里氏木霉产纤维素酶系各组分分泌特性
吴石金;罗锡平;夏一峰
【期刊名称】《浙江农林大学学报》
【年(卷),期】2003(020)002
【摘要】在液体发酵条件下,以纤维素粉或麦麸为不同碳源及添加碳酸钙和酵母膏对里氏木霉产纤维素酶系不同组分的最高酶活、比酶活及其形成时间、分泌规律等进行了探讨.结果表明:以纤维素粉或麦麸为不同碳源时,各组分的最高酶活、酶活比及其形成时间均有较大差异,并以混合碳源(1.0%纤维素粉+2.0%麦麸)时为最佳,内切型β-1,4-葡聚糖酶(C1)外节型β-1,4-葡聚糖酶(Cx)和β-葡萄糖苷酶(BG)的最高酶活分别达到76.18×10-5,313.25×10-5和135.59×10-5mol·s-1,比酶活分别为72.18×10-5,331.57×10-5和124.29×10-5mol·s-1,最高酶活形成时间为9～10 d.添加碳酸钙可明显提高C1和Cx的最高酶活及提高C1的比酶活,降低BG的最高酶活及比酶活和缩短C1和Cx的最高酶活形成时间;添加酵母膏能明显提高BG最高酶活但降低其酶活比;而C1和Cx的比酶活和最高酶活则随其浓度变化而增减不一.3种组分酶的分泌规律和酶系的均衡性极不相同,其中对BG的影响较为滞后.图3表3参12
【总页数】5页(146-150)
【关键词】生物化学;里氏木霉;纤维素酶系;产酶特性;均衡性
【作者】吴石金;罗锡平;夏一峰
【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032;浙江林学院工程学院,浙江,临安,311300;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032
实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取
收稿日期:2009204205 基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y 3080238);浙江省重大科技项目(2006C12032)作者简介:申屠旭萍(1974-),女,硕士,讲师,E 2mail :stxp @https://www.doczj.com/doc/4e16633517.html, ;3通讯作者,博导。 哈茨木霉发酵产木霉素的培养条件优化 申屠旭萍, 石一 ,俞晓平3 (中国计量学院生命科学学院,杭州310018) 摘要:采用快速有效的数学统计方法对一株枸骨内生真菌哈茨木霉生产木霉素的培养条件进行了优化。首先利用Plackett 2Burrman 设计在影响木霉素产量的6个因素中筛选出主效因素:葡萄糖浓度、发酵时间、接种量。在此基础上,再利用响应面分析法对以上三个显著因子的最佳水平范围进行研究,建立并分析了各因子与木霉素产量关系的回归模型。通过模型确定出最佳的试验条件:葡萄糖浓度4218g/L ,接种量1139ml 和发酵时间102188h ,该条件下木霉素的产量可达147144mg/L 。经五批培养验证,预测值与验证试验平均值接近。 关 键 词:木霉素;哈茨木霉;优化;Plackett 2Burman 设计;响应面分析法 中图分类号:S4821292;T Q92016文献标识码:A 文章编号:100529261(2009)0420348207 Optimization of Conditions for Production of T richodermin by Trichoderma harzianum SHE NT U Xu 2ping ,SHI Y i 2jun ,Y U X iao 2ping 3 (C ollege of Life Sciences ,China Jiliang University ,Hangzhou 310018,China ) Abstract :Factorial design and response surface techniques were used to design and optimize the process to increase the yield of trichodermin produced by the Trichoderma har zianum ,an endophytic fungus is o 2lated from Llex cornuta.Initially ,Plackett 2Burman design was undertaken to evaluate the effects of the six factors and three statistically significant parameters including glucose ,fermentation time and inoculum size were selected.In the second phase of the optimization process ,a response surface methodology was used to optimize the above critical factors ,and to find out the optimal concentration levels and the rela 2tionships between these factors.By s olving the m odel ,the optimal batch fermentation conditions were de 2termined.Under conditions of glucose ,4218g/L ;inoculum size ,1139ml ;fermentation time ,102188h ,the yield of trichodermin reached 147144mg in 1L fermentation liquor.A fter five batches cultivation ,the predicted values were verified by validation experiments. K ey w ords :trichodermin ;Trichoderma har zianum ;optimization ;Plackett 2Burman design ;response surface methodology 8 4325(4)348-354 中国生物防治 Chinese Journal of Biological C ontrol 2009年11月
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 作者：王春学号:11101680 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1 材料与方法 1.1 培养基 1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2 菌株的分离 1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3 菌种的鉴定 1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化 摘要:在筛选出纤维素酶高产菌株的基础上,对纤维素酶高产菌株ZJW-6采用单因素试验进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得其最优发酵条件?结果表明,菌株ZJW-6产纤维素酶的最优发酵条件是以蛋白胨+(NH4)2SO4为氮源培养基,在30 ℃?pH 6下振荡培养48 h? 关键词:纤维素分解菌;发酵条件;纤维素酶;酶活力 Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic Enzymes Strain ZJW-6 Abstract: The optimum fermentation conditions of high-yield cellulolytic enzymes strain ZJW-6 were studied in this paper. The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method. The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW-6 was as follows: peptone and (NH4)2SO4 as nitrogen source, shaking for 48h at 30℃ and pH 6. Key words: cellulose-decomposing microorganisms; fermentation conditions; cellulose; enzyme activity 纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维素二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称?随着人们对纤维素酶研究的深入,纤维素酶在食品?饲料?环境保护?能源和资源开发等各个领域中发挥着越来越大的作用,因而引起了全世界的关注,其研究也取得了很大进展?但是纤维素酶的生产仍然存在着酶活力低?生产周期长等问题,大大限制了其大规模工业化生产[1]?对高产纤维素酶菌株ZJW-6采用单因素试验法进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得最优发酵条件,旨在为其工业化发酵生产打下基础? 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种菌种为邢台学院生物化学系微生物实验室筛选并保存的产纤维素酶菌株? 1.1.2 培养基液体培养基:羧甲基纤维素钠10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,硫酸铵0.2 g/L,氯化钠10.0 g/L,去离子水1 000 mL,pH 7.0[2]?
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作
综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2011年第5期 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展 覃玲灵 何钢 陈介南 (中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙410004) 摘 要: 随着纤维素在能源、材料及化工等领域的广泛开发和应用,里氏木霉作为一种重要的产纤维素酶工业用菌种,越来越受到人们的广泛关注。为了提高其酶活,人们做了大量的工作,获得了一些相当好的突变株。对里氏木霉及其突变株的基因组进行研究,有助于人们理解其高效产酶的机制,同时也有利于构建其基因工程菌。介绍里氏木霉T r ichoderma reesei 的背景及其部分高产纤维素酶突变株,并阐述近些年来对其突变株的基因组的研究进展。 关键词: 里氏木霉 纤维素酶 突变株 基因组 SNV Research Develop m ent of Trichoder ma reesei and Its Cell ulase Hyperproduction Strai ns Q in L i ng ling H e G ang Chen Jienan (Instit ute of B i o l og ic al an d Environ ment al Science&T echnology,Ce ntral South University of Forest ry and Tec hnology,Changsha 410004) Abstrac:t A s w i de l y deve lop m ent and utilization of ce llulose i n the fi e l d of energy ,m ate rials and chem istry i ndustry,T r ichoderma reesei has been caught m ore and m ore attenti on for its be i ng a k i nd of i m portant ce ll u l ase stra i n for i ndustry .Fo r enhanc i ng i ts cell u l ase product ,peop l e hav e done a lot of work on it ,and ob tained seve ra l cons i derably good mutant strai ns .T o learn the genom e o f T r ichoderma reesei and its mu tant strains is he l p f u l to us understand its syste m o f ce llulase hype rproduction ,also he l p f u l to people construct its g enet ic eng i neering stra i n i n the f uture .T h i s article i ntroduced t he background o f T richoderma reesei and part of its hyperce llulase product stra i ns ,a l so elabo rated the research deve l op m ent of its m utan t strains geno m e i n t he recent yea rs . K ey words : T richoderma reesei Cell u l ase M u tant stra i n G enom e SNV 收稿日期:2010 11 24 基金项目:国家林业局 948 项目(2006 4 123) 作者简介:覃玲灵,女,硕士研究生,研究方向:生物质能源;E m ai:l canaceili ng @163.co m 通讯作者:何钢,男,教授,从事生物技术教学和科研;E m a i :l hegong262@yahoo .co https://www.doczj.com/doc/4e16633517.html, 1 背景 随着人口不断增长,以及现有的煤、天然气和石 油存储量的减少,发展新能源成为实现经济社会可持续发展的必经之路。以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质收集并且存储了大量太阳能,是一种重要的能源和物质资源[1] 。地球上最主要的生物质来自绿色植物,每年光合作用的生物质净产量约为1800亿t [2] 。生物质中含量最多的是纤维素,其由成百上千个葡萄糖分子聚合而成,是地球上存在最丰富的有机大分子,储量约为850亿t [3] ;其次是半纤维素,储量约为500亿;t 第三类是木质素,由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成,约 占20%,即350亿t [4] 。这些生物质大多以农业和林业废弃物的形式存在,并且每年都在大量积累,这不仅会导致环境的恶化,而且会导致这种可利用资源的流失[1] 。因此如何充分利用这些资源成为迫 在眉睫的问题,在对生物质的开发利用中,一个重要瓶颈就是如何高效利用微生物进行酶催化水解将生物质降解为单糖[5] 。 自然界中能降解和利用纤维素的微生物种类很多,许多细菌可分解纤维素,而且产生的纤维素酶具有高度专一性,但是它们生长速度慢,需要厌氧的生长条件[6],这些都限制了其应用。真菌所产生的纤维素酶多是胞外酶,便于分离和提取,且
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1材料与方法 1.1培养基 1.1.1平板培养基(1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2摇瓶培养基(1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2菌株的分离 1.2.1菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3菌种的鉴定 1.3.1细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.216SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3聚合酶链反应(PCR)检测PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级： 姓名：学号： 课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种 课程名称：工业微生物育种学 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
纤维素酶高产菌株的诱变育种 ( ) 【摘要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行了归纳和总结. 【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种 Mutation Breeding of Cellulase High-yield Strain TAO Mi-lin (College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Hunan 410128) 【Abstract】Cellulase is a kind of complex enzyme. Due to the ability of hydrolyzing cellulose or the similarity of cellulose into glucose. A great effort has been made until now on the research such as identification, mutation breeding and filter of cellulose-producing strain. This paper focused a brief induction and summary on advancing about these aspects. 【Key words】cellulose-producing strain ; cellulase ; filter ; mutation breeding 随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。 1、纤维素酶 纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。 1.1 纤维素酶的结构 不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanases，EC3.2.1.4，简称EG)、葡聚糖外切酶
毕业论文开题报告 食品科学与工程 产蛋白酶乳酸菌的筛选 一、选题的背景与意义 乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB)指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。相当多的乳酸菌是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前，随着人们生活水平的不断提高，乳酸菌在农业、医学、兽医以及食品工业等方面发挥越来越重要的作用。 乳酸菌蛋白酶的主要作用：第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳生成的乳酸增加胃内酸度提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标。但目前关于乳酸菌代谢产物的研究报道却很少，尤其是关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道只有寥寥几篇。产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及到所有乳酸菌，还具有很大的发展空间。通过对乳酸菌产蛋白酶能力进行筛选可以为乳酸菌开发利用过程中筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种提供依据；可以为蛋白酶的生产提供依据；可以为鲳鱼饲料的生产提供依据……总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 1、研究基本内容 ①从泡菜、酸奶、豆腐乳等实验材料中分离纯化乳酸菌； ②将分离出的乳酸菌进行增值培养； ③对增值培养的乳酸菌进行产蛋白能力测定，筛选出产蛋白能力最强的乳 酸菌菌种； ④菌种鉴定。 2、拟解决的主要问题 ①乳酸菌菌种的来源； ②菌种鉴定方法。 三、研究的方法与技术路线：
草地畜牧业 绿色木霉固态发酵产纤维素酶 活力的研究 王仪明1,张宗舟1,2,蔺海明1,孙小弟3,雷艳芳1,王东明4 (1.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;2.天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001; 3.天水师范学院工学院,甘肃天水741000; 4.甘肃省科学院自动化研究所,甘肃兰州730000) 摘要:以麦秆和麸皮为主要原料,通过正交试验和单因素试验优化绿色木霉T richderma v iride固态发酵产纤维素酶的最佳工艺条件,并研究绿色木霉对小麦秸秆纤维素降解的影响,为绿色木霉降解小麦秸秆纤维素提供最佳条件,进而提高小麦秸秆的利用率。结果表明,不同条件下绿色木霉产纤维素酶活力存在显著差异(P<0.05),最佳培养基为:氮源为(N H4)2SO4,pH值5.5,含水量为200%,麦秆∶麸皮质量比为4∶1;最佳发酵条件为:培养时间为96h、温度35℃、初始pH值6.0、含氮量0.4%、接种量15%,培养方式为半密闭;发酵后小麦秸秆中中性洗涤纤维(N DF)、酸性洗涤纤维(AD F)、纤维素含量和半纤维素含量比发酵前分别下降5.22%、6.88%、4.73%和4.16%,木质素含量无明显变化。 关键词:绿色木霉;发酶条件;纤维素酶活;小麦秸秆;纤维素 中图分类号:T Q925.9 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2009)05-0123-05 纤维素类物质是世界上最丰富的可再生资源[1]。纤维素材料可转化为具有商业价值的乙醇、乙酸、单细胞蛋白等纤维素的产品[2-3]。纤维素的生物转化近些年受到了极大的重视,大规模纤维素生物转化工艺的发展,将有效解决食品和动物饲料不足的问题[4-6]。利用微生物所产生的纤维素酶将秸秆转化为营养价值较高的单细胞蛋白饲料倍受人们的青睐[7]。纤维素酶作为一种高活性生物催化剂使其成为研究新型蛋白饲料开发与利用的重要内容[7-8]。纤维素酶不是一个单种酶,而是参与纤维素降解的多组分酶的总称,一个完整的纤维素酶系,通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素的3类酶组成:内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶(EX)和β-葡萄糖苷酶(BG),在分解纤维素时,任何一种酶都不能单独裂解纤维素,只有3种酶共同存在并协同作用才能完成水解过程[9]。 目前,用于研究生产纤维素酶的真菌大多数属于曲霉属Aspergillus、木霉属Trichderma、青霉属Penicillum、根霉属Rhizopus等。曲霉和根霉产β-葡萄糖苷酶活性较高,而在天然纤维素降解中起重要作用的β-葡聚糖纤维二糖水解酶活力较低[10]。木霉菌株是公认产纤维素酶最高的菌种之一[11]。因此,研究绿色木霉T.v iride 的培养条件及其对纤维素酶活的影响为纤维素酶的工业化生产奠定一些试验基础,为更好地利用秸秆开辟新的途径。 研究以麦秆和麸皮为主要原料,通过正交试验和单因素试验对绿色木霉固态发酵产纤维素酶的最佳培养基组分、时间、最适温度、pH值、接种量和含氮量等工艺条件进行优化,并比较发酵前后小麦秸秆的化学成分,研究绿色木霉对小麦秸秆纤维素降解的影响,为绿色木霉降解秸秆生产蛋白饲料提供最佳条件。这对提高秸秆的利用率和缓解我国高蛋白饲料严重紧缺的局面起到重要的促进作用。 1 材料与方法 1.1试验材料 小麦秸秆粉(当地农户提供,粉碎过40目筛),麸皮(市售)。 26卷5期 V ol.26.No.5 草 业 科 学 P RA T ACU L T U RA L SCI ENCE 123-127 5/2009 ＊收稿日期:2008-09-01 基金项目:国家科技支撑计划“西北内陆灌区农田循环生产 技术集成研究与示范”(2007BAD89B17) 作者简介:王仪明(1981-),男,甘肃天水人,硕士,研究方向 为纤维素降解及蛋白饲料生产。 通信作者:张宗舟
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
1.1木霉菌株的来源经对峙培养及活体试验后有效的B TC21（Tri cho der ma.har zia num）菌株。 1.2不同碳源对B TC21菌丝生长及产孢的影响基础培养基为:蔗糖20g，硝酸铵5g，磷酸钠2g，硫酸镁1g，蒸馏水1000ml。分别有葡萄糖、果糖等。15碳源与其中的蔗糖置换，以无碳源的做对照，配制成不同碳源的培养液，每瓶50ml，接种培养3天的d=6m m的BT C21菌片3片，在25℃下振荡培养（120rpm）。第8天测菌丝干重并观察孢子产生情况，每处理重复3次。 1.3不同氮源对B TCZ I菌丝生长及产孢的影响在基础培养基中分别用等量的蛋白胨、氯化铵等八种氮源与其中的硝酸铵置换，配制成不同氮源的培养液，培养方法及测量方法同上。 1.4钠、镁盐对BTC21菌丝生长及产孢的影响从15种碳源中选择较好的碳源红糖与蔗糖;从9种氮源中选择理想的氮源酵母浸出汁与牛肉浸膏，比较两种碳源与两种氮源在不同组合下钠、镁盐对BT C21菌丝干重及分生孢子产生情况的影响，培养及测量方法同上。 1.5不同碳氮比对BT C21菌丝生长及产孢的影响分别按红糖:酵母为4:1、4:2、4:4、4:8、4:12的比例配制培养基，钠镁盐含量不变，培养方法及测量方法同上。 1.6液体发酵B TC21最适pH的选择综合以上结果在最佳培养基的最佳碳、氮比下用HCL与NaOH调节发酵液的初始pH，设有pH 2.0～12.0共14梯度，培养条件及测量方法同上。 1.7不同培养时间对B TC21菌丝生长及产孢的影响从培养第24h起每天定时测量孢子量的变化，测至第8天;从第72h起每天记录菌丝干重的变化，测至第16天，培养条件及测量方法同上。 1.8液体发酵BTC21最适温度的选择将B TC21接种在按比例配制好的培养基中，分别在15℃、20℃、2 2.5℃、25℃、27.5℃、30℃、35℃等温度下进行振荡培养，测量5d后的菌丝干重及分生孢子量。 2 结果与讨论 不同培养条件对木霉菌菌丝生长及产孢影响 2.1 不同碳源培养B TC21后的性状及对菌丝生长与产孢的影响液体培养基中以红糖、肝糖为碳源，培养BTC21所获得的菌丝干重最大，可能与红糖中含有其它生长所需成分有关;其次为淀粉、蔗糖、L-（+）树胶醛糖、麦芽糖、半乳糖;以山梨糖、木糖、密二糖、葡萄糖、甘露醇、果糖为碳源获得的BT C21菌丝干重较轻;以菊糖、棉子糖为碳源菌丝干重最轻。 不同碳源培养后性状差异很大，缺碳对照、菊糖、棉子糖培养后产生纸屑或粉末状菌丝，不形成菌球且量极少，麦芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、红糖、半乳糖、密二糖、L-（+）树胶醛糖、肝糖及蔗糖为碳源，液体培养过程中易产生小菌球（d≤0.3mm）;木糖、淀粉、乳糖为碳源时可产生不同大小的菌球。并且大数碳源不利于孢子的产生，其中以果糖、密二糖为碳源的培养滤液中观察到了大量的木霉菌分生孢子;其次为蔗糖、半乳糖、菊糖、葡萄糖、L-（+）树胶醛糖与淀粉。其余8种碳源的B TC21培养滤液中几乎未见到分生孢子。综合以上结果，液体发酵B TC21最利于菌丝生长的碳源为红糖，而最利于产生孢子的碳源是果糖与密二糖。 2.2不同氮源培养BT C21后的性状及对菌丝生长及产孢的影响液体培养中以酵母浸出汁、牛肉浸膏为氮源的BT C21菌丝生长最好，菌丝干重最大，产生d=2mm左右的小菌球;其次为蛋白胨，菌球直径达到2.5m m;菌球直径<1.5m m的谷氨酸、天门冬氨酸、硫酸氨、硝酸铵，氯化铵为氮源的菌丝干重较轻;以脲素、硝酸钾为氮源的菌丝干重最轻，且菌丝未能形成菌球。 最适合BTC21产生分生孢子的氮源是酵母浸出汁、蛋白胨与硫酸铵;其次为氯化铵与天门冬氨酸;牛肉浸膏、硝酸铵、谷氨酸、硝酸钾、尿素则不利于产孢。 综合以上试验结果，液体发酵B TC21最有利于菌丝生长，同时又可促进产孢的氮源为酵母浸出汁。 2.3钠镁盐对BTC21菌丝生长及产孢的影响蔗糖、红糖、牛肉浸膏与酵母浸出汁两种碳源与两种氮源的不同组合中，在加有N a 3 PO 4 与M gSO 4 时，培B TC21所获得的菌丝干重较没有钠镁盐时大。以红糖为碳源、酵母浸出汁为氮源，在有Na 3 P O 4与MgS O 4存在时BT C21菌丝干重最大。观察培养后可以发现，对同碳氮组合，有无钠镁盐对菌球的形态有很大的影响，在以蔗糖为碳源、酵母浸出汁与牛肉浸膏为氮源时，加入钠镁盐情况下菌球直径变小，在2mm左右，而菌球数量明显增多，在红糖为碳源、酵母浸出汁与牛肉浸膏分别为氮源时则与上述情况不同。 2.4不同碳氮比对BT C21生长及产孢的影响在液体培养中碳氮比为4/6时可以获得最大的菌丝干重，4/8、
产纤维素酶细菌的筛选及培养 一、筛选步骤 1、菌种的采集 采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。 2、菌种初筛 （1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。 （2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。 （3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）加入1号试管，加无菌水。混匀后吸取加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。 （4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液于CMC 培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。 （5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。 （6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。 （7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。 （8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。 3、菌种复筛 （1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min 下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。 二、培养方法 1清洗实验器具 2灭菌 3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基） 4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床） 5稀释菌样 6涂布平板或平板划线 7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了 8观察记录（数量、分布等） 三、培养基种类及其组成 1、初筛 CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。 刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。 无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。 2、复筛 基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min