多肽合成中肽键形成的基本原理 一个肽键的形成（生成一个二肽），从表面上看是一个简单的化学过程，它指两个氨基酸组分通过肽键（酰胺键）连接，同时脱去水。 在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸（A）的羧基部分，第二个氨基酸（B）则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽（A－B）。如果羧基组分（A）的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能开有成线性肽和环肽等副产物，与目标化合物A－B混在一起。所以，在多肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。 因此，多肽合成－即每一个肽键的形成，包括三个步聚： 第一步，需要制备部分保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在； 第二步，为形成肽键的两步反应，N－保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行。 第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行，但为了继??? 续肽合成，选择性脱除保护基也是必需的。 由于10个氨基酸（Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys）含有需要选择性保护的侧链官能团，使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同，所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护，在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除，有时也在合成过程中脱除。 在理想状态下，羧基组分的活化和随后的肽键形成（耦合反应）应为快速反应，没有消旋或副产物形成，并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是，还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比，适用于实际合成的方法很少。 在肽合成过程中，参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连（甘氨酸是唯一的例外），存在发生的消旋的潜在危险。 多肽合成循环的最后一步，保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外，选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划，依战略选择，可以选择性脱除Nα－氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说，在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成（也指“常规合成”），对困难序列，多数情况下，用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时，目标分子必须分割成合适的片段，并确定在片段缩合过程中，它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后，再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。 最初的固相多肽合成（SPPS）只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化，其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上，由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天，为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上，也可以进行片段缩合反应。
发布日期20071127 栏目化药药物评价>>非临床安全性和有效性评价 标题合成多肽药物有关物质研究的几点考虑 作者审评五部 部门 正文内容 审评五部 有关物质研究是合成多肽药物药学研究的一项重要内容，由于合成多肽本身结构、合成工艺以及稳定性方面的特殊性，这类药物的 有关物质研究较为复杂、存在一定的难度。国家食品药品监督管理 局颁布的《合成多肽药物药学研究技术指导原则》已经就该类产品 的有关物质研究提出了原则性的要求，本文主要是根据审评中遇到 的一些共性问题就合成多肽药物有关物质研究需重点关注的几个 问题做进一步的说明。 （一）合成多肽药物有关物质的特点和研究的难点。 合成多肽的有关物质主要为源于合成过程带来的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等。 工艺杂质尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工
艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质（如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等）与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。而且，不同的多肽合成方法也在很大程度上决定了终产品中杂质的性质，例如液相合成和固相合成所引入的工艺杂质就会明显不同，固相合成中Boc合成法与Fmoc合成法所产生的杂质也会有所差异，甚至不同的保护/脱保护策略都会带来不同的工艺杂质。因此，在进行合成多肽的有关物质研究时，研究者必须结合自身的工艺特点对可能由此引入的杂质有充分认识，从而才能够建立有针对性的有关物质研究方法。同时，这也意味着，对于仿制产品而言不能盲目照搬国家标准、已上市产品的有关物质检查方法，必须充分考虑到产品本身的工艺特点。 降解产物及聚合物多肽的化学稳定性和物理稳定性一般较差，因此降解产物、聚合物等是合成多肽有关物质研究的主要对象之一。影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β-消除、聚集等，研究显示合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应（尤其是在pH值升高和高温条件下）；甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化，对光照也较为敏感；天冬氨酸参与形成的肽链较易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。由于一个多肽分子中通常
酶法多肽的作用 基本信息： 用生物酶催化蛋白质的方法称为酶法，用酶法获得的多肽叫做"酶法多肽"。酶法多肽一词最早起源于1996年，是由邹远东创立的酶法多肽。酶法多肽服食进入循环系统和人体组织后，能刺激机体的免疫系统发生特异性免疫反应。 酶法多肽的应用： 酶法多肽现最具代表性的产品是三九蛋白肽口服液，三九蛋白肽具有免疫调节和抗辐射的两大主要功能，适用于减缓各类癌症放化疗的毒副作用。例如针对化疗后呕吐，掉头发，白细胞低等放化疗后的毒副作用怎么办？免疫力低怎么增强？身体不好如何治疗?等问题提供了一个辅助恢复的作用。 放化疗手术后的副作用 ●免疫功能下降：化疗药物可损害患者的免疫系统，导致免疫功能缺陷或下降。 ●身体衰弱：化疗患者会出现周身疲乏无力、精神萎靡、出虚汗、嗜睡等不良反应。 ●炎症反应：发热、头晕、头痛、口干、口舌生疮等。还有可能引起静脉炎，膀胱炎等并发炎症。 ●器官毒性：有些化疗药大剂量可引起肾功能、心脏功能、肝功能损害。导致器官的衰竭和损伤，以及头发的大量脱落等等。 ●消化障碍：很多化疗药物通过刺激胃肠道粘膜都会引发食欲下降、饮食量减少、恶心、呕吐、腹胀、腹痛、腹泻或便秘等。 ●白细胞水平下降：放化疗的目的就是杀死癌细胞，但是它是“无差别攻击”，在杀死癌细胞的同时，白细胞也会死亡，当白细胞水平过低时，人就会死亡。 这些副作用也让广大医患人员意识到：单一的化疗并不能减轻病人的病痛，需要配合其他产品来减轻放化疗的副作用，从而才能延长病人的生命。 放化疗期间常见问题解答
1、放化疗后白细胞低怎么治疗? 可将专业的抗放化疗药物搭配三九蛋白肽一起服用。三九蛋白肽能促进放化疗病人白细胞增值，提升白血球含量，提高白细胞水平，同时增强病人免疫功能。此外，放化疗人群应多吃些富含蛋白质、铁、维生素的食物和水果蔬菜，如鱼类、瘦肉、大枣等。 2、放化疗后免疫力低下怎么办? 服用三九蛋白肽口服液能修复病人整体的身体内系统，从根本上增强体质，三九蛋白肽还是一种新型的肽类免疫剂，病人不需要消化就可直接吸收，为病人补充少而精的蛋白营养物质。 3、化疗后恶心呕吐怎么办? 请记住病人在接受放射或化学治疗前2小时内，应避免进食，以防止呕吐。服用三九蛋白肽可以修复病人的胃肠道功能，帮助恢复饮食情况，为病人提供可以直接吸收的营养蛋白物质，恢复病人的身体机能状况。饮食方面也应注意少食多餐，避免空腹或腹胀。 4、如何减轻放化疗副作用? 除了成分输血、骨髓移植等方式外，三九蛋白肽能够全方位的缓解放化疗病人的毒副作用，尤其在抗辐射，提高免疫力方面，效果更为明显。服用三九蛋白肽还能缩短病人放化疗间隔时间，减少病人放化疗期间的痛苦，延长病人寿命。 5、放化疗期间掉头发怎么办? 防治放化疗脱发的办法较多，如药物治疗和物理降温，饮食方面需注意多补充维生素E，在营养品方面可选择服用三九蛋白肽口服液，能减轻放化疗副作用，预防脱发。 三九蛋白肽抗放化疗的六大自然优势 1、科技酶法萃取，天然无激素 人体的一切生理活动都需要多肽的参与，三九蛋白肽是运用蛋白质工程的分离技术，对全卵蛋白粉进行分离，运用生物工程的酶解技术，将大分子蛋白质直接酶解成小分子活性多肽，富含人体极易吸收的小分子活性多肽及20多种氨基酸。 2、不需消化，直接吸收 三九蛋白肽是合成小肽，不需降解，直接吸收，进入renti血液循环系统、器官及细胞组织、迅速发挥其生理作用和生物学功能。
多肽合成基础知识汇编 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT
----------------------------------------------------------------------------------------- 多肽合成 基础知识汇编 编制: 合成部 ----------------------------------------------------------------------------------------- 一、多肽合成概论 1．多肽化学合成概述： 1963年，［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要
附件三 合成多肽药物药学研究技术指导原则
合成多肽药物药学研究技术指导原则 一、前言 多肽类化合物是一类重要的生物活性分子。20世纪70年代生物技术在生命科学领域的应用，使多肽等生物技术药物的研究进展迅速；与此同时，随着多肽固相合成技术及高效液相色谱（HPLC）纯化、分析技术等的发展，合成多肽药物的开发也成为药物研究中的一个活跃领域。 采用化学合成方法制备多肽，可以对天然多肽的结构进行修饰，从而增加多肽与受体的亲和力、选择性，增强对酶降解的抵抗力或改善药代动力学特性，甚至由受体的激动剂变为拮抗剂；此外，新技术的发展，例如以多肽固相合成和组合化学为基础的组合肽库合成技术，使得在短时间内获得大量的多肽化合物成为可能，药物筛选的效率不断提高。因此，将会有越来越多的采用化学合成方法制备的多肽类化合物成为治疗用药物。 合成多肽药物是指采用化学合成方法制备的多肽类药物。这类药物的药学研究同样遵循国家食品药品监督管理局已经发布的相关技术指导原则的一般性要求。但是，由于多肽主要由氨基酸（包括天然氨基酸和非天然氨基酸）构成，这使得多肽类药物在制备方法、结构确证、质量研究等方面又有与一般药物不同的独特问题。本指导原则就是在已有的相关指导原则基础上，对合成多肽药物药学研究方面所涉及的特殊问题进行分析，结合国内对多肽药物研究和评价的实践经验，提出多肽药物药学各项研究的一般性要求。当然，具体品种研究的内容与深度还要取决于品种本身的特性。 本指导原则适用于采用液相或固相合成方法制备的多肽药物。
二、合成多肽药物药学研究的基本考虑 合成多肽药物药学研究的主要内容、研究思路、研究方法及一般性的技术要求与其他类型的化学药物基本一致。但是，由于多肽药物的特点，在进行药学研究时还应注意考虑以下问题。 1、关于多肽（原料药）合成工艺选择的考虑 多肽的化学合成是有机合成的一个非常特殊的分支，目前主要有液相合成和固相合成两种方法。 液相合成是经典的多肽合成方法，一般采用逐步合成或片段缩合方法。逐步合成法通常从链的C'末端氨基酸开始，向不断增加的氨基酸组分中反复添加单个α-氨基保护的氨基酸。片段缩合一般先将目标序列合理分割为片段，再逐步合成各个片段，最后按序列要求将各个片段进行缩合。液相合成的优点是每步中间产物都可以纯化、可以获得中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失，缺点是较为费时、费力等。 固相合成是将目标肽的第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体(树脂)相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨基酸（氨基保护）的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸的树脂肽的氨基脱保护后与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一过程,直至目标肽形成为止。其优点是简化了每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等；其缺点是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。 液相合成和固相合成各有优缺点，应根据合成的实际需要选择适合的工艺。一般而言，液相合成法较适于合成短肽；固相合成法
十种常见的酶制剂 （1）纤维素酶 纤维素酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了,随着在工业上的广泛应用,特别是在纺织工业、能源工业上的应用,纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的基础研究,包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能,以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止,登记在Swiss2Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条,基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代,迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达,以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展. 进入21世纪,利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇,可以避免对粮食作物的大量损耗,引起了各国政府和研究机构的重视,这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低,因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类,比活力至少要低1～2个数量级,如滤纸酶的比活力为1IU/mg左右,CMC的比活力约为 10IU/mg[7],从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题,也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量,从而提高酶的发酵水平.还可以通过改善发酵条件和工艺,如采用固体发酵来 大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要,深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式,进而对其进行有效改造;或者通过筛选新的产酶菌种,发现具有开发潜 力的新酶源. （2）脂肪酶 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶是最早的发现的酶之一，早在１８３４年就发现了脂肪酶至今已有一百年的历史，１８３４年就发现兔胰脂肪酶；１８５４年发现胃脂肪酶活性；１８７１年发现植物种子脂肪酶；微生物脂肪酶则在上世纪初才发现。目前，工业生产用脂肪酶高产菌株主要通过诱 变获得。以黏质沙雷菌8000为初发菌株，用甲基硝基亚硝基胍诱变处理，得到高产突变菌株
多肽的化学合成技术总览 从最简单的病毒到人类，所有生物体内复杂的蛋白质结构都是由相同的20种氨基酸组成，这就构成了千姿百态的蛋白质世界。生物学家在对蛋白质进行深入研究的过程中，发现一类由氨基酸构成但又不同于蛋白质的中间物质，这类物质被称作多肽。 多肽是比蛋白质简单，分子量小,由氨基酸通过肽键相连的一类化合物。多肽具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效，它几乎影响着人体的一切代谢合成。一种肽含有的氨基酸少于10个称为寡肽，超过的就称为多肽；氨基酸为50多个以上的多肽就是人们熟悉的蛋白质。 多肽合成的价值 图1. 多肽合成。 到现在，人们已经发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。 通过多肽全合成可以： 1.验证一个新的多肽的结构； 2.设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系； 3.为多肽生物合成反应机制提供重要的信息；
多肽的化学合成 多肽的合成主要有两种途径：化学合成和生物合成。化学合成主要通过氨基酸缩合反应来实现。为得到具有特定顺序的合成多肽，当合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体时，应将不需要反应的基团暂时保护起来，然后再进行连接反应，以保证合成的定向进行。一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。 1. α-氨基保护基 常用的氨基保护基可分为烷氧羰基、酰基和烷基三类。其中烷氧羰基保护基可防止消旋化，因此应用广泛。使用最普遍的是Z、Fmoc和Boc。Z基团可用钯黑，5％～20％钯炭催化氢化法脱除。Boc基团具有与Z基团不同的化学性质，不能用催化氢化法脱除，但易于酸解脱除，它可以和Z基团搭配使用，有选择性地脱除。Fmoc基团的特点是对酸稳定，可被碱脱除。因此尤其适合于合成含有Trp、Met、Cys等对酸不稳定的多肽。 2. α-羧基保护基 与氨基保护基相比，羧基保护基种类较少，一般以盐或酯的形式存在。盐是对羧基的临时保护，常用的有钾盐、钠盐、三乙胺盐和三丁胺盐等。常用的酯类有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯。叔丁酯是近年来最常用的羧基保护基，可用酸在温和条件下脱除。 3. 侧链保护基 为了避免副反应的发生，某些氨基酸的侧链官能团需采用适当的保护基加以保护。同一个侧链有多种不同的保护基，可以在不同的条件下选择性的脱除，这点在环肽以及多肽修饰上具有很重要的意义，而且侧链保护基和选择的合成方法有密切的关系。
多肽的制备及其功能活性的研究进展 摘要：科学研究发现生物体内存在多种具有生理活性的多肽物质，它们具有不同的结构和功能活性。人体摄入的蛋白质经酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。几乎所有细胞都受多肽调节，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。人们已从包括人、植物、动物在内的各种生物体中分离出各类活性多肽，并且对多肽的性质、制备方法、分离纯化方法、鉴定技术、功能活性及应用等方面进行了大量的研究，并取得了一定的成效。本文介绍了活性多肽的制备方法及其活性研究现状，对多肽的多种功能活性进行了介绍，概述了不同来源多肽的制备方法和其功能活性研究进展。 关键词：多肽；功能活性；分离纯化 前言 近年来，多肽在生物体内的生理功能受到越来越多的重视。大量研究结果表明，蛋白质由于其分子量大，结构复杂，摄人人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥。多肽是比蛋白质结构简单，分子量小，由2～16个氨基酸通过肽键连接的一类化合物，按氨基酸组成数目可人为分为短肽(2～5个氨基酸)，多肽(6～16个氨基酸)。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。科学发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切相关，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。由于多肽具有调节植物神经系统、活化细胞免疫机能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，这为
开发肽药物、肽类保健食品提供了理论依据。可见，进行多肽的研究和开发有着十分重要的研究意义和应用前景【1】。 一，多肽的制备方法 目前，国内外制备多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法、分离提取法等。酶法生产功能性多肽应用较为普遍[2]。龚吉军等人[3]利用茶籽蛋白酶酶解制备菜籽多肽，确定了最佳条件，此条件下氨基酸态氮生成率可达34．64％，制备的茶籽多肽对超氧自由基和羟基自由基具有强烈的清除作用；李书国等人[4]研究了酶法生产大豆多肽的加工工艺，分离得到纯净的酸性水解物溶液，水解率高达95％；班玉凤等人[5]研究了Alcalase水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽的方法，确定了酶解的最佳条件，其水解液的水解度达到了24．1％；刘大川等[6]也利用碱性蛋白酶对富硒菜籽分离蛋白酶解制备蛋白肽，水解度达32．51％，制得的富硒菜籽蛋白肽分子量分布较好，几乎完全是小分子多肽，分子量均在1500D以下。以下是几种方法优缺点的概述。 1，化学水解：酸解，碱解， 酸解法水解度不易控制，容易使氨基酸遭到破坏；碱解法能使L-氨基酸形成D-氨基酸，可能存在营养和毒理方面有害的效应，对于食品多肽的生产不足取。所以这两种方法都很少被使用破坏L型氨基酸，2，酶法水解：能在一定条件下进行定位水解产生特定的肽，且易于控制水解进程，并且具有高度的专一性，一般不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理学上的问题，同时酶作用具有特异性，可在温和
关于多肽合成 1．多肽化学合成概述： 1963年，R.B.Merrifield［1］创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法，在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的.克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础.为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖. 今天，固相法得到了很大发展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外，又发展了Fmoc 固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善. Merrifield所建立的Boc合成法［2］是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类.合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过Dcc活化、耦联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc 法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等. 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。 从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法， 2．固相合成的基本原理 多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。现在多采用固相合成法，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc 法合成，如图： 具体合成由下列几个循环组成：
多肽合成技术 多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，Fred Sanger发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel 化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因
复酶多肽纳豆红曲的调整反应 服用纳豆红曲会有一部分人群出现瞑眩反应！ 《中医饮食疗法》云：“不起暝眩，症状不愈”。是指人的体质或身体机能由不好转好（如：酸性体质变为健康弱酸体质），或人体在排除毒素时（如药品、食物中农药、人工添加剂、饲料中的荷尔蒙、抗生素、人体产生的废物等残留）身体的反应，这种瞑眩反应又称为排毒反应或者调整反应、好转反应，这是人体迈向健康无病过程中最关键的一环。瞑眩反应是暂时性的，不是每一个人都会发生，也不是只发生一次。有的出现强烈好转反应的人，有的是逐渐地在不同部位发生，这些都只是显示其本身健康情形不佳而已，表明身体在做大调整修复，所以大可不必过于惊慌，切勿因一时难受而放弃。 主要症状 1、无瞑眩反应。睡眠品质提升，精神旺盛、生理时钟变规律、心肺功能增强、免疫力强、感冒减少。气色、皮肤、眼神都在变好。请提醒服用者前后之不同。这就是身体比较健康，好转反应几乎察觉不到的人。 2、一般人刚开始注意全身保健时的瞑眩反应. 3、其他的瞑眩反应显示出可能的身体机能异常，或身体的自愈力正自动地修补调节该机能。 -- 较轻度的瞑眩反应：有头晕、倦怠、酸痛、肩硬、拉肚子（一天数次软便）。 -- 较严重的瞑眩反应：有头痛、发肿、发烧、湿疹、关节痛、血压上升、喘不上气、呕吐、食欲不振等。 调整反应具体表现列举如下： 1.全身任何部位生疮，有时会带脓（有细菌），皮肤出现红疹、疹子，有些会痒，有些不会痒：肝功能不良或体内废物过多、身体排出血液中的毒素、排出体内的湿气，过敏体质。
2.头痛头晕：改善头部供养，修复神经，溶解脑部血管内血脂或胆固醇，清理血管杂质，或是其本身有高、低血压的问题好转反应。 3.酸性体质：爱睡(白天也想睡)、身体困倦、喉乾舌燥、口臭、尿频、放屁多、夜睡有尿意。这都是体内环境改善的正常现象，20天左右恢复正常。 4.高血压者：会有头重如裹、眩晕头痛的现象，这是血液循环改善，但血管阻力未消失的缘故。有的会血压增高，这是修复血管壁、斑块脱落的反应。待巨噬细胞活化排出血管壁的中性脂肪后，血压就会下降。继续服用降血压药，但应每天量血压，注意其下降情形，随症减少降压药的剂量。此现象一般可持续1-2星期。 5.贫血者：会有轻微流鼻血，乏力加重。 6.胃炎（胃不好者）：胸脘发闷、发热的感觉、腹痛、食欲不佳、吃不下东西，可改为饭后服。 7.胃溃疡者：脘腹会有疼痛或闷闷的感觉，可改为饭后服用。8.胃下垂者：胃部觉得不适、想呕吐，可改为饭后服用。 9.肠炎者：有腹泻疼痛现象，依人而异。 13.糖尿病者：血糖有时会增高，个别手脚也有水肿的现象。这是肠道的吸收功能增强，在同样的饮食条件下，吸收进来的糖多了的缘故，一般不需做任何处理，2—3周后人体抗氧化能力增强，分解糖的能力增强，血糖自然下降。 14.青春痘者：初期会稍为增加，但很快就会消失。这是皮脂腺阻塞，停留在皮脂腺的脂肪或毒素被活化的细胞排除后，渐渐改善。二、三周后就好多了。 15.全身发热、发烧：重新调整免疫系统。 16.慢性支气管炎者：会有口干、呕吐、头昏、痰不易咳出等现象。 17.肺不好者：咳嗽时，痰增加，微带乳黄色。 18.鼻窦炎者：有时会增加排出鼻涕量且呈现浓稠状。19.皮肤过敏者:初期皮肤发痒加剧，几天后，即减缓，可采用间歇性食用。 20.神经官能症者:不能入睡出现兴奋现象,故夜晚不宜食用。 21.白血球过少者：觉得口干、多梦、乏力、胃不舒服等现象。 22.风湿痛者：患部会酸痛加重，但几天后，即消失。 23.痛风病者：会有乏力感或酸痛加重，小便混浊臊味加重，但几天后，即消失。 24.尿酸过多者：全身酸痛，依症状程度，出现不同的反应，这是体内尿酸正排出，改善后渐渐正常。 25.耳鸣：脑部血液循环不佳、耳部神经传导不良，改善以后就会渐渐消失。 26.昏睡：肝脏解毒功能不良，脑细胞抑制功能正在修复，恢复期需好好休息。随着细胞恢复，渐渐正常。
精心整理 多肽合成技术多肽化学已经走过了一百多年的光辉历程，1902年，EmilFischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相当困难，而且容易导致肽链断裂。直到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸的条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，随着越来越多的生物活性多肽的发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成方法以及保护基的研究，因此这一阶段的研究成果也非常丰富，人们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素（oxytocin），胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现也提供了实验和理论基础。也就是这个阶段，FredSanger 发明了氨基酸序列测定方法，并为此获得了1958年的Nobel化学奖。还是他后来发明了DNA序列检测方法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到目前为止唯一获得两次Nobel化学奖的科学家。1963年，Merrifield 提出了固相多肽合成方法（SPPS），这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出来，就由于其合成方便，迅速，现在已经成为多肽合成的首选方法，随后的发展也证明了该方法不仅仅是一种合成方法，而且也带来了有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科，固相有机合成（SPOS）。当然，Merrifield也因此荣获了1984年的Nobel化学奖。也正是Merrifield，他经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量的脱除，反应也非常迅速，在30min就可以反应完全。由于叔丁氧羰基（BOC）方法中，氨基酸侧链的保护基团大多基于苄基（Bzl），因此也称为BOC-Bzl策略。同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，LouCarpino首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。 多肽化学合成的基本介绍 多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和Z两种保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具有保护基选择多，成本低廉，合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，液相合成主要缺点是，合成范围小，一般都集中在10个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。固相合成方法现在主要采用FMOC和BOC两种方法，它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到30个氨基酸左右多肽。 1.1．氨基酸保护基 20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，直接决定了合成能够成功的关键。因为常见的20中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保护基在合成过程中稳定，无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。合成中需要进行保护的氨基酸包括：Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。需要进行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。
实施例1 本发明多肽的合成 1)实验仪器与材料: 二甲基甲酰胺（DMF），哌啶，树脂，二氯甲烷（DCM），茚三酮反应试剂（茚三酮，维C，苯酚），四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），六氢吡啶（哌啶），三异丙基硅烷TIS,乙二硫醇（EDT），无水乙醚，三氟乙酸（TFA），N-甲基吗啉（NMM），甲醇，各种氨基酸,Fmoc-e-Acp-OH,FITC，多肽固相合成管。 2）溶液配制 脱保护溶剂——六氢吡啶：DMF=1：4 反应液——NMM:DMF=1：24 裂解液——TFA(92.5%)TIS(2.5%)EDT(2.5%) 茚三酮测试液——茚三酮、vc、苯酚各一滴 荧光偶联溶剂——吡啶：DMF：DCM=12:7:5 2)实验步骤: 称量树脂并投入到多肽固相合成管（以下简称反应器）中，加入适量的DMF 溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，10min于摇床。抽掉去保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂（约5~10mg）于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。分别按照SEQ.1- SEQ.N肽的氨基酸序列顺序取相应氨基酸、HBTU （氨基酸：HBTU=1:1），用反应液溶解，投入到反应器中，搅拌反应。1-2小时后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉反应器中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护——氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到序列号为SEQ ID NO.1 –N+1的肽。反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂2-3次，甲醇洗两次，继续抽干15-20min。反应器中取出合成完的肽树脂，在室温下于裂解液（裂解液先冰浴20min）中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，用无水乙醚（冰浴）洗3次。粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90%。所得到的纯肽使用质谱(MS, electrospray)鉴定。 至最后一个肽合成后，取出部分加荧光标记。先将Fmoc-e-Acp-OH按氨基
食品酶学 课程论文 题目：酶水解大豆多肽的研究进展 组员： 指导教师：高向阳副教授 学院名称：食品学院专业名称：食品科学与安全 二零一四年六月三
酶水解大豆多肽研究进展 摘要：大豆多肽是大豆蛋白经水解所得的低聚肽混合物,其生产方式多种多样, 其中酶法生产大豆多肽以其特有的优势得到了广泛的关注.本文综述了水解大 豆复合酶的分类、方法、研究进展及应用。 关键词：大豆多肽酶水解三酶复合双酶复合 前言 关于酶法制备大豆多肽中酶的选择，在制备过程，正确选择和使用蛋白酶是关键。通常，可选用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，也可使用菠萝和木瓜等植物蛋白酶，但目前应用较广主要是枯草杆菌1389、放线菌166、栖土曲霉3942、黑曲霉3350和地衣型芽孢杆菌2709等微生物蛋白酶。 目前酶水解大豆多肽主要有三种方式，一是单酶水解，二是双酶复合水解，三是三酶水解。单酶水解本身存在一定的缺陷，水解大豆多肽的效果未必能达到最优，于是引入了双酶复合水解，解决水解效率问题的同时解决单酶水解可能产生副产品或气味不佳的问题。另外，三酶复合能更大程度地优化水解效率。 1 蛋白酶 1.1 动物蛋白酶
来源于动物的蛋白酶一般是从动物的内脏中提取的，如胃蛋白酶主要采用联产工艺，将提取胃膜素留下的母液，经过一步处理提取出胃蛋白酶。可以说动物蛋白酶来源有限，加之提取工艺相对复杂，故价格一般比较高。例如，北京拜尔迪生技术有限公司销售的美国Sigma 公司生产的1 ∶10 000的胃蛋白酶价格为16 元/g , 美国Amresco公司生产的Try psin的胰蛋白酶(> 2 500U/mg)的价格则高达375 元/g。如此高的价格无疑限制了动物蛋白酶在大豆多肽工业生产上的应用。 1.2 植物蛋白酶 植物蛋白酶的原料比较丰富，从一些植物的成熟果实中就可以提取植物蛋白酶，生产工艺相对简单，价格低，例如北京拜尔迪生物技术有限公司销售的美国Sigma 公司生产的papain 木瓜蛋白酶(2 U/mg)的价格为12 元/g；国产的就更便宜，如北京玉林迈得生物技术有限公司销售的国产木瓜蛋白酶(300 U/mg)售价仅为6 元/g。 经过对酶的价格、酶解工艺条件及酶解产品特性的对比分析可发现，以微生物蛋白酶作为酶源是最为合适的。因为，以微生物蛋白酶作为酶源具有很多的优越性，如微生物种类繁多(自然界中存在的所有酶都可以在微生物中找到)、酶产量高(可通过人为改变微生物培养条件，加大目的酶的产量)、生长周期短(一般微生物的生长速度是农作物的500 倍，家畜的100 倍)、生产成本低(培养基原料大都比较廉价, 如麸皮、米糠、豆饼等)、生产易管理(目前多位自控发酵罐可根据需要随时改变培养条件),还可通过生物技术进行定向改造从而得到原本不能得到的酶或有特定效用的酶, 随着固定化酶技术的完善，微生物蛋白酶的应用成本必将得到进一步的降低，而水解效率则会得到大大的提升。