杉醇作为红豆杉抵御不良环境而产生的抗毒素，是受防御性基因调控的次生代谢产物［１４］。而根部和其他部位相比，菌根菌、土壤和植物形成一种更为复杂的生态复合体，受不良环境的影响更大，在长期的进化过程中，其抗逆能力更强，防御性基因更多更全面，产生的次生代谢产物紫杉醇相应可能更多一些，但详细的机理还需要进一步研究。
参考文献
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第六章紫杉醇的生产工艺 6.1 概述 6.1.1 紫杉醇类药物 1、紫杉醇 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?）的化学名称为5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,13α-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-[(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] ，英文化学名称为13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-benmethyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate。 紫杉醇具有复杂的化学结构，属三环二萜类化合物，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成（图6－1）。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式为C47H51NO14，分子量为853.92，元素百分比为C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。紫杉醇难溶于水，易溶于甲醇、二氯甲烷和乙氰等有机溶剂。 图6－1 紫杉醇的化学结构 2、多烯紫杉醇 多烯紫杉醇（多西他赛，Docetaxel，Taxotere?，图6－2）是在开展紫杉醇半合成研究过程中发现的一种紫杉醇类似物，两者仅在母环10位和侧链上3'位上的取代基略有不同。多烯紫杉醇的化学名称是5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,10β,13α-六羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2′R,3′S) -N-叔丁氧羰基-3′-苯基异丝氨酸酯]·三水合物，英文化学名称为-13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-tertbutyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,10β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate 。分子式为C43H53NO14·3H2O，相对分子质量为861.9。 1985年，法国罗纳普朗克乐安公司（Rhone-Poulenc Rorer）公司和法国国家自然科学研究中心（CNRS）以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目
紫杉醇规模生产工艺及方案（1500吨/年规模） 一、项目规模生产工艺方案 1、紫杉醇概述紫杉醇具有复杂的化学结构，母核部分是一个复杂的四环体系，有许多的功能基团和立体化学特征，化学名称为：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子由3个主环构成二萜核，上连1个苯异丝氨酸侧链，分子中有11个手性中心和多个取代基团，分子式为C47H51NO14，相对分子质量853.92，元素百分比（%）C：66.41，H:6.02，N:1.64，O:26.23。紫杉醇结构式为：紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。甲醇制3mg/ml 的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每咸的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外（﹥90%），经肾清除只占总清除的1%~8%。 红豆杉浸膏
1.1操作过程： （1）浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 （2）浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。（3）萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 （4）干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为-0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 1.2紫杉醇粗制工艺步骤 1.2.1操作过程 （1）配料、装柱：将紫杉醇浸膏约100kg按物料、重量比1：1的比例加入100-200目的硅胶搅拌均匀，真空干燥，装柱。 （2）一次层析、浓缩：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷
红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化 1绪论 1.1引言 肿瘤的治疗在很大程度上依赖于抗肿瘤药物，抗肿瘤药物研究方兴未艾。紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉树皮中分离提纯得到的植物抗肿瘤药，已有40余年的研究历史。由于其具有良好的抗癌活性和独特的抗癌机理，因而被认为是抗癌药物的“明星”。自1992年以来，紫杉醇已在许多国家成为治疗卵巢癌和乳腺癌的重要药物[1]。 由于紫杉醇的药源植物——红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量很低(低于为树皮干重的0.015%)，而现有的资源又有限，因而紫杉醇的供应一开始就受到人们的关注。 多年来人们一直在寻找能替代直接从植物中提取紫杉醇的方法[2、3]。紫杉醇的化学全合成虽已完成，但路线复杂，目前无商业价值；紫杉醇的半合成在一定程度上为缓解紫杉醇的供求矛盾；近年来分别从红豆杉属（Taxus）中的短叶红豆杉（T. brevifolia Nutt.）、云南红豆杉（T. yunnanensis）、西藏红豆杉（T. wallichinana）等树皮中分离中得到能产生紫杉醇的内共生真菌，这无疑为解决紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。 1.2内共生真菌 内共生真菌(endophytic fungus)是一大类尚未被充分认识的真菌，它泛指那些生活在健康植株中而不引起任何明显病害症状的所有真菌。在整个真菌发展史上，内共生真菌的研究历史并不长[4]。 1924年，Lewis首次报道禾本科植物叶片中存在内共生真菌，但此后的研究工作一直很少，直到近30年，对于植物内共生真菌的研究才趋于活跃。自从A. Stierle证明Taxus brenifoli a nutt中的内共生真菌Ｔaxomyces andreanae可以产生紫杉醇，对于植物内共生真菌的研究更加引人瞩目[5]。 目前为止，内共生真菌生产紫杉醇产量也极低，这就需要进行多方面的研究。本课题是以不同的碳源种类和配比对红豆杉内共生真菌发酵培养条件优化的研究。 1.3本论文研究的内容 碳源在微生物中是用于合成菌体的含碳物质及其骨架，并为微生物代谢提供能量。除自养菌能以CO2作为唯一碳源外，大多数微生物是以有机含碳的化合物做为碳源和能源。 红豆杉内共真菌发酵培养选用的碳源一般有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等。糖类的种类和浓度对细胞生长的影响很大，本试验运用正交试验设计对发酵培养基的碳源进行优化。 2.材料和方法 2.1.材料 2.1.1试剂 葡萄糖AR 中国医药集团上海化学试剂公司麦芽糖BA 上海生物化学试剂公司 蔗糖AR 上海化学试剂有限公司
紫杉醇的提取和性能 姓名：高海艳 学号：51151300057 专业：种子植物分类学
紫杉醇的提取和性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇（T axol）是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1]（结构如图一所示），是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）和东北红豆杉（Taxus cuspidata）的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用，主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌[2]，被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉（Taxus cuspidata）幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材，幼苗的紫杉醇含量高低依次则是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外，对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究，结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉，再次为红豆杉；而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]： 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取
细胞密度 确定接种细胞培养时间 确定培养基 细胞悬浮培养配制培养基 2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]： 三、紫杉醇药用功能及体制液—液萃取 己烷沉淀 硅胶柱层析 结晶 TLC检测高效液相色谱检测 诱导愈伤组织 配制培养基添加植物激素 制备及接种外植体红豆杉幼茎30 天 转 接 继代培养筛选抗褐化剂 柠檬酸 VC 活性炭 确定愈伤组织 直接继代 剥离后继代 分离检测紫杉醇TLC-紫外分光光度法 多次继代至生长稳定 筛选高产细胞株培养方式 普通平板培养 条件培养 看护培养 植板率 稳 定 高 产 细 胞 株 添加多种代谢调节因子 确定培养方式小剂量连续添加一次性大剂量添加 确定代谢调节因子加入时间 高效诱导体系
苏州大学研究生考试答卷封面 考试科目: 有机合成考试得分 院别: 材料与化学化工学部专业: 分析化学 学生姓名: 饶海英学号: 20114209033 授课教师: 考试日期: 2012 年 1 月8 日 天然抗癌药物紫杉醇的合成进展 摘要:本文对多烯紫杉醇的合成的各种合成方法进行了综述。 关键词:多烯紫杉醇合成抗癌 多烯紫杉醇(daxotere) 商品名为多西她赛(Docetaxel) , 化学名为[ 2aR-( 2aα, 4β, 4aβ, 6β,9α, ( aR3, βS3) , 11α, 12α, 12aα, 12bα) ] -β- [ [ (1, 1 2二甲基乙氧基)羰基]氨基] -α-羟基苯丙酸[ 12b-乙酰氧-12 -苯甲酰氧-2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b -十二氢-4, 6, 11-三羟基-4a, 8,13, 13 -四甲基-5-氧代-7, 11-亚甲基-1H-环癸五烯并-[ 3, 4 ]苯并[ 1, 2-b ]氧杂丁环-9-基]酯,就是法国罗纳普朗克·乐安公司开发的半合成紫杉醇的衍生物,它对晚期乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、头颈部癌、胃癌等均有效。其作用机制就是通过与肿瘤细胞微管蛋白结合, 加强微管蛋白的聚合、抑制微管解聚,最终形成稳定的非功能性微管束, 从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂与增殖[1-3] 。 商业化生产的紫杉醇类抗癌药物大多采用半合成方法,这就是现阶段最具经济性与可操作性的合成方法。多烯紫杉醇的半合成方法就是利用从红豆杉属植物的针叶中提取的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ (10-DAB ) ,通过选择性保护部分羟基, 然后在10-DAB C13位的羟基上连接合成的手性侧链, 再去掉保护基团得到。其中以多烯紫杉醇C13位侧链的合成以及该侧链与选择性保护的母核10-DAB进行酯化反应最为重要[4-5] 。 紫杉醇的构效关系已经被众多学者所研究与总结。具有游离羟基的C13位侧链,C2与C4位的酯基,C4、C5位四元含氧环及紫杉烷的刚性环结构对抗癌活性都起着很重要的作用。 1988年,Potier等从欧洲紫杉(Taxus baccata)中分离得到10-去乙酰巴卡亭(Baccatin) Ⅲ( DAB),DAB 已被成功地用来半合成紫杉醇,并已工业化生产[6]。半
生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ?研究报告?２００８年第４期 收稿日期：２００８－０２－２１ 基金项目：河南省科技攻关项目（０６２４４２００１６） 作者简介：竺俊鑫（１９７９－），男，硕士研究生 通讯作者：孟丽（１９５９－），女，汉族，河南睢县人，教授，硕士生导师，主要从事植物资源及利用的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｉｓｔｍｌ＠１６３．ｃｏｍ 前言 紫杉醇的国际通用名为Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，商品名Ｔａｘｏｌ［１］，是１９７１年美国学者Ｗａｎｉｅｔａｌ［２］从短叶红豆杉（ＴａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａＮｎｔｔ．）的树皮中提取的一种四环二萜类化合物。作为一种天然的次生代谢产物，经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效［３￣５］。紫杉醇是近年来在抗癌领域的最重大发现之一，已于１９９２年被美国食品和药物管理局（ＦＤＡ）批准为治疗转移性卵巢癌的新药并已上市。 红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研究 竺俊鑫１ 李勇超２孟丽２（１河南师范大学生命科学学院，新乡４５３００７；２河南科技学院生物技术系，新乡４５３００３） 摘要：目的探讨红豆杉不同部位在内生真菌分离效率以及产紫杉醇菌株筛选率方面的规律性，为红豆杉产紫 杉醇内生菌菌株的分离与筛选提供一定的理论依据。方法从根、茎、叶３个器官取大小和表面积相同的太行山野生红豆 杉（Ｔａｘｏｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）材料，用组织块法分离红豆杉内生真菌，计算各部位内生真菌的分离效率；用高效液相法对分离到的内生真菌发酵液提取物进行紫杉醇含量分析，计算各部位产紫杉醇内生真菌的筛选率。结果 共分离到１０９株红豆杉内生真菌，根部、茎部和叶部分离效率指数分别为０．９０、０．６３和０．２８；其中有２８株产紫杉醇，紫杉醇菌株筛选率分别为３１．４８％、２１．０５％和１７．６５％。结论 在内生真菌的分离效率及其产紫杉醇内生真菌的筛选率上，均为根部﹥茎部﹥叶部，即根部在内生真菌分离效率和筛选产紫杉醇内生真菌效率上均具有明显的优势。 关键词：内生真菌紫杉醇高效液相色谱分离部位ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰａｒｔｓｏｆＴａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃＦｕｎｇｉｆｒｏｍＴ．ｃｈｉｎｅｓｉｓｉｎＴａｉｈａｎｇＭｏｕｎｔａｉｎ ＺｈｕＪｕｎｘｉｎ１ＬｉＹｏｎｇｃｈａｏ２ＭｅｎｇＬｉ２ （１ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｉｔｕａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００７） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｏｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴａｘｕｓｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＴａｘｏｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｃｅｒｔａｉｎｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｎｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｍａｔｅｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｓｉｚｅｆｒｏｍｒｏｏｔ、 ｓｔｅｍａｎｄｌｅａｆ．Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅａｃｈｐａｒｔｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ＴｈｅｔａｘｏｌｃｏｎｔｅｎｔｓｆｒｏｍｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｌｉｑｕｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＨＰＬＣ．ＡｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ１０９ｓｔａｉｎｓｏｆｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＴ．ｃｈｉｎｅｓｉｓｇｒｏｗｉｎｇｉｎＴａｉＨａｎｇｍｏｕｎｔａｉｎ，ｔｈｅｉｒｉｓｏｌａｔｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎｄｅｘｅｓｗｅｒｅ０．９０，０．６３ａｎｄ０．２８ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｉｇ，ａｎｄ２８ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉｓｔｒａｉｎｓｃａｎｐｒｏｄｕｃｅｔａｘｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔａｉｎｓｗｅｒｅ３１．４８％，２１．０５％ａｎｄ１７．６５％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｆｏｌｌｏｗｅｄｌｉｋｅｔｈｉｓｒｏｏｔ＞ｓｔｅｍ＞ｌｅａｆ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｎｔｈａｔｒｏｏｔｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｄｖａｎｔａｇｅｏｎｉｓｏｌａｔｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔａｘｏｕｓｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ，ａｎｄａｌｓｏｏｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＴａｘｏｌ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥｎｄｏｐｈｔｉｃｆｕｎｇｉＴａｘｏｌＨＰＬＣＩｓｏｌａｔｉｏｎｐａｒｔｓ
紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。
植物内生真菌研究进展 植物内生真菌（Endophytic fungus）是指在生活史中某一阶段或整个阶段存在于健康植物组织内部，对植物组织没有引起明显病症或对宿主没有造成明显伤害的真菌。内生真菌在植物组织中普遍存在，具有丰富的物种多样性。它是生活在植物组织内的一类微生物, 是植物微生态系统中的天然组成成分，且长期生活在植物体内的特殊环境中, 与寄主协同进化, 根据内共生理论, 内生真菌可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。1898年，Vogl等人从黑麦草Lolium temulentum L. 种子内分离出第一株内生真菌，引起了人们对植物内生真菌的注意。特别是美国学者从短叶红豆杉Taxus brevifolia的韧皮部分离到一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌，更是掀起了各国学者对内生真菌的研究热潮。 1 植物内生真菌的研究方向 内生真菌活性成分的筛选有两条思路。一是根据部分内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力这一特点，从药用植物中寻找具有合成确定化合物的内生真菌，常用方法是对分离得到的内生真菌培养液提取物通过色谱技术、单克隆抗体免疫检测等手段来确定该内生菌是否有产生目的化合物的能力。这一思路目标明确、针对性强、工作量相对较小，是目前从内生真菌中筛选活性物质的主要方法，采用这种方法已从多种资源缺乏的药用植物的内生菌中分离得到了和宿主植物相同或相似的活性物质。这种思路具有一定的偶然性，因为不能证实所有的植物中都存活着具有合成和宿主植物相同或相似活性物质的内生真菌。二是按照传统的化合物分离纯化鉴定的思路，寻找未知但具有特定活性的化合物。首先是按照目的选择不同的筛选模型进行活性菌株的筛选。其次是对筛选出的活性菌株发酵培养、分离纯化活性物质，再对活性物质进行理化研究及结构鉴定。 2 内生真菌药用活性物质及其生物学作用 2.1 抗肿瘤活性物质 2.1.1萜类化合物 紫杉醇是存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物, 被当今世界上认为是广谱、活性最强的抗癌药物。由于紫杉属植物中紫杉醇含量极低，加之紫杉属植物生长极其缓慢，自然资源非常缺乏。1993 年美国学者Stierle 等首次从短叶紫杉( Taxus brevifolia) 的韧皮部中分离出一种新的内生真菌( Taxomyces an2dreanae)，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物。这一发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径，并成为从药用植物中分离内生菌热潮的开端。2006年, 田仁鹏等从生长在
抗癌药物 ——紫杉醇 一、前沿 1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。 紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机理，现主要用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌等癌症。紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基。其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。先后共有30多个研究组参与研究，实属罕见。经20多年的努力，于1994年才由美国的R．A．Holton与K．C．Nicolaou两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和I．Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。6条合成路线虽然各异，但都具有优异的合成战略，把天然有机合成化学提高到一个新水平。 紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗.紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物,其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐,使其成为20世纪下半叶举世瞩目的抗癌明星和研究重点,包括寻找新的生物资源、化学全合成、半合成、衍生物制备、生物转化、生物合成、生物工程、构-效关系研究、作用机制研究、药理学和药效学等研究.2011年是发现紫杉醇结构40周年,对紫杉醇发现的曲折历史过程进行回顾和总结,以纪念这一伟大发现并纪念为紫杉醇的研究与第二代紫杉醇的开发作出贡献的科学家。 二、紫杉醇的制备 1.1 天然红豆杉植物提取 紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种的提取红豆杉属植物共11种，我国有4种及1种变种，它们分别是云南红豆杉、西藏红豆杉（又名喜马拉雅红豆杉）、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉（又名美丽红豆杉）。由于这些植物数量极少，自身繁殖率低，生长缓慢，且紫杉醇的含量又极低（每千克干树皮最多只能得到50~150mg 的纯紫杉醇），生产1g紫杉醇需砍伐3~4棵60年树龄的大树。在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物树皮中提取必将给红豆杉属植物的在自然界中的生存带来极大的威胁。但由于从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此，人们可利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题. 1.2人工栽培
紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学
紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀
2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。
紫杉醇综述 摘要：紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机制，它的问世被誉为20世纪90年代国际上的抗癌药三大成就之一。本文综述了近年来对红豆杉的资源概括、抗癌机制、化学成分、制备方法、不良反应等方面的新研究进展，对当前工作中存在的问题进行了探讨。 关键词：紫杉醇、红豆杉、抗癌、植物组培、不良反应 前言 全世界60亿人口中，每年约新增800万癌症患者，600多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。癌症严重地威胁着人类的生命和健康，因此寻找有效的抗癌药物成为研究的热点。早在1958年美国癌症协会就发起一项历时20余年、筛选35000多种植物物种提取物的计划。在计划实施过程中，1963年美国化学家瓦尼和沃尔首次从生长在美国西部大森林中称太平洋杉中分离到了紫杉醇的粗提物。并发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性。由于该活性成份含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇。1992年12月紫杉醇被FDA批准上市，目前紫杉醇已成为世界公认的强活性广谱抗癌药物。然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物[1]。 一红豆杉资源 紫杉又名红豆杉、赤柏松，为紫杉科紫杉属长绿针叶乔木，是世界珍稀濒危物种，国家一级保护植物。因其药用价值巨大，世界各国将其列为“国宝”，素有“植物黄金”之称。目前在我国共有4个种和1个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）。但在我国资源并不丰富。 [2]野生红豆杉一般散生在海拔2500-3000米的深山密林中，成材需50-250年，
紫杉醇 商品名：泰素?，Onxal TM 药物分类： 紫杉醇是抗肿瘤化学治疗药物，紫杉醇可分类为，植物碱类药物，紫衫烷类，抗微管生产药物（详见“治疗机制”）。 紫杉醇主要用于治疗： ?乳腺啊 ?肺癌 ?膀胱癌 ?前列腺癌 ?黑色素瘤 ?食道癌 ?卡波氏肉瘤 ?各种实体肿瘤 如果该药物已经批准使用，医生有时会选择使用该药物对于其他诊断，当他们认为紫杉醇可能是有用的时候。 紫杉醇如何给药： ?紫杉醇通过静脉注射或者滴注 ?紫杉醇是刺激性药物，静脉给药会出现血管炎症，如果漏液会出现局部组织坏死。医生，护士在给予紫杉醇时要小心谨慎。当您在使用紫杉醇时，给药部位出现红肿刺痛的情况，请立即联系您的医生。 ?紫杉醇会出现严重的过敏反应，在使用之前遵医嘱服用药物以控制或阻止不良反应的发生。 ?紫杉醇有不同的给药方案和疗程，具体方案请咨询您的医生。 ?紫杉醇没有口服制剂。 ?接受治疗的紫杉醇的量需要通过很多因素来决定，包括：身高，体重，平素的健康情况以及其他健康问题，还有所患癌症的种类。你的医生会制定你所需要接受治疗的疗程和用量。 不良反应：
你需要知道的一些重要的关于紫杉醇的不良反应： ?不是所有的人都会出现说明书所列的所有不良反应 ?不良反应通常可以对其发生的时间，程度等是可以预测的 ?当治疗完成时不良反应是可以恢复的 ?有很多方式可以减少或者阻止不良反应的发生 ?服药的效果和其不良反应的发生和程度没有关系 ?紫杉醇药物的不良反应出现取决于用药的量和用药周期 下列不良反应时大多数病人会出现的（发生率大于30%） ?骨髓抑制（主要是暂时性血细胞数量减少，包括红细胞，白细胞和血小板，会给你带来感染，贫血和出血的风险） ?脱发 ?关节和肌肉疼痛，通常发生在用药后的2到3天，之后会逐渐缓解 ?外周神经病变（手足麻木刺痛） ?轻度的恶心和呕吐 ?腹泻 ?口腔溃疡 ?超敏反应，通常出现发烧，面部潮红，寒颤，呼吸急促，红疹。大部分超敏反应出现在首次滴注紫杉醇的10分钟，如果出现这些症状请立即告知你的医师（通过预先使用药物可以预防和降低超敏反应的发生） 下列不良反应时少数病人会出现的（发生率10-29%） ?脚以及脚踝水肿 ?肝功能异常，出现此类情况请立即停药直至恢复正常 ?低血压（通常出现在首次滴注的3小时） ?放射治疗的区域出现皮肤颜色加深（放疗增敏） ?指甲改变（通常出现指甲下方皮肤皮肤发白） 最低点出现在15-21天 以上的情况包括一些常见和少见的使用紫杉醇后出现的不良反应，那些出现率小于10%的不良反应没有在此列出，然而，你应该通知医生如果你出现任何异常的症状。
紫杉醇 【中文名称】：紫杉醇 【英文名称】：Paclitaxel 【定义】：从紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中提出的一种化合物。是微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定。 【所属】：属于萜类，双萜生物碱 【分子式为】：C47H51NO14，分子量：853.90 【结构式】： 【理化性质】：从甲醇析出针状结晶或无定形粉末；熔点213～216℃(分解)； [α]D20-49°(甲醇)；UV最大吸收(甲醇)：227，273nm(ε29800， 1700)；为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮 等有机溶剂 【结构特点】：含有酯键，对碱不稳定；含有环氧丙烷环，具有抗癌活性；含有的N原子处于酰胺状态，不显碱性；紫杉醇结构中无苷键，对酸 相对稳定；紫杉醇可与MnO2发生氧化反应，且不易还原。 【高效分离纯化紫杉醇的方法】 包括：ａ、萃取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；ｂ、去除胶质，除去提取物中的胶质杂质；ｃ、分离纯化。 紫杉醇生产工艺如下： 红豆杉树皮粉碎（越细越好），８５％～９５％酒精，３５－５５℃热回流浸提三次，５０－７０℃真空减压浓缩至热测比重１．１～１．２
ｇ／ｍｌ，氯仿萃取，萃取液浓缩成膏状，得紫杉醇含量１％氯仿膏，将紫杉醇含量１％氯仿膏加氯仿溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，氯仿－甲醇梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量５～８％半成品，将紫杉醇含量５～８％半成品加丙酮溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，丙酮－石油醚梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量２０～２５％半成品，用丙酮－石油醚系统结晶３～４次，抽滤，５０℃真空减压干燥，得紫杉醇含量７５～８０％半成品，１６Ｍｐａ压力层析分离，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，目标段浓缩物丙酮－石油醚结晶，抽滤，干燥，得紫杉醇含量≥９９．５％成品； 去除胶质的过程为：高压硅胶层析柱层析去除胶质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇、三尖杉宁碱、７－表紫杉醇３部分。 【药理作用】 ①作用机理微管在维持正常细胞功能，包括有丝分裂过程中染色体的移动、细胞形成的调控、激素分泌和细胞受体的固定等具有重要作用。微管蛋白是微管形成的重要基础。紫杉醇就是作用于微管月踢缺管蛋白系统，可促进微管蛋白装配成微管，并抑制微管的解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使仿锤体失去正常功能，导致瘤细胞死亡闭。 ②药效学紫杉醇主要影响L一1210细胞的周期移行，使细胞阻碍断在q期和M期[51。使瘤细胞不能分裂变大，井出现多核细胞，阻断有丝分裂。 ③药效学紫杉醇静脉给药后广泛分布于各组织中，其中肝、脾、肺及大肠中放射性较高小肠、脂肪及骨髓中次之，脑及肌肉中放射性较低。给药后12h尿排泄多于粪中排泄量，给药后72h尿粪中的总排泄量占给药量的74%，.. 胆汁中排泄量在给药后3h即占给药量的59.4%，.. 终末半衰期平均为5.3-17.4ho ④量效关系紫杉醇存在个体差异，AUC波动范围较大[6,7]，在 4.367 一 16.0128mg几.h之间，疗效与剂量无多大关系，而疗效与用药后的即刻浓度(Cmax)有一定关系。提示为了改善病人的疗效而进行血浓度测定，并根据监测结果指导合理用药是必要的。
⒉紫杉醇的分离工艺 红豆杉针叶、树皮、根的采集 原料的干燥及研磨 初级萃取 次级萃取 水相（含键合相）有机相 色谱纯化 纯品紫杉醇 图11-4紫杉醇分离纯化工艺 紫杉醇的分离纯化工作开展较早，最早的分离巩义市1966年采用400根试管的逆流分配色谱法，从12g太平洋红豆杉树皮中提取了少量紫杉醇，历时两年，这种工艺十分琐碎，收率极低。随着相关科学技术的不断发展，分离工艺也获得了很大的改进。一般来说，紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，分离纯化过程可用图11-4表示。 ⒊紫杉醇粗提工艺 粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料在进行后续的提纯直至获得纯品。粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的溶剂不同可以导致除去杂质不同，不同时期研究者对这两个过程的研究结果列于表11-5中。 目前用于提取紫杉醇的最普遍的初级萃取剂是乙醇（甲醇）和水，采用95:5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间35～60min；采用纯甲醇，所需萃取时间则为16～48h。在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液-液萃取，该方法可以有效地除去萃取液中50％（质量比）的非紫杉醇烷类物质。如果采用一个较为复杂的分离体系，发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。 次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液-液萃取外，还可以采用固相浸取法和超临界流体萃取法。这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少，减少了环境的污染。若用枝叶为原料，由于枝叶特别是枝叶中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇的提取分离难度。这要求首先在甲醇粗提取物中加入低极性溶剂如正已烷以除去此物质，该法可除去红豆杉枝叶中多达72%的可溶于正已烷的杂质。 五、正相色谱过程为核心的紫杉醇分离纯化工艺
紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。 1 材料方法 1.1 材料 红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 1.2.2 固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中
1999年2月 第29卷第1期 西北大学学报(自然科学版) Jou rnal of N o rthw est U n iversity (N atu ral Science Editi on ) Feb .1999V o l .29N o.1 0收稿日期:1998205220 资金来源:陕西省自然科学基金资助项目(FH 95401) 作者简介:马天有(19682),男,硕士 从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研究0 马天有 董兆麟 (西北大学生物学系,西安,710069) 摘 要 将生于秦岭地区的中国红豆杉树皮中分离得到的一株内生真菌,在马铃薯培养基中进行 发酵试验,用薄层层析、薄层扫描检测。分析结果表明这株真菌能合成紫杉醇,高效液相色谱技术测定其紫杉醇含量约为14120Λg L 。 关键词 中国红豆杉;内生真菌;紫杉醇;薄层层析;高效液相色谱 分类号 Q 93915 文献标识码 A 论文编号 10002274 (1999)0120047249 紫杉醇(taxo l )是人类70年代初从短叶红豆杉(tax us bren if olia nu tt )[1]树皮中分离提取到的一种二萜衍生物。后经Ho rw itz 等研究证实紫杉醇具有独特的抗癌作用机理,它能使癌细胞内纺锤丝的形成受到抑制,有丝分裂不能正常进行,而阻止了癌细胞的扩散。故1992年被美国FAD 批准用于卵巢癌的治疗。后又经多年的研究和临床实验,使紫杉醇的抗癌范围逐渐在扩大,目前进行的乳腺癌、肺癌的临床试验已取得很好的效果。 目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮中提取的。由于红豆杉属于濒危珍稀植物,资源有限,生长又很慢,大量砍伐不但危及到自然界的生态平衡,而且也会带来紫杉醇原料的枯竭。因此,寻找紫杉醇未来新的生产途径,已成为摆在人类面前的一项重大研究课题。近年来国内外学者主要从3个领域进行探索,即化学合成法、植物细胞培养法[2]和微生物工程法[3]。目前人们普遍认为微生物工程法是一种最具潜在能力,最具可能性的一种方法[4]。本文正是采用微生物工程技术,研究从我国秦岭地区生长的红豆杉树皮中,分离产紫杉醇的内生真菌的方法和结果。 1 材料和方法 111 材料来源 中国红豆杉(tax us chnesis )来源于陕西省留坝县庙台子地区为几十年生的老树。紫杉醇标准品购 自Sigm a 公司。112 实验用培养基 固体培养基:马铃薯200g ,葡萄糖20g ,琼脂20g ,水1000mL ,pH 自然。配制方法是马铃薯去皮切碎,水煮40m in ,4层纱布过滤,溶入葡萄糖及 琼脂后加水定容。1105kg c m 2 灭菌20m in 。 液体培养基:配制方法同上,只是不加入琼脂, 分装至250mL 三角瓶中,每瓶50mL 。1105kg c m 2 灭菌20m in 备用。 113 内生真菌的分离和纯化 取新采的红豆杉树皮,除去外层老化部分,切成1c m ×1c m 的小块,置于75%的酒精中消毒5m in ,用无菌水冲洗后置于马铃薯固体平板培养基上,25℃培养一段时间后周围长出少量菌丝。用接种针挑取不同部位的边缘菌丝,分别接种到固体平板上培养,长出新的菌落后,再挑取其尖端菌丝培养,如此反复纯化多次后即可得到一个纯菌株。114 真菌培养物的预处理及样品溶液的制备 用马铃薯液体培养基,250mL 三角瓶中装50 mL 培养液,接少量菌丝,30℃,220r m in ,培养6 ～7d 。培养物冷冻后用组织捣碎机匀浆3m in (转速为10000r m in ),4层纱布过滤,滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液(CHC l 32M eO H 10∶1),充分振荡后静置8～12h ,收集有机溶液相,并在45℃条件下减压蒸发,残留物溶于1mL 甲醇中作为样品溶液备用。