名称：氯化钠蛋白胨水(60g/L)
用途：用于副溶血性弧菌增菌培养。
副溶血性弧菌，进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。
原理：蛋白胨和提供碳源、氮源、维生素、生长因子;高氯化钠含量可以抑制非弧菌类细菌生长。
实验图：
培养基配方(每升)：
蛋白胨10
氯化钠60
最终pH 7.2±0.2
使用方法
1、称取本培养基70g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装试管，每管10ml，121℃高压灭菌15min，备用。
2、选择3个连续适宜的稀释度，各吸取1mL稀释液，加入10mL培养基中，每一稀释度接种3管，于36℃±1℃培养18～24h。
质量控制：
下列质控菌株接种后于36℃±1℃培养18～24h结果如下：
菌名菌号生长状况培养特征
副溶血性弧菌ATCC17802 良好肉汤浑浊
大肠埃希氏菌ATCC25922 部分抑制----
贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期三年。
规格：250g
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。 第一节副溶血性弧菌标准的检验方法 一、检验方法 （一）操作步骤 1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。 2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。 3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。 4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。 5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。 （二）检验程序 图6-1副溶血性弧菌检验程序 二、结果分析判定及注意事项 （一）样品处理 采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。 对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。 样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。 （二）形态与染色
厌氧性细菌的分离培养法 厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低 至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌 氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 1．生物学方法 培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或 加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧 气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这 个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。 另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使 厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。 2．化学方法 利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。 此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如 下： Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则 直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每 1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使 混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。 （２）焦性没食子酸法 焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin) 。每 l00cm3 空间用焦性没食子酸1g 及 10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml ，其具体方法主要有下列几种： 1）单个培养皿法： 将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在 其上放焦性没食子酸 0.2g 及 10％ NaOH 溶液 0.5mL 。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围 以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人 37C 温箱培养 24~48h 后，取出观察。 2） Buchner 氏试管法： 取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g 及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管 放人大试管中，迅速加入 20％ NaOH 溶液 0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石 蜡， 37 培养 24~48h 后观察 (图１－６ )。 ３）玻罐或干燥器法： 置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻 罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好， 用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢
厌氧菌的培养方法 录入时间:2006/6/24 8:36:41 来源：海博生物技术部 厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。 1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。 3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。
硝化菌的培养方法 硝化反应影响因素： 1、温度在生物硝化系统中，硝化细菌对温度的变化非常敏感，在5～35℃的范围内，硝化菌能进行正常的生理代谢活动。当废水温度低于15℃时，硝化速率会明显下降，当温度低于10℃时已启动的硝化系统可以勉强维持，硝化速率只有30℃时的硝化硝化速率的25%[1]。尽管温度的升高，生物活性增大，硝化速率也升高，但温度过高将使硝化菌大量死亡，实际运行中要求硝化反应温度低于３８℃[2]。 2、pH值硝化菌对pH值变化非常敏感，最佳pH值是8.0～8.4，在这一最佳pH值条件下，硝化速度，硝化菌最大的比值速度可达最大值。Anthonison认为pH对硝化反应的影响只是表观现象，实际起作用是两个平衡H++NH3 = NH4+和H++NO2-= HNO2中的NH3（FA）和HNO2（FNA），pH通过这两个平衡影响FA和FNA的浓度起作用的。 3、溶解氧氧是硝化反应过程中的电子受体，反应器内溶解氧高低，必将影响硝化反应得进程。在活性污泥法系统中，大多数学者认为溶解氧应该控制在1.5～2.0mg/L内，低于0.5mg/L则硝化作用趋于停止。当前，有许多学者认为在低DO（1.5mg/L）下可出现SND现象。在DO＞2.0mg/L，溶解氧浓度对硝化过程影响可不予考虑。但DO浓度不宜太高，因为溶解氧过高能够导致有机物分解过快，从而使微生物缺乏营养，活性污泥易于老化，结构松散。此外溶解氧过高，过量能耗，在经济上也是不适宜的。 4、生物固体平均停留时间（污泥龄）为了使硝化菌群能够在连续流反应器系统存活，微生物在反应器内的停留时间（θc）N必须大于自养型硝化菌最小的世代时间（θc）minN，否则硝化菌的流失率将大于净增率，将使硝化菌从系统中流失殆尽。一般对（θc）N的取值，至少应为硝化菌最小世代时间的2倍以上，即安全系数应大于2。 5、重金属及有毒物质除了重金属外，对硝化反应产生抑制作用的物质
关于厌氧菌培养方法的探讨 啤酒有害菌是纯生啤酒生产中微生物检验最重要的一项指标，如何对啤酒进行有效的厌氧菌(即有害菌)检测意义重大。影响厌氧菌检验的因素很多，其中最重要的是能否达到厌氧菌培养所需的厌氧环境。本文结合作者多年的工作经验，对厌氧培养箱法培养厌氧菌进行初步探讨 1 常见的厌氧菌培养方法 1．1 最古老的方法：蜡烛耗氧法此法利用蜡烛燃烧消耗封闭容器里的氧气，产生二氧化碳，在封闭容器内形成厌氧环境。此法产生的厌氧环境很难得到保证，培养过程不方便操作。1．2 置换法 通过真空泵使二氧化碳气体从厌氧罐底部进入，二氧化碳比重比氧气大，迫使氧气上浮，随着二氧化碳气体的逐渐充满氧气从顶部排出，在厌氧罐里形成厌氧环境。使用此方法，成本较低+佩操作繁琐，厌氧程度不能得到有效保证。 1．3 厌氧盒，罐法 厌氧盒，罐法是利用吸氧剂把厌氧盒，罐中的氧气吸收，使其达到无氧状态。由于厌氧盒容量一般较小，此法厌氧环境能够保证，但不能满足大生产需要；另吸氧剂成本较高。 1．4 厌氧培养箱法 通过真空泵先将箱内氧气抽出，充人氮气和混合气，使箱内形成厌氧环境。此厌氧环境在正静隋况下可一直保持。每次使用时只需置换过渡间的空气，实现与培养箱内的互通，进行样品的放置或取出等操作。 2 厌氧培养箱法简单介绍 2．1 初始厌氧环境的形成 为了严格保证厌氧环境，一般采取20次抽真空和充N2过程进行初始化。 2．2 样品放置的步骤 在样品放置过程中．可以采用三次抽真空，两次N2清洗交替进行，使厌氧培养箱内的氧气含量低于l％。在厌氧菌培养过程中，适当保持培养箱内的厌氧气体压力，使形成轻微正压，以保证厌氧环境。 2．3 使用要点
使用牛肉膏蛋白胨培养基? 组成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,～。? 具体配置步骤：? 1.称药品?按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.? 2.加热溶解?在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.? 3. 调pH?检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH 的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.?
4.过滤?液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.? 5.分装?按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.? 6.加棉塞?试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.? 7.包扎?加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期.?
副溶血性弧菌 副溶血性弧菌是什么？ 副溶血性弧菌是我国沿海地区最为常见的食源性病原菌，广泛存在于近岸海水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中，主要引起食物中毒。 危害是什么？ 副溶血性弧菌感染最常见的症状是急性胃肠炎，一般恢复较快，少数病人可发展至脱水、休克。 在我国的流行状况 副溶血性弧菌感染常见于沿海地区，随着国民经济的发展，交通运输便利，目前我国内陆省份各大城市也较常见，发病高峰期是夏秋季，主要集中在7－9月。 最常见的污染食品是什么？ 副溶血性弧菌感染引起的食物中毒主要的污染食品是海产品，包括鱼类、软体动物(如生蚝、墨鱼、八爪鱼)和贝壳类动物(如龙虾、虾、蟹)；除了海产品外，其他食物(如烧肉、卤肉和凉拌菜)也可引起副溶血性弧菌感染，这主要是因为交叉污染所致。我国不少地区还发现淡水鱼携带副溶血性弧菌。 最常见发生的地点是哪里？ 副溶血性弧菌引起的食物中毒常发生在沿海地区，特别是旅游景点，高发于接待旅行团团餐的大排档。 典型症状是什么？ 副溶血性弧菌感染平均潜伏期为15小时，最短1小时，最长4天。国内报告9～20小时者占81％，10小时内者占70％。副溶血性弧菌感染的典型症状是急性胃肠炎，如呕吐、腹痛、腹泻等。剧烈腹痛、脐部阵发性绞痛为主要特点，腹泻多呈水样便。病程常为2－3天，恢复较快，少数病人发展至脱水、休克。 是否有易感人群？ 人群普遍易感，男女老幼均可患病，但副溶血性弧菌引起的暴发多以青壮年为主。经常暴露于少量细菌者，感染后临床症状一般较轻，如渔民大多有生食或半生食某些海产品的习惯，暴露机会甚多，但发生食物中毒者并不多，即使发病，症状也较轻。但内陆人员到沿海地区时，饮食稍有不慎，屡见发生病情较重的食物中毒。 1 / 2
厌氧培养 1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。 3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。 7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。
降低N O3和培养厌氧菌的几种方法 （注：相关资料来源于网络，仅供参考。如有冒犯作者之处还望告知并谅解。）养虾可以说是淡水水族养殖里的最高境界之一,如果你能养好虾,养别的水族生物应该都不会遇到太多难题,而且养虾需要对整个水体的生态环境都有了解才能养的好. 养虾第一步就是建立硝化系统,其实大家不管用滤筒,滴流过滤还是上过滤水妖精,有足够的滤材够硝化细菌生殖并且有足够的耐心(通常建立好的硝化系统需要1个月左右)等待硝化细菌繁殖,建立硝化系统应该都不是难题. 难的是硝化系统建立以后,虾子每日吃喝拉撒,硝化细菌分解这些有机物剩下的NO3却很难除掉,NO3在自然界中是厌氧菌来分解的,自然界中的厌氧菌是藏在厚厚的河沙和淤泥的底层,因为与氧气隔绝形成厌氧区,厌氧菌就会在这里大量繁殖,分解NO3释放出氮气和氧气,可是厌氧菌在水族箱中很难培养出来,尤其养虾来说,底土铺太厚时间长了容易败坏.如果NO3堆积过多,常见的结果是母虾踢卵,小虾成活率低等 要创造一个绝对的厌氧环境,本人总结下来有几个办法可以实现厌氧菌的培养. 1、每周定期换水,换1/3,可以有效降低NO3,好处是简单,缺点是对于水质比较硬的地区,换水成本太高,需要用RO软水机或者桶装RO水来换. 不换水的方法如下:? 2、买一根50米长的水管,一端接在潜水泵,一端放到虾缸中.让水流经过50米的水管流回虾缸,在这个漫长的过程中,氧气消耗大部分,在水管的后半段就可以培养出厌氧区,厌氧菌就会繁殖,他们就会把NO3分解掉,回到缸子中的水NO3会接近与0.注意问题:如果50米管子过细,时间长了可能会阻塞,管子要用深色的,不能用透明的,因为厌氧菌需要不能见光.入水口管子最好抬高,离水面有5公分以上的距离,以免反硝化作用不彻底产生硫化氢毁掉虾缸（这个方法我没有试过，大家有心的可以试试，曾经有网友发帖说过效果还不错） 3、台湾KU大发明的三串滤筒法： 台湾KU大曾经有发明过一个三串滤筒法,原理是前两个滤筒放满培菌滤材,让硝化细菌大量繁殖,因为硝化细菌进行硝化作用需要消耗氧气,水流流经前两个滤筒到第三个滤筒的时候氧气消耗差不多了,在第三个滤筒营造出厌氧区,用来培养厌氧菌。 好处是：因为滤筒水流速度较快，流到第三个滤筒时仍然速度不减，不会因为脱氮作用不彻底产生硫化氢 不足的地方： 第一、滤筒的容积要足够大,这个足够大是一个很虚的概念,这个要和你的缸子的容积大小匹配,比如说我用三个AT-3338带一个一米的缸子.对于一个60的缸子可能三个3338有点大,但是对于一个1米5的缸子可能3338又不够--这里只是举个例子具体大小要在实际应用中总结， 二、是取决于滤材,如果有足够的空间没有好的滤材也不行,如果滤材不好培菌效果有限也无法在滤筒里产生足够的硝化细菌,我用的是伊罕的石英球和陶瓷环.但是具体滤材要多少,这个KU大也没有给答案,因为大家具体应用的缸的尺寸和环境各异,没有办法统一三,跟虾口的数量有关,这个应该很好理解,虾越多产生的废物越多,硝化作用下来的NO3也就越多. 四,NO3是厌氧菌-脱氮菌在无氧条件下通过脱氮作用将NO3分解成氮气和氧气,但是如果在绝对无氧的环境下,脱氮菌就会开始以硫化物为食产生硫化氢,硫化氢就会毁掉虾缸,三串滤筒的好处是水流速度快到最后一个滤筒也能带去少量氧气和足够的NO3源,所以不至于产生硫化氢,但是不好的地方是你也不知道他具体会带多少氧气进到第三个滤筒,如果带的太多了第三个滤筒仍然是硝化菌的天下,进行的还是硝化作用.第三个滤筒仍然会成为又一个硝化菌的培菌桶.或者是在第三个滤筒里形成的厌氧区域很小,不足以处理大量的NO3.
1.目的: 医院是病原微生物较集中,抵抗力低的人群密集的地方,加之化疗、放疗等手段的采用，影响病人免疫机能下降，大量使用抗生素，引起耐药菌株增多，菌群失调，以及先进医疗仪器广泛应用等原因，增加消毒灭菌的难度，致使院内感染已成为当前医疗实践的严重障碍，直接影响医疗效果。进一步规范院内感染监测标本的程序，更好、更快检测病原微生物的生长情况，预防医院感染的发生。 2.设备、试剂与材料 VITEK 2 compact鉴定药敏分析系统 VITEK 32鉴定药敏分析系统 美国FORMAⅡ级生物安全柜 显微镜 酒精灯 接种环 恒温培养箱 各种培养基 革兰氏染色液 触酶试剂 氧化酶试剂 移液器 无菌吸嘴 3.院感标本采集 3．1空气的采样 3．1．1采样时间选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。 3．1．2采样高度与地面垂直高度80-150CM。 3．1．3布点方法室内面积＜30m2，设一条对角线上取三点，即中心一点，两端各距墙1m 处各取一点；室内面积＞30m2，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。 3．1．4采样方法用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min后送检。
3．2．1采样时间选择消毒处理后4小时内进行采样。 3．2．2采样面积被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面＞100cm2，则取100cm2。3．2．3采样方法用5×5 cm2的标准来灭菌规格板，放在被检物体表面，用无菌规格板，放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1-4个规格板面积，剪支手接触部位，将棉拭子放入装10ml采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。3．3医护人员手采样 3．3．1采样时间在接触病人、从事医疗活动前进行采样。 3．3．2采样面积及方法被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子一枝在双手指曲面从指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30 cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10ml采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米（cm2）计算。 3．4医疗用品采样 3．4．1采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。 3．4．2采样方法右用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、注射器和注射针等，取其中的一部分放培养液中培养。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面≥100cm2，取100cm2。 3．5使用中消毒剂的采集 3．5．1采样时间采取使用中的消毒剂。 3．5．2采样方法在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml被检样品，加入10ml稀释液混匀。（对于醇类与酚类消毒剂稀释液用灭菌生长盐水；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80和%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80，以中和被检样液的残效作用。）
本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。 2设备和材料设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 2.2冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃。 2.3恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃。 2.4均质器或无菌乳钵。 2.5天平：感量0.1 g。 2.6无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 2.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、1000 mL。 2.9无菌培养皿：直径90 mm。 2.10全自动微生物生化鉴定系统。 2.11无菌手术剪、镊子。 3培养基和试剂 3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。 3.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。 3.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.3。 3.43％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.4。 3.5嗜盐性试验培养基：见附录A中A.5。 3.63％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录A中A.6。 3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。 3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。 3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。 3.10我妻氏血琼脂：见附录A中A.10。 3.11氧化酶试剂：见附录A中A.11。 3.12革兰氏染色液：见附录A中A.12。 3.13ONPG试剂：见附录A中A.13。 3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.14。 3.15弧菌显色培养基。 3.16生化鉴定试剂盒。 4检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图1。
细菌的培养方法 根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。 1. 一般培养法 将已接种过的培养基,置37℃培养箱内18－24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3－7天直至一个月才能生长。为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固，以防培养基干裂。 2. 二氧化碳培养法 某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法，常用方法有以下几种： (1) 二氧化碳培养箱可将已接种的培养基直接放入箱内孵育，即可获得二氧化碳环境。 (2) 烛缸法将已接种的培养基，置于容量为2 000ml的磨口标本缸或干燥器内。缸盖或缸口处均需涂以凡士林，然后点燃蜡烛直立置入缸中，密封缸盖。待燃自行熄灭时，容
器内约含5－10％的CO2 容器置37℃培养。 (3) 重碳酸钠－盐酸法每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例，分别将两种药各置一器皿内（如平皿内），连同器皿置于标本缸或干燥器内，盖严后使容器倾斜，两种药品接触后即可产生二氧化碳。 3. 厌氧培养法 目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱三种。 (1) 厌氧罐法是目前应用较广泛的一种方法，共分为以下几种。 抽气换气法：该法适用于一般实验室，其特点是较经济并可迅速建立厌氧环境。标本接种后，将平板放入厌氧罐，拧紧盖子，用真空泵抽出罐中空气，使压力真空表至-79.98KPa，停止抽气，充入高纯氮气使压力真空表指针回0位,连续反复3次,最后在罐内-79.98KPa的情况下,充入70%的N2 、20%H2 、10%CO2 （有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可获得好结果）。罐中需放入冷催化剂钯粒，可催化罐中残余的O2 和H2 化合成水。同时罐中应放有美蓝指示管，美蓝在有氧的环境下呈蓝色，无氧时为红色。临用前首先将美蓝煮沸使变成无色，放入罐中先呈浅蓝色，待罐中无氧环境形成，美蓝即可持续无色。
浅谈副溶血性弧菌 摘要：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，又称为嗜盐性细菌。该菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，其特点是必须在有盐份的环境中才能生长。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、台湾和中国大陆。污染了大量副溶血性弧菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。本文综述了副溶血性弧菌的生理学特性，来源，中毒特点，检测，预防措施等概况 关键词：副溶血性弧菌；食品中毒；食品安全 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，又称为嗜盐性细菌。副溶血性弧菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，其特点是必须在有盐份的环境中才能生长。故其在含盐量高的培养基上(2%-5%)生长良好，但在无盐的培养基上则不能生长，因此被称为嗜盐性弧菌。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、台湾和中国大陆。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。2010年爆发的对虾“偷死病”就是由副溶血性弧菌引起。 一、生物学特性 副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性，多形态弧状杆菌。其菌体呈弧状、杆状、或丝状，无芽孢且无荚膜。大多数菌体在液体培养基中有单端鞭毛、能运动。此菌具有细胞色素氧化酶，不分解蔗糖，但能在不产气及不产生硫化氢的情况下分解葡萄糖而产酸等生化特性。副溶血性弧菌为一嗜盐性细菌，必须在含盐0.5%-8%的环境中方可生长，尤以含盐量在2%-4%的情况下最佳。故其在无盐的培养基上不能生长，在含盐浓度过高(10%以上) 的培养基上也无法生长。副溶血性弧菌能够在温度为5-44℃范围内生长，但以30-35℃为最佳，当温度低于40℃时则停止生长，适宜生长的pH 为7.5-8.5，以pH7.7为最佳，在pH 低于6 的
第二节细菌培养检测技术 节概述 细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定 知识点导航 一.培养基的种类 培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。适宜的培养基 能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。可分为基础培养基、营养培养基、选 择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。 （一）基础培养基 只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉 汤培养基、琼脂培养基。 （二）营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细 菌生长需要或增菌用。如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。 （三）选择培养基 利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的 培养基。培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别 。选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。 （四）鉴别培养基 培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴 别和鉴定细菌。 （五）厌氧菌用培养基 专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。 （六）特殊培养基 为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。 二.培养基的制备 制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和 保存。 三.细菌检验室的注意事项及无菌技术
厌氧细菌的培养 厌氧菌的培养方法 厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。 1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。 3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4．厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5．生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。 6．焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培
厌氧微生物培养技术的目的和原理 关键词：焦性没食子酸碳酸氢钠柠檬酸氯化锌亚甲蓝氮气标准气体标准溶液北京标准物质网 对简单，可用于那些对厌氧要求相对较低的一般厌氧菌的培养，如碱性焦性没食子酸法、厌氧罐培养法、庖肉培养基法等。本实验将主要介绍这三种，它们都属于最基本也是最常用的厌氧微生物培养技术。其中有些厌氧微生物要求高的培养研究，对实验仪器也有较高的要求，如主要用于严格厌氧菌分离和培养的亨盖特技术、厌氧培养箱(手套箱)法等。厌氧培养箱已逐渐普及，本实验也作简要介绍。 1．碱性焦性没食子酸法 焦性没食子酸与碱溶液(NaOH、Na 2CO 3 或NaHCO 3 )作用后形成易被氧化的碱性 没食子盐，能通过氧化作用而形成黑、褐色的焦性没食子橙从而除掉密封容器中 的氧。这种方法的优点是无需特殊及昂贵的设备，操作简单，适用于任何可密封的容器，可迅速建立厌氧环境，适用于前期实验性探索研究；而其缺点是在氧化过程中会产生少量的一氧化碳，对某些厌氧菌的生长有抑制作用，同时，NaOH 的存在会吸收掉密闭容器中的二氧化碳，对某些厌氧菌的生长不利。用NaHCO 3 。代替NaOH，可部分克服二氧化碳被吸收问题，但却又会导致吸氧速率的降低。当然，大批量厌氧培养需消耗大量实验药品，并产生大量废液，可能引起环境污染。 2．厌氧罐培养法 利用一定方法在密闭的厌氧罐中生成一定量的氢气，而经过处理的钯或铂可作为催化剂催化氢与氧化合形成水，从而除掉罐中的氧而造成厌氧环境。由于适 量的CO 2 (2％～10％)对大多数的厌氧菌的生长有促进作用，在进行厌氧菌的分离 时可提高检Ⅲ率，所以一般在供氢的同时还向罐内供给一定的CO 2。厌氧罐中H 2 及CO 2 的生成可采用钢瓶灌注的外源法，但更方便的是利用各种化学反应在罐中 自行生成的内源法，例如，镁与氯化锌遇水后发生反应产生氢气，碳酸氢钠加柠 檬酸水后产生CO 2： Mg+ZnCl 2+2H 2 O→MgCl 2 +Zn(OH) 2 +H 2 ↑ C 6H 8 O 7 +3NaHCO 3 →Na 3 (C 6 H 5 O 7 )+3H 2 O+3CO 2 ↑
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个 环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。 1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。 2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。 3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保
持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。 4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。 5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。我没见过。 6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。 7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。
细菌分离培养方法及操作步骤 无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。 平板划线接种法 这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作： 1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌； 图1 病料采集图2 接种环灭菌 2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。
3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。） 图3 平板划线接种法 4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。 注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。
细菌药敏试验方法操作步骤 药敏试验是抗菌药使用以前必不可少的一个基本环节，一个正确的药敏结果能够科学的指导养殖户用药，减少抗菌素使用的盲目性，从而减少养殖户损失。在临床实际生产中具备重要意义。 1、在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。 图4 接种环划线 2、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
细菌的分离与培养 实验目的： 掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。 实验材料： 菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。实验内容： 一、平板划线接种法（分离培养法） 原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。 用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。 课时安排：2课时 操作方法（三区划线法）： 1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。 2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。 3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。 4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。 5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。 二、液体培养基接种法 用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。 操作方法： 右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。 1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。 2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。 3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。 三、半固体穿刺接种法 用途：观察细菌动力，保存菌种。方法： 1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。 2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。 图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法 四、斜面培养基接种法 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。