单位代码10635
学号112011326002007
硕士学位论文
玉米籽粒花色苷含量主效QTL-AC6的精细
定位及基因预测
论文作者：王旭
指导教师：蔡一林教授
学科专业：作物遗传育种
研究方向：玉米分子育种
提交论文日期：2014年04月10日
论文答辩日期：2014年05月27日
学位授予单位：西南大学
中国 重庆
2014年5月
Dissertation for Master's Degree of Southwest University
Fine mapping of the main effect QTL-AC6 and gene prediction for Anthocyanins content in kernel of maize.
Master's degree candidate: Wang Xu
Supervisor: Professor Cai Yilin
Major: Crop Genetics and Breeding
Direction: Maize Molecular Breeding
Chongqing China
May 2014
独创性声明
学位论文题目：玉米籽粒花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位及基因预测
本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。
学位论文作者：签字日期：年月日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，■保密期限至 2016 年 7 月止）。
学位论文作者签名：导师签名：
签字日期：年月日签字日期：年月日
目录
目录
摘要................................................................................................................................................... I Abstract .............................................................................................................................................. III 第1章文献综述 .. (1)
1.1 QTL精细定位策略及研究进展 (1)
1.1.1 QTL精细定位 (1)
1.1.2 QTL 精细定位策略 (2)
1.2作物QTL近等基因系的构建及其利用价值 (4)
1.2.1近等基因系的定义 (4)
1.2.2用于QTL近等基因系的构建方法 (5)
1.2.3近等基因系的利用价值 (5)
1.3作物QTL功能及其克隆策略研究进展 (7)
1.3.1作物QTL克隆策略 (8)
1.3.2作物QTL克隆及其功能研究进展 (9)
1.4玉米花色苷的研究进展 (9)
1.4.1花色苷的生理功能 (9)
1.4.2花色苷的结构和代谢途径 (10)
1.4.3控制花色苷合成的结构基因和调节基因 (11)
第2章引言 (13)
2.1本研究的意义和目的 (13)
2.2技术路线 (15)
第3章AP6近等基因系的构建及其精细定位 (17)
3.1 材料与方法 (17)
3.1.1试验时间、地点 (17)
3.1.2试验材料 (17)
3.1.3试验方法 (17)
3.1.4连锁图谱构建 (21)
3.1.5背景恢复率的计算 (21)
3.1.6QTL定位方法及效应分析 (21)
3.1.7目标区段基因注释与预测 (21)
3.1.8相关基因的克隆 (22)
第4章结果与分析 (25)
4.1 AC6近等基因系的构建 (25)
4.2 AC6 BC4F3分离群体的表型鉴定 (26)
4.3目标QTL区段精细连锁图谱构建 (27)
4.4 AC6的遗传效应分析 (27)
4.5 AC6区段标记开发 (28)
4.6 AC6精细定位 (29)
4.7 基因预测 (31)
4.8克隆目的基因 (32)
第5章讨论 (33)
5.1 QTL标记辅助选择对近等基因系构建的有效性 (33)
5.2 近等基因系BC4F3分离群体与BC4F2及F2:3定位结果的比较 (33)
i
5.3 AC6精细定位效果 (34)
5.4基因预测及克隆 (34)
参考文献 (37)
附录 (45)
致谢 (47)
发表论文、参加课题及获奖情况一览表 (49)
i i
摘要
玉米籽粒花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位及基因预测
研究生：王旭
专业：作物遗传育种
指导老师：蔡一林教授
摘要
随着生活水平的提高以及饮食结构的调整，人们对玉米的营养品质要求越来越高。玉米籽粒中色素的成分和含量与玉米的营养品质密切相关，不同颜色的玉米所含的色素成分不同，其功能性品质作为重要的营养品质之一，对增进人体健康、防治疾病起着非常重要的作用，是发展天然保健食品的重要原材料，同时也广泛应用于化妆品、医药等行业中。黑玉米富含花色苷，对人体具有多种生理生化功能。所以，黑玉米是研究花色苷的良好材料。认识花色苷的遗传规律，可以为玉米的功能性品质在天然保健食品、化妆品、医药等领域中的应用提供新的参考和借鉴，为玉米中花色苷相关基础研究及玉米花色苷的分子标记辅助育种提供参考。
黑玉米材料SDM (super dark maize)是西南大学玉米研究所自主选育的一个特异玉米自交系，本研究使用SDM为共同父本，分别与黄玉米自交系Mo17和白玉米自交系木6杂交，构建两套相关分离群体，即MoS群体和MuS群体，对花色苷的遗传规律进行研究。前人已将控制花色苷含量的主效QTL-AC6定位在第6染色体的分子标记S8-umc1014之间。本研究将延续前人研究结果，利用AC6的近等基因系的分离群体BF4C3进一步对花色苷含量的主效QTL-AC6进行定位，并利用该近等基因系上一世代的交换单株自交的后代群体对AC6进行精细定位。分析定位的区间附近的基因组序列，对该段区域上的基因进行注释。主要研究结果如下：
1.BC4F3群体精细遗传图谱的构建
选取目标QTL区域附近已有的SSR多态性标记以及开发新的多态性标记，分别用8对和7对SSR多态性标记对MuS-BC4F3群体和MoS-BC4F3群体构建精细的连锁图谱。在MuS-BC4F3群体的精细的遗传图谱中，每个分子标记之间的平均遗传距离是0.46 cM，在MoS-BC4F3群体的精细的遗传图谱中，每个分子标记之间的平均遗传距离是1.41 cM。
I
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2.花色苷含量主效QTL-AC6的精细定位
利用MuS-BC4F3和MoS-BC4F3两个近等基因系的分离群体将主效QTL-AC6分别限定于分子标记S8-umc1014和umc1014-mmc0523之间，两个区间紧密连接一起，具有共同分子标记umc1014。利用上一世代的交换单株自交后代BC4F3对AC6进行精细定位，在MuS群体和MoS群体中，分别筛选到10株交换单株。根据交换单株标记的基因型和表型，将AC6界定在分子标记ssr9-umc1014和S73-umc1014之间，且两个区间重合。其中ssr9与umc1014的物理距离为255KB，S73与umc1014的物理距离为114KB。
3.定位区间的基因注释和预测
利用https://www.doczj.com/doc/4918384855.html,、https://www.doczj.com/doc/4918384855.html,/berry.phtml、http://www.blast2go.de/ b2ghome等生物信息学网站对锁定区域进行分析，对目标序列上的基因进行注释。该片段上共有49个转座子，29个还原转座子，8个假设蛋白，31个基因。通过NCBI(https://www.doczj.com/doc/4918384855.html,/Blast.cgi)公布的信息比对分析后发现在这定位区域内，pl transcription factor是一个血红素加氧酶基因，参与玉米的色素调节。从其他研究者已经分离的花色苷含量相关基因在染色体中的分布情况来看，在第6染色体上也正好是这个基因，所以，pl transcription factor极有可能就是候选基因。但对该基因克隆过程中发现，使用多种扩增条件都无法将该基因克隆出来。分析其主要原因，可能是在突变材料SDM中，pl transcription factor这一区域插入了一段未知长度的DNA序列，导致在SDM中无法克隆出该基因。
关键词：玉米；花色苷含量；QTL精细定位；基因预测。
I I
Fine mapping of the main effect QTL-AC6 and gene
prediction for Anthocyanin content in kernel of maize.
Candidate: Wang Xu
Major: Crop Genetics and Breeding
Supervisor: Professor Cai Yilin
Abstract
With the improvement of living standard and the adjustment of the diet, the nutritional quality of maize is increasingly high required. Composition and content of the pigment are closely related to the nutritional quality of maize kernel. The pigment composition changes with the different colors of maize kernel. As one of the important nutritional quality, anthocyanin plays an important role in improving human health and preventing disease. Maize is not only an important raw material for the development of natural health food, but also is widely used in cosmetics, medicine and industries. Black maize is rich in anthocyanins, which possesses a variety of physiological and biochemical functions to the human body. Hence, black maize is a good material for anthocyanins study. The understanding of the genetic rule of anthocyanins provide a new reference for the application of the functional quality in natural health food, cosmetics, medicine and other fields. Meanwhile, it gives some reference for maize anthocyanins relative basic research and molecular marker assisted breeding.
Black maize SDM (super dark maize) is a specific maize inbred line created by maize research institute of southwest university. In this study, SDM was used as common male parent to create two populations MoS from the cross Mo17×SDM and MuS from Mu6×SDM for studying the genetic rule of anthocyanin. QTL-AC6, the main effect QTL controlling of anthocyanin content, located in the common interval of S8-umc1014 on chromosome 6. To continue the previous research, BF4C3 was used for further positioning QTL-AC6. The progeny from one plant of the last generation of near isogenic line was used to fine mapping AC6. Then, the genome sequences of the nearby positioning area were analysised and genes within this region were annotated. The main results were as follows:
III
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1. The construction of fine genetic map of BC4F3 population
By selecting the existing SSR polymorphism markers and the new developed polymorphism markers nearby the target QTL regions, seven pairs and eight pairs of SSR polymorphism markers were used to constract fine linkage map for MuS-BC4F3population and MoS-BC4F3population, respectively. The average genetic distance between each molecular marker was 0.46 cM in the fine genetic map of MuS -BC4F3 population and 1.41 cM. in MoS-BC4F3 population.
2. Fine mapping of the main effect QTL-AC6 of Anthocyanins content
Two near isogenic line segregation populations of MuS-BC4F3 and MoS-BC4F3 were used to restrict the main effect QTL-AC6in the interval of S8-umc1014 and umc1014-mmc0523 respectively, which were close to each other, sharing the common umc1014 molecular marker. Selfing generation BC4F3 of single plant of last generation was used to fine mapping AC6. In MuS population and MoS population, 10 single plants were screened respectively. According to the marker genotype and phenotype of the single plant, AC6was defined in molecular marker ssr9-umc1014 and S73-umc1014, and the two regions overlapped. The physical distance between ssr9 and umc1014 was 255 KB, while the distance between S73 and umc1014 was 114 KB.
3. Gene annotation and prediction of the positioning region
https://www.doczj.com/doc/4918384855.html,,https://www.doczj.com/doc/4918384855.html,/berry.phtml,http://www.blast2go.de/
b2ghome were used for analysis of locking region and the annotation of genes. A total of 49 transposons, 29 retrotransposons, 8 assumptions protein, 31 gene were found. Further information comparative analysis by using NCBI (https://www.doczj.com/doc/4918384855.html,/Blast.cgi) reveals that within the positioning area, pl transcription factor was a heme oxygenase gene, participating in maize pigment regulation. From the results of other researchers who had separated related gene of anthocyanins content, pl was also located on chromosome 6. Therefore, pl transcription factor was most likely the candidate gene. The gene was not cloned with a variaty of amplification conditions in the process of gene cloning. The main reason maybe that an unkown length DNA sequence was inserted into pl transcription factor in mutant materials SDM, resulting that the gene was not cloned in SDM.
Key wards：maize；anthocyanin content；QTL fine mapping；gene prediction.
I V
第1章文献综述
第1章文献综述
1.1 QTL精细定位策略及研究进展
1.1.1 QTL精细定位
一般情况下，QTL的初步定位只能将其定位到染色体的一个区段范围之内，标记区间的大小通常为10-30cM（Kearsey and Farquhar 1998），在这么大的区间内很难确定QTL的具体位置，也很难确定该区间内是否只包含一个QTL，或者是几个QTL共同作用，从而无法将控制某性状的基因确定出来。因此，发展新的定位方法对QTL进行精细定位很有必要。就目前来说，对QTL的精细定位主要可以从以下三个方向着手：
第一，统计方法的合理利用和新的统计方法的开发可以挖掘更多潜在的信息。首先是基于连锁不平衡而提出的关联分析（Bodmer 1986），该方法不用构建连锁群而且解析度较高，它的精度取决于群体的连锁不平衡结构，在人体复杂疾病的QTL定位中有着举足轻重的地位，但是其在作物中的应用较少。为了克服关联分析假阳性较高的缺点，Pritchard结合群体结构估计与关联分析提出了新方法（Pritchard and Rosenberg 1999），Yu等人也提出了混合模型方法（Yu et al. 2005）。将连锁不平衡与连锁信息结合，精度更高而且可以直接利用QTL 区间的候选基因进行基因互补检验（Wu and Zeng 2001）。
第二，可以通过增加重组机会提高QTL定位的精度。这包括高代回交系（Davasi and Soller 1995；Xiong and Guo 1997）、选择表型、轮回选择与回交系（Wright 1952；Hill 1998；Luo et al. 2002；Luo and Ma 2004）、高代回交系（Tanksley and Nelson, 1996）和育成品种群体（Zhang et al. 2005）等。其中高代回交系为没有进行选择的轮回选择与回交系，在作物精细定位中最为常用。
第三，利用次级分离群体是QTL精细定位最为重要的手段，初级作图群体定位结果偏差大的主要原因是群体内个体间遗传背景不同，次级群体消除了遗传背景和QTL间的互作感染，使得QTL作图更为准确。（根据与初级定位群体的关系，次级群体可以分为两类，一类是由初级定位群体衍生而来，比如近等基因系（Near Isogenic Lines，NILs），QTL等基因系（QTL Isogenic Recombinants，QIRs）；另一类是与初级定位没有关系的代换系群体，如单片段代换系(Single Segment Substitution Lines, SSSLs)，染色体片段代换系(Chromosome Segment Substitute Lines，CSSLs)，不同的次级群体的构建过程和特点各不相同(蒋洪蔚等，2008)。如表1：
1
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2
表1 不同次级群体的构建过程及特点
Table 1 The establishment and characterization of diffenrent secondary population 群体构建过程及特点优点缺点
NILs 以带有目标性状的供体亲本与拟导入这一目标性状的受体亲本进行杂交，再用轮回亲本多次回交，
回交至一定世代后自交分离，即可获得遗传背景
与轮回亲本相近却带有目标性状的品系。遗传背景一致，精细
定位准确，可估计基
因间上位性效应。
一次杂交和多次回
交，构建时间长，工
作量大。
QIRs 首先利用小群体采用初级定位方法完成QTL定位，然后利用大群体进行精细定位。大群体的每
个个体在QTL位点均发生了一次重组，但在其它
区域均一致。群体容易构建，而且
可精细定位到1cM的
范围内。
群体大使得分子标记
检测量大，且存在背
景干扰，不能检测到
上位性效应。
SSSLs 通过多代回交，获得只存在供体亲本的一个代换片段的差异，基因组其它部分与受体亲本完全相
同。遗传背景一致，精细
定位效果好，并检测
上位性效应。
群体构建时间长，工
作较繁琐。
CSSLs 采用受体亲本对F1进行连续回交，然后通过对供体亲本的染色体片段进行分子标记选择得到的高
代回交群体。遗传背景一致，精细
定位准确性较高，可
检测上位性效应。
构建时间较长，工作
量大。
1.1.2 QTL 精细定位策略
大量研究表明，影响QTL初级定位精确度和灵敏度的最重要因素是群体的大小。但是，在实际研究中，由于受到费用和工作量等限制，所用的初级定位群体不可能很大。因此，无论怎样改进统计分析的方法，也无法使得初级定位的精度或分辨率达到很高，估计出来的QTL的置信区间一般都在10cM以上（Zeng 1994；Alpert and Tanksley 1996），也不能确定检测到的QTL中到底是只包含一个效应比较大的基因，还是包含数个效应比较小的基因（Yano and Sasaki 1997）。也就是说，初级定位的精度还不能够将数量性状确切地划分成单个的孟德尔因子。因此，为了使数量性状的遗传基础被更精确地了解，在初级定位的基础之上，还必须对QTL进行高分辨率的精细定位，也就是在目标QTL区域上建立更高的分辨率的分子标记图谱，并分析目标QTL与标记之间的连锁关系。
1.1.
2.1 单个QTL的精细定位
对某个QTL进行精细定位，必须使用含有目标QTL染色体片段的代换系或近等基因系，使得除了目标QTL所在的染色体片段之外，基因组的其他部分全都和受体亲本相同，这样可以最大限度地消除由遗传背景差异带来的干扰，从统计方面和遗传方面为QTL的精确定位提
第1章文献综述
供了保证。
对于已经初步定位了的主效QTL，可以采取回交结合分子标记辅助选择(MAS，marker-assisted selection)的方法，对目标QTL区域实行前景选择，对其它区域实背景选择，快速构建染色体片段代换系或者近等基因系，用于精细定位。Yamamoto应用水稻基因组染色体片段替代系，成功地对控制水稻抽穗期的QTL进行了精细定位，分辨率超过0.5cM （Y amamoto et al. 1996）。不过，这种方法特别的费工费时，而且只能用在效应比较大的QTL 的精细定位。能否在目标QTL区域附近找到分子标记，是进行精细定位的另一个限制因素（Tanksley 1993）。为了寻找到分子标记，往往需要做大量的筛选。例如，在对控制番茄果重的QTL(fw2.2)的精细定位中，用了600个引物才筛选到2个R APD标记(Fridman et al. 2000)。
1.1.
2.2 全基因组QTL的精细定位
为系统地开展QTL的精细定位，往往需要构建立一套覆盖全基因组的相互重叠的染色体片段代换系，也就是在一个受体亲本的遗传背景中构建供体亲本的“基因文库”。代换系重叠群的建立同样是采用多代回交的方式，但是，需要借助完整的分子标记图谱以及分子标记辅助选择技术。十字花科物种和番茄中已经建立了此类代换系重叠群。目标片段代换系的分析方法和单个的Q TL精细定位相同，但是工作量很大（方宣钧，2001）。
使用代换系重叠群对Q TL进行精细定位之前，必须多年多点对代换系进行重复试验，以确定目标代换系的代换片段上带有控制目标性状的QTL。各个目标代换系可以分别与受体亲本进行回交，也可以在不同的目标代换系间进行杂交，后者的优点主要有两个方面，一是进一步缩小QTL所在位置的区间，二是可以分析不同的QTL之间的相互作用，因为有一些QTL 单独存在时没有效应，需要与其他QTL共同存在或共同作用时，才能表现出上位性效应。1.1.3 作物QTL精细定位研究进展
近年来，在QTL的精细定位方面已经有大量的报道。Yu（Yu et al. 1991）在籼稻近等基因系C101A501中定位到了一个抗稻瘟病的显性主效基因Pi-2（t），该基因是位于第6染色体的短臂上。随后，吴金红等（吴金红，2002）将Pi-2（t）精细定位在标记RG64和AP22之间，遗传距离分别为1.2 cM和0.9 cM。Dorweiler（Dorweiler et al. 1993）使用近等基因系将控制玉米和大刍草主穗差异的基因座T GA1，精确定位成为孟德尔基因。Yamamoto（Yamamoto et al. 1998）用连续重复回交选育的方法获得了水稻抽穗期的近等基因系，将存在于第6染色体上的控制抽穗期的主效QTL（Hd1）定位于相距0.6 cM的分子标记R1697和P130之间。Tanksley使用番茄近等基因系对控制果实重量的主效QTL fw2.2进行了精细定位，构建了物
3
理图谱（Tanksley et al.，1996）。邢永忠（邢永忠等，2001）从重组自交系中选择出遗传背景高度一致的自交系配组，建立近等基因系，使位于第7染色体上的同一区间内控制水稻抽穗期和株高的主效QTL同时以单个的孟德尔遗传因子表现。精细定位这些QTL之后，可以凭借已经完成测序的水稻全基因组数据库，研究与之相对应的基因组区域，以获得包含这些QTL的序列，便于深入研究。
Li等（Li et al. 2006）使用康乃尔大学选育的热带粳稻品种J efferson作为轮回亲本，和普通野生水稻材料IRGC-105491配置组合，利用回交群体，把控制粒重的基因gw3.1精细定位于第3号染色体的标记JL123h和JL109之间，区间大小为93.8 KB。gw3.1具有增加粒重的效果。该研究还表明，利用回交能够排除其他微效基因的影响，增大主效QTL的贡献率，提高定位的准确度。
Xiao等(Xiao et al. 2006)利用韩国的优良栽培品种(Hwaseongbyeo)与野生稻IRGC-105491杂交，构建回交群体BC3F4，将gw8.1定位于第8号染色体的分子标记RM23201．CNR151和RM30000．CNR99的306.4 KB范围之间，该粒重基因和水稻谷粒品质性状以及株高没有相关性。
Zheng（Zheng et al. 2008）使用高油自交系ASKC28IB1作为供体亲本，和低油自交系PH09B构建了BC2群体，定位到位于第6染色体的一个控制油分的QTL(qHO6)。之后，又利用分子标记辅助选择，建立了一系列含有不同的ASKC28IB1重叠片段长度的近等基因系，将qHO6定位到S SR标记UMC1145和SNP标记M ZA5002之间，区间大小为4.2 cM。随后利用SNP标记对4000株BC5F1群体进行了分析，发现该QTL位于DGAT基因的3’端，而3’端的唯一差异只是苯丙氨酸的插入。最后证实插入的苯丙氨酸对高油玉米油份的含量和油酸含量的提高起到了重要的作用。
1.2作物QTL近等基因系的构建及其利用价值
1.2.1近等基因系的定义
近等基因系（near-isogenic lines，NIL）是指一个遗传背景相同，除了某一两个基因外，其他基因都相同的两个遗传材料，是经过一系列、长期的回交过程所产生的株系（Young et al，1988）。在育种实践工作中，将带有目标基因的供体亲本与作为受体的轮回亲本进行杂交，并多次回交，每代只选择具有目标基因的个体与轮回亲本进行回交，从而获得的除目标基因片段外其余遗传背景与轮回亲本一致的品系（Muclmore et al.1988）。
1.2.2用于QTL近等基因系的构建方法
近等基因系的构建是通过一系列重复的回交过程。当某一优良品种缺少一、两个优良性状时，通常是采用连续回交的方法，将它所缺少的控制优良性状的基因，从外缘种质中转移到优良品种里。在回交过程中，需要应用分子标记辅助选择（MAS，marker-assisted selection）的方式对目标基因进行前景选择，同时对其进行背景选择，使其后代连续不断地朝着轮回亲本的遗传背景方向纯合。培育植物近等基因系主要有以下选育方法（张洁夫，2002）：第一，多次回交选育法。就是将材料与轮回亲本连续回交，通常需回交6代以上。即替换掉控制目标性状的等位基因，使育成材料除目标性状与轮回亲本存在差异外，其遗传背景逐步接近轮回亲本或与轮回亲本一致，从而两者成为近等基因系。该方法是培育近等基因系中最常用的方法，如农作物抗病、抗逆性近等基因系的构建。
第二，从突变体中分离获得。通常情况下，单个位点的突变并不会引起其他位点的变异。即通过诱变获得的突变体与原品种（系）相比，除突变位点存在差异之外，其他位点基本一致，从而可以从中选育出近等基因系。
第三，结合分子标记检测技术连续回交选育法。一般先进行若干代回交试验，在建立多次回交群体的基础上，对目标基因进行前景选择，同时进行背景选择。选择与目标性状紧密连锁的分子标记进行检测，选育近等基因系。随着分子标记技术的不断进步和完善，这一方法正在成为近等基因系选育的有效方法之一。
第四，杂交高世代分离群体材料中分离选育。由于在杂交高世代群体中，大多数控制性状的基因趋于纯合，仅少数基因处于杂合状态，在此基础上从中选育具有目标性状差异的品系构建近等基因系。
1.2.3近等基因系的利用价值
目前，用于作物数量性状基因座位研究的作图群体多种多样，根据作图群体中个体间遗传背景差异程度和对QTL检测的分辨率来看可分为初级群体和高级群体。
初级群体是指由两个遗传差异相对较大的亲本相互杂交而建立的分离群体，这类分离群体的特点是全基因组均发生分离，其中主要包括F2、F3、BC1、RILs（recombinantinbred lines）、DH（double hap-1oid）等。
高级作图群体主要是指近等基因系类群体，其特征是在群体内，个体间的遗传背景相似，仅带有少数供体片断。例如导入系或渗入系（Introgression Lines，ILs）和替换系（Substitution
lines，SLs），它们都是通过连续重复的回交和分子标记辅助选择来完成的。近等基因系与受体亲本的差别主要在目标QTL所在的染色体区域，所以，它们之间的任何表型性状的差异都来源于这个供体片段。从近等基因系发展而来的分离群体，只在与亲本有差异的染色体区域发生分离，从而消除背景的干扰及主效QTL对微效QTL的掩盖作用。因此，利用近等基因系发展而来的分离群体是非常适合进行QTL精细定位、QTL互作、品种改良等的良好材料。
1.2.3.1利用近等基因系对QTL精细定位
Takeuchi等（Takeuchi et al. 2003）用一个只含有单个供体染色体片段的近等基因系群体（96株），对水稻的两个紧密连锁的QTL：种子休眠性（Seed dormancy）QTL-Sdr1和抽穗天数QTL-Hd8进行精细定位，将Sdr1定位在RFLP标记R10942和C2045之间，与C1488共分离；将Hd8定位于RFLP标记C1534S和R10942之间。Hittalmani（Hittalmani et a1. 2002）和Berruyer （Berruyer et al. 2003）用近等基因系分离群体对水稻的四个抗稻瘟病基因：Pi1、Piz-5、P ita和Pi33进行了精细定位。Murai（Murai et al. 2001）用近等基因系分离群体把水稻抗褐飞虱抗性基因bph2定位在1.0 cM的范围之内，距离AFLP标记KAM3的遗传距离为
0.2 cM，距标记KAM5的遗传距离为0.8 cM，与标记KAM4共分离。
1.2.3.2利用近等基因系研究QTL之间的互作
Yamamoto（Yamamoto et a1. 1998）利用分别带有水稻抽穗天数的QTL-Hd1、Hd2、Hd3三个近等基因系相互杂交，研究了三个QTL间的互作，结果表明，Hd1和Hd2、Hd2和Hd3、Hd1和Hd3之间都存在上位性互作。进一步研究表明，在田间条件下，控制水稻的抽穗天数的QTL-Hd2对另一个控制抽穗天数的QTL-Hd6也有上位性互作效应，即Hd2的存在掩盖Hd6对延长抽穗天数的特性（Yamamotoet a1. 2000）。
1.2.3.3利用近等基因系对QTL 克隆
Yano（Yano et al.2000）利用含有1505个单株的近等基因系群体对水稻的光敏感Q TL-Hd1进行了图位克隆（Map-based cloning），将Hd1定位在12 KB的范围内。进一步的分析表明，Hd1基因与控制拟南芥开花期的基因CONSTANS相似。Takahashi（Takahashi et a1．2001）利用近等基因系对控制水稻光周期敏感的QTL-Hd6进行了图位克隆，将Hd6界定在26.4 KB 的区域内，Hd6编码蛋白激酶CK2的一个亚单位。Blair（Blair et al．2003）利用含有1016个单株的的等基因系群体把控制水稻抗白叶枯病的基因Xa5定位于70KB的范围内，该区域内包含11个开放阅读框（ORF：open reading frame）。Gu（Gu et a1. 2004）利用含有2369个单株的近等基因系群体，对控制水稻抗白叶枯病抗性基因xa27进行了精细定位，将xa27定
位于第6号染色体长臂上的分子标记M1081与M1059之间。用染色体着陆法（chromosome landing）把xa27定位于0.052 cM 的基因组范围之内，处于分子标记M964和M1197之间，与分子标记M631、M1230和M499共分离。
1.2.3.4利用近等基因系对品种改良
在作物品种改良方面，很多育种专家对一些地方品种、野生种及可杂交的近缘物种中的特殊种质资源非常青睐，在育种工作上常利用某一作物的栽培品种作为轮回亲本（RP），含有优良性状基因的种质资源作为供体亲本（DP），进行杂交。然后经多次重复回交，把优良性状如抗病性、抗虫性导人栽培品种中。在回交过程中，选择基因组与轮回亲本的基因逐步趋近，且具有供体目标基因的后代株系，两者的相似程度随回交世代数的增加而增加，而在轮回亲本的近等基因系中，非目的基因的供体亲本的染色体片段和位点逐代减少，这样的回交后代株系和轮回亲本组成了一对近等基因系。也就是说近等基因系是遗传背景相同，然而等位基因性质不同的一组品系，在过去的研究中，由于品种之间遗传背景的不同，往往无法比较出控制品种间某个性状的基因型的差异，而应用近等基因第则可以克服这种困扰。国外利用某些携有抗病害、虫害不同抗性基因的近等基因系作为一致遗传背景的抗性鉴别品种，鉴定和检测小种（生物型）及新的抗性基因，或直接用作为育种计划的供体（Paterson 1993 ）。
Bcmacchi（Bcmacchi et a1. 1998）定位番茄的15个基因组区段作为目标，通过RFLP标记辅助选择，建立了23个含有单个供体染色体片段的近等基因系，并进一步对这些近等基因系的控制7个性状的25个数量性状因子进行效应分析。有22个（88％）数量性状因子表型得到了不同程度的改良。Saito（Saito et a1. 2001）依据早代用双单倍体群体对水稻根部性状QTL定位的结果，通过标记辅助选择以及回交跟踪4个目标区段，构建了水稻根部性状的29个近等基因系；其中，1个近等基因系可以明显改良受体亲本IR64的根部性状，3个近等基因系可以明显改良水稻的深水根重，1个近等基因系可以明显改良水稻的最大根长。
另外，近等基因系还是在基因水平上研究抗性遗传和机制的极佳的材料。通过对近等基因的分析，表明多态性的片段可能就是和目标基因相连锁的分子标记，并且可对分离后代的分析来验证（姚景侠等，1990；钟少斌等，1993；刘金元，1996；李松涛等，1995；贾继增等，1996；朴春根等，1997；刘秉华，1997）。
1.3作物QTL功能及其克隆策略研究进展
基因组学时代的首要任务是制作图谱和测定序列，后基因组学时代则是对基因组功能进行注释(Genome annotation)，这同样是功能基因组学的首要研究目标。基因克隆是使用体外
重组技术把特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子内进行扩增，其目标就是识别分离出来的特异基因并获得基因的完整序列，确定染色体的定位，以及阐明其机理，并利用生物工程手段将其应用到生产实践中去。
1.3.1作物QTL克隆策略
首先，功能克隆法就是根据性状的基本生化特征，鉴定已知基因的功能后进而分离目标基因的一种方法。在生物种、属之间，基因编码区的同源性一般都比非编码区的高，如果克隆其他种、属的同源序列，构建含目标基因的cDNA文库，然后用已知的基因序列作为探针，可以克隆到同源基因。Wang (Wang et al. 1997)用一个稻谷β-淀粉酶cDNA作为探针，从玉米的cDNA文库中筛选出玉米的β-淀粉酶基因。Martin (Martin B et al. 1997)用绿豆C4H基因的cDNA作为探针，从拟南芥的cDNA文库中筛选出编码肉桂酸-4-羟基酶的基因(C4H)。分离出一个高纯度的蛋白质是功能克隆法的关键，但由于目前大多数基因的产物还不是很清楚，即使知道了，要纯化到可供氨基酸测序及制备抗体的蛋白质也非常困难。同时，由于遗传密码简并性的存在，推导出具有特异的探针是很难的。所以，很难用这一方法对大多数基因进行克隆。
其次，对未知产物基因克隆的方法主要有：图位克隆法、同源序列法、转座子标签法、差异基因表达的分离方法和表达序列标签法（EST）。图位克隆（Map-based cloning）又被称为定位克隆（Positional cloning），此方法是先把目标基因精确定位于分子标记连锁图上，利用与目的基因紧密连锁的标记筛选大片段DNA文库(如BAC、YAC、或Cosmid文库)，并构建含有目标基因区域的精细物理图谱，然后采用染色体步行(Chromosome walking) 的方法逐步逼近目的基因，最后，用含目标基因的大片段克隆做亚克隆分析，或作为探针筛选cDNA 文库，通过功能验证确定基因。众多研究者已经用图位克隆法分离和克隆了很多基因，例如拟南芥的脱落酸信号传导基因ABI3 (Giraudat et al.，1992 )和ω-3脂肪酸脱饱和酶基因F AD3 (Arondel et al.，1992)，番茄抗霜霉病基因Cf2基因(Dixon et al.，1996)和Pto (Martin et al.，1993)，水稻的分蘖数基因Moc1（Li et al.，2003）、水稻矮杆基因dll (Tanabeet al.，2005)，大麦抗白粉病基因Mol (McDowell et al.，1998)，小麦抗线虫基因Cre3 (Lagudahet al.，1997)，甜菜的Hslpro-1基因(Cai et al.，1997) 及200多个与人类遗传性疾病相关的基因克隆等。目前用图位克隆法而得到的QTL克隆主要有番茄果重QTL fw2.2 (Fridman et al.，2000)等克隆以及水稻抽穗期QTL Hd1 (Yano et al.,2000)、Hd3、Hd6。使用图位克隆的方法克隆基因的前提是：1、需要完整的基因组文库，2、饱和的分子标记连锁图，3、完善的遗传转化体系，4、
第1章文献综述
大量的测序工作。因而仅局限应用在人类、番茄、水稻、拟南芥等图谱饱和生物上。
转座子或T-DNA标签法。使用转座子插入到某一个功能基因的内部或者邻近区域时，就会使该基因失活，并诱导产生出突变型。以转座子DNA为探针，经过筛选变异株的基因文库，找到该转座子的部分片段，再以突变基因的部分序列作探针，从野生型文库里克隆出完整的基因。常用的转座子有金鱼草的Tam3和玉米的Ac/Ds、En/Smp。自从Fedoroff ( Fedoroff et al.1984)首次通过转座子标签法从玉米中克隆出B z1基因以来，已从玉米中克隆出了A1基因、C1基因、Kn1基因、Bz2等基因，从金鱼草中克隆出Deficiens基因(顾红雅，1995)、Pa1基因。T-DNA标签法和转座子标签法的基本原理是一致的，只是T-DNA标签法的突变由T-DNA的插入所致。Feldmann(Feldmann 1989)通过利用T-DNA插入，得到了拟南芥的矮化突变体。T-DNA标签法成功的关键是能否筛选出由转座子插入所致的突变体。
表达序列标签法（expressed sequence tag,EST）是在完整的基因上能够特异性标记基因的某一部分序列，从而与其它基因相区分，通常都包含了足够的基因结构信息区。大量的EST 克隆以及EST资料库的建立，为使用生物信息学的方法克隆基因提供了前提条件。林慧贤（林慧贤等2001）利用EST克隆得到了1个新的水稻GTP蛋白基因Osrab5B的cDNA克隆；Jantasuriyarat (Jantasuriyarat et al.2005)通过EST克隆鉴定了水稻稻瘟病感染的相关基因。
1.3.2作物QTL克隆及其功能研究进展
目前，拟南芥、水稻、番茄、玉米、马铃薯、甜菜、小麦、大麦、胡椒等作物都已经有克隆QTL的报道，其中，利用图位克隆法克隆得到的QTL主要来自番茄、拟南芥和水稻等模式植物。例如水稻抽穗期QTL Hd1、Hd6、Hd3和Ehd1；而分别作用于番茄糖含量、果重和果形的Brix9-2-5、fw2.2和Ovate；分别控制玉米开花期、玉米果壳进化和油分含量及组成成分的Vgt1、tga1和DGAT。
1.4玉米花色苷的研究进展
1.4.1花色苷的生理功能
花色苷的存在对植物体本身有许多重要的作用。花瓣中含有花色苷使其颜色鲜艳，有利于花粉传播和后代繁殖（赵昶灵，郭华春2007），种子和果实中花色苷的积累有利于预防害虫和紫外线的伤害，与其抗逆性密切相关（Hichem et al. 2009；Zhang et al. 2010；Takele 2010；Sperdouli&Moustakas 2012）。此外，花色苷对人体具有多种生理保健功能。花色苷最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力，花色苷的抗氧化能力是V E的50倍，V C的20倍，
西南大学硕士学位论文
而且其对人体的生物有效性是100%，服用后20分钟就能在血液中检测到（唐忠厚，周丽2009）。花色苷可以改善人和动物的整体视觉功能，研究报道，花色苷提高视觉灵敏度的主要原因是花色苷刺激视网膜色素再生（Matsumoto et al. 2003）。Hou等发现花色苷可以阻塞有活性的分裂素蛋白至活酶路径，从而有效抑制肿瘤的发生（Hou et al. 2004）。Makoto等发现花色苷提取物可有效抑制突变作用(Makoto et al. 2001)。花色苷在血管内皮细胞中的氧化应激保护作用可以效预防心血管疾病的发生（Youdim et al. 2000）。Tsuda等的试验证明花色苷可以作为功能保健食品，有效预防肥胖和糖尿病（Tsuda et al. 2003）。到目前，花色苷的抗微生物活性已被确定，比如抑制黄曲霉生物活性（Norton 1999）。花色苷常常与其他化学物质协同作用发挥生理功能，而且在不同组织器官中，各种代谢对花色苷的吸收、利用以及在体内积累的跟踪调查也很复杂，这些都为花色苷对人体的研究带来困难，但同时也表明花色苷的研究还有更多的空间。
黑玉米是玉米栽培中的一个变种，因籽粒中色素成分含量高而成黑色（紫色）。黑玉米中的主要色素成分是花色苷。花色苷是由苷元与葡萄糖以糖苷键形式结合形成的一类广泛存在于植物体内的类黄酮多酚化合物（赵昶灵，郭华春2007；张建霞等，2009），是构成植物花瓣、叶片、果实、种子等器官颜色的最主要水溶性色素（Klein et al. 1989；Tanaka et al. 2008；Park et al. 2011）。
1.4.2花色苷的结构和代谢途径
花色苷是花色素甘元与葡萄糖以糖苷键形式结合，其结构母核是2-苯基苯并吡喃阳离子，属于类黄酮化合物。自然界已知的花色苷根据其结构上的差异可以分为22类(Andersen et al. 2002；Devia et al. 2002)，其中食品中常见的包括6类(Escribano et al. 2004)。即矢车菊色素（50%）、天竺葵色素（12%）、飞燕草色素（12%）、芍药色素（12%）、牵牛色素（7%）和锦葵色素（7%），6类花色苷的结构如图1.1 (Kong et al. 2003)。自然条件下花色素（anthocyanidins）通常与葡萄糖、木糖等糖类结合，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷在自然界中分布最广(Kong et al. 2003)。黑（紫）玉米中所含的花色苷主要是矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-glu），矢车菊素-3半乳糖苷（Cy-3-gal），天竺葵色素-3-葡萄糖苷（Pg-3-glu），芍药色素-3-葡萄糖苷Pn-3-glu等（Dpascual-teresa et al. 2002；Cevallos-casals et al. 2003）。花色苷的生物代谢途径是目前研究的最为广泛和深入的植物次生代谢途径（Bartel and Matsuda 2003）。玉米、金鱼草和矮牵牛是研究花色苷代谢途径并分离基因的重要物种，代谢途径中的多数反应在三个物种中相同，在某些反应上不同的物种也存在差别。例如矮牵牛花通常情况下不产生天竺葵色素，玉米和金
第1章文献综述
鱼草不能产生飞燕草色素。
图1 食品中主要花色苷的结构
Figure 1 The main structures of anthocyanins in food
表2 各类花色苷的R1、R2基团
Table 2 The R1 and R2 of each anthocyanin.
花色苷Anthocyanin R1 R2
天竺葵色素Pelargonidin H H
矢车菊色素Cyanidin OH H
飞燕草色素Delphinidin OH OH 芍药色素Peonidin OCH3 H
牵牛色素Petunidin OCH3 OH
锦葵色素Malvidin OCH3 OCH3
1.4.3控制花色苷合成的结构基因和调节基因
目前研究者从遗传学、生理生化以及分子生物学等不同层面研究了植物花色苷的合成与分子调控，揭示出了花色苷合成途径中的10个相关酶，即苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、类黄酮-3’-羟化酶（F3’H）、类黄酮-3’5’-羟化酶（F3’5’H）、二氢黄铜-4-还原酶（DFR）、花色苷合酶（ANS）以及尿苷二磷酸葡萄糖-类黄酮-3-O-糖基转移酶（3GT）（Holton & Cornish 1995；赵昶灵，郭华春2007；Tanaka & Ohmiya, 2008）。植物中编码这些酶的基因（结构基因）均有克隆，其功能也均得到详细阐释（Holton & Cornish 1995；Winkel-Shirley 2006；Harborne & Williamsburg 2000；Martens et al. 2010）。目前，玉米花色苷合成途径中已报道的结构基因有c2、whp、chi1、pr1、f3h、a1、a2、bz1、bz2等（Paz-Ares et al. 1990；Holton & Cornish 1995；