四川大学学报(医学版)
J Sichuan Univ(Med Sci Edi)
2010;41(3):377381
#论著# DNA聚合酶B对细胞生物学特性及DNA损伤的影响*
罗擎英,吴媚,刘蜀坤,张遵真v
四川大学华西公共卫生学院环境卫生学教研室(成都610041)
=摘要>目的探讨DNA聚合酶B(pol B)的表达水平对细胞的生物学特性及重铬酸钾诱导的DNA损伤效应的影响。方法以p ol B野生型(p ol B+/+)、p ol B缺陷型(p ol B-/-)及p ol B高表达型(p ol B oe)小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象,采用四氮唑盐比色法绘制3种细胞的生长曲线;群体倍增实验观察3种细胞的倍增时间;H GPRT基因突变实验检测细胞的自发突变频率;同时用单细胞凝胶电泳实验分析3种细胞的自发DNA损伤和重铬酸钾诱导的DNA损伤效应的差异。结果3种细胞生长曲线和群体倍增时间基本一致,细胞自发突变频率和自发DNA损伤差异也无统计学意义(P>0.05);随着重铬酸钾浓度的增加,3种细胞的拖尾率和尾长均增加,在相同重铬酸钾染毒浓度下p ol B缺陷型细胞的DNA损伤明显大于p ol B野生型和高表达型细胞,且以p ol B高表达型细胞的DN A损伤效应最弱。结论p ol B表达水平对细胞的生长特征无明显影响,也不会造成细胞自发突变的增加;p ol B基因缺陷使细胞对重铬酸钾诱导的DNA损伤更敏感,而高表达则对DN A损伤具有一定保护作用。
=关键词>DN A聚合酶B碱基切除修复自发突变DN A损伤与修复
=中图分类号>R994
Effects of pol B on Biological C haracteristics and DNA Damage in Mouse Embryonic Fibroblast L UO Qing-y ing,W U M ei,L I U S hu-kun,ZH A N G Zun-z hen v.Dep ar tment of E nv ir onmental H ealth,W es t China S chool of Public
H ealth,Sichuan Univ er sity,Chengdu610041,China
v Cor respo nding autho r,E-mail:zhangzunzhen@https://www.doczj.com/doc/4a14972239.html,
=Abstract>Objective T o ex plo re the effect o f DN A polymerase beta(pol B)ex pr essio n lev el o n biolog ical characterist ics of mo use embry onic fibr oblast(M EF)and the cellular response to DN A damag e induced by potassium dichr omate.Methods p o l B w ild-t ype cells(p ol B+/+),p o l B null cells(p o l B-/-)and p ol B ov erex pr essed cells(p ol B o e)w ere applied as a mo del sy stem.T he gr ow th curv e o f cells w as plotted by M T T assay;t he doubling time of cells was detected by double time ex per iment;the spo nt aneous mutatio n f requency was det ermined by HG PRT gene mutatio n method and single cell g el electr opho resis assay(SCG E)w as employed to observ e t he DN A damage either happened spontaneo usly or induced by potassium dichr omate.Results G ro wth characterist ic and do ubling time of the t hr ee kinds of cells w ere similar and no obvio us differences wer e fo und o n spo nt aneous DN A damag e and mutations fr equency amo ng them(P>0.05).Pot assium dichr omate increased comet r ate and tail lengt h in the thr ee kinds of cells in a concentr atio n dependent w ay.D NA damag e o f p ol B-/-cells at the same dosag e wer e more ser ious than the other cells bo th in comet rat e and tail leng th(P<0.05).p ol B oe cells demo nstr ated mo re r esistant to DN A damage o bv iously than the ot her s.C onclusion T he ex pression level of p ol B has no sig nificant effect o n the biolog ical cha racteristic and spo ntaneous mutatio n frequency of M EF.p ol B knock out cells is more sensitiv e t o DN A damage induced by po tassium dichr omate,wher eas,p o l B o ver expression can help cells respo nse to DN A damage and pr otect cells fr om death in a cer tain deg ree.
=Key words>DN A polymerase beta Base ex cision repair Spo nt aneous mutation DN A damage and r epair
碱基切除修复(base ex cision repair,BER)是真核细胞修复自发碱基损伤和外源性化学物诱导的DNA氧化损伤的主要修复系统。DNA聚合酶B (DNA poly merase beta,pol B)是BER系统的核心
*国家自然科学基金(批准号30872079)资助
v通讯作者,E-mail:z han gzunzh en@https://www.doczj.com/doc/4a14972239.html, 成分,兼具DNA聚合酶和5c末端脱氧核糖磷酸残基(5c dRP)裂解酶的功能,可填补碱基切除后产生的核苷酸缺口,并在细胞受到严重损伤时参与DNA 复制和重组,对于维持基因组的稳定和完整性具有十分重要的作用[1]。然而,pol B由于缺乏3c-5c的校读功能,在DNA合成中复制保真度较低,因此,其表达水平与细胞遗传不稳定性的关系日渐成为肿瘤
四川大学学报(医学版)2010年第41卷第3期
学和毒理学关注的焦点[2]。本研究首次以3种具有相同遗传背景但pol B表达水平截然不同的小鼠胚胎成纤维细胞(m ouse embryo fibroblast,MEF)为研究对象,通过比较3种细胞的生长速度、增殖能力、自发突变频率以及外源性化学物诱导的细胞DNA损伤程度的差异,以探讨pol B表达水平对细胞生物学特性的影响及其在DNA损伤修复过程中的作用,并为po l B高表达是否增加遗传不稳定性提供实验依据。
1材料与方法
1.1主要试剂和仪器
重铬酸钾(K2Cr2O7):上海试剂总厂生产,纯度>99%;溴化乙啶(EB):Am resco;遗传霉素(G418):Invitrog en;潮霉素B(hygr omy cin B): Solarbio;四氮唑盐(M TT):Fluka;6-硫代鸟嘌呤(6-T hio guanine,6-T G):Sig ma;DM EM培养基和胎牛血清:Gibco;倒置荧光显微镜:Leica;显微数码摄像图像采集系统:Pixera;DYY-6C型电泳仪和DYCP-34A型电泳槽:北京六一仪器厂;酶标仪(Microplate Reader):Bio-Rad;CO2培养箱: T herm o。
1.2细胞培养
野生型p ol B的小鼠胚胎成纤维细胞(p ol B+/ +)、缺陷型p ol B的小鼠胚胎成纤维细胞(p ol B-/ -)、高表达p ol B的小鼠胚胎成纤维细胞(p ol B oe)由美国国立环境卫生研究所Samuel H Wilso n实验室构建并惠赠[3]。3种细胞均接种于含10%胎牛血清及80L g/mL潮霉素B的DM EM培养液中,37 e,5%CO2培养箱中培养。为维持质粒的稳定表达,p ol B oe细胞中尚需加入终浓度为600L g/mL 的G418。
1.3细胞生长曲线测定
取对数生长期状态良好的p ol B+/+、p ol B-/ -及p ol B o e细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后,调整细胞浓度为1@104个/mL,接种于96孔培养板中,每孔200L L细胞悬液,每种细胞设8个平行孔。24h后每天于固定时间加入0.5mg/mL的M TT 100L L/孔,37e继续培养4h,弃去含M T T的培养液,D-H anks液洗涤细胞1次,每孔加入二甲亚枫(DM SO)150L L,振荡2min直到蓝色结晶完全溶解。在酶标仪上570nm处测每孔的吸光度(A)值,并求出平均值,连续测定8d,实验重复1次。以时间为横坐标,A570值为纵坐标,绘制生长曲线。1.4群体倍增时间测定
对数生长期状态良好的p ol B+/+、p ol B-/-及p ol B oe细胞用0.25%胰蛋白酶消化后调整细胞密度为4@104个/mL,分别接种于24孔培养板中,每孔0.5m L细胞悬液,每种细胞设置3个平行孔,待细胞贴壁后继续培养48h终止培养,0.25%胰蛋白酶消化后采用血球计数板于显微镜下进行计数。整个实验共进行2次,按照以下公式计算细胞群体倍增时间(T D)。
T D=t@
lg2
lgNt-lg N0
式中t代表培养时间;N0及Nt分别代表初种时的细胞数及培养t时间后的细胞数。
1.5HGPRT基因突变实验
对数生长期状态良好的p ol B+/+、p ol B-/-及p ol B oe细胞用0.25%胰蛋白酶消化后分为两组进行实验。第1组接种于6孔板中,200个/孔,用不含6-T G的培养液37e、5%CO2条件下培养10 d,3B1乙醇-冰醋酸固定,Giemsa染色,计数每孔集落数,按照以下公式计算相对集落形成率(clo ning Efficiency,CE),每种细胞设置3个平行对照。
CE=
细胞集落形成数
接种细胞数
第2组接种于100mL培养瓶中,每瓶4mL培养液中含1@106个细胞,用含2@10-10mol/L6-TG的培养液于37e、5%CO2条件下培养10d, 3B1乙醇-冰醋酸固定,Giemsa染色,按照以下公式计算自发突变频率(m utation fr equency,MF),每种细胞设置3个平行对照。
MF=
突变集落数
接种细胞数@CE
1.6单细胞凝胶电泳
用0.25%胰酶消化对数生长期的p ol B+/+、p ol B-/-及p ol B oe细胞并制成105/mL~106/ mL的细胞悬液,分别取1m L细胞悬液于1.5mL 离心管中,3000r/min离心5m in,弃上清;沉淀用1 mL PBS稀释的不同浓度的K2Cr2O7混悬, K2Cr2O7终浓度为0、0.05、0.10、0.50mm ol/L,37 e染毒2h。染毒结束后离心收获细胞并用PBS洗涤细胞3次,用37e熔化的0.65%低熔点琼脂糖900L L吹打成细胞悬液,按照改良方法[4]进行裂解、解旋、电泳、中和;然后用20L g/mL EB染色。染色后在荧光显微镜下观察结果,以拖尾率(com et rate,每张片子随机数200个细胞,计数其中彗星细胞的数目,算出拖尾细胞百分率)和尾长(tail
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length,目镜测微尺测量30个彗星细胞的尾部DNA 迁移长度,计算各剂量组尾长平均值和标准差)作为观测指标,上述实验独立重复3次。1.7 统计学方法
数据用 x ?s 表示,计量资料采用单因素方差分析,自发突变率采用Po ssion 分布的u 检验分析。A =0105。
2 结果
2.1 3种细胞生长曲线及群体倍增时间
在倒置光学显微镜下观察细胞的生长情况,发现3种细胞形态相似,呈扁平不规则的多角形或长梭形。由生长曲线可见3种细胞均呈指数生长,生长速度相似,生长曲线均呈/S 0形(附图)。各组细胞均于第
2~4d 进入对数生长期,三者之间没有明显差异。分别以初种的细胞数20000个为N0,以培养48h 后的细胞数为N t ,培养时间t 为48h,按照方法中描述的公式计算群体倍增时间T D ,并以2次实验的平均值作为各组细胞的群体倍增时间,结果如表1所示,经统计学检验3种细胞的群体倍增时间差异无统计学意义(P >0.05)。
Fig Grow th curves of the thr ee kinds of cells 2.2 3种细胞的基因自发突变
实验结果显示,p ol B -/-、p ol B +/+及p ol B oe 细胞H GP RT 基因的自发突变频率在8.63@10-6~9.09@10-6之间,经检验差异无统计学意义
(P >0.05,表2),提示在没有外源性化学物作用的情况下,pol B 的表达水平对细胞的自发突变频率没有明显影响,即缺乏pol B 的p ol B -/-细胞突变频
率没有增加,而pol B 高表达的p ol B o e 细胞突变频率亦无显著下降。
2.3 重铬酸钾诱导的3种细胞DNA 损伤
单细胞凝胶电泳实验结果见表3。在0剂量(未加任何受试物)组,3种细胞的拖尾率和尾长差异没有统计学意义(P >0.05),再次表明在没有外源性化学物作用时,pol B 表达水平对细胞DNA 的自发损伤没有显著影响。所选用的具有明确DNA 损伤作用的K 2Cr 2O 7在实验中可诱导3种细胞的DNA 损伤,无论是拖尾细胞的数量还是尾长均随K 2Cr 2O 7浓度的增加而增加。在相同浓度下,K 2Cr 2O 7诱导的p ol B -/-细胞的拖尾率和尾长均高于p ol B +/+细胞及p ol B oe 细胞,p ol B +/+细胞和p ol B oe 细胞之间差异也有统计学意义(P <0.05)。在K 2Cr 2O 7浓度为0.10mm ol/L 时,p ol B -/-细胞的拖尾率已达100%,而p ol B oe 细胞的拖尾率不到50%;同样,在K 2Cr 2O 7浓度为0.10mmo l/L 时,p ol B -/-细胞的尾长超过了100L m,
表1 3种细胞群体倍增时间T able 1 T D of three kinds of cells
Grou p n Preliminary cell counts (@104)
Cell counts after 48h (@104)T D (h)p ol B -/-6 2.00 6.97?0.4826.79?1.61p ol B +/+6 2.007.37?0.6426.10?1.51p ol B oe
6
2.00
7.26?0.43
25.65?1.57
表2 3种细胞的HGPRT 基因自发突变实验结果
Table 2 Spontaneou s mutation detected by HGPRT gene mutation test
in three kinds of cells Grou p n No.of mutant colon y Cloning efficiency(%)M utation frequ ency (@10-6)p ol B -/-3726.17?1.438.92p ol B +/+3623.17?1.658.63p ol B oe
3
7
25.67?1.65
9.09
表3 K 2Cr 2O 7对3种细胞DNA 损伤的影响(n =3)
Table 3 Effect of K 2Cr 2O 7on DNA damage in three kinds of cells(n =3)
K 2C r 2O 7(m mol/L)p ol B +/+
Com et rate (%)T ail length (L m)p ol B -/-Comet rate (%)T ail length (L m)
pol B oe
Comet rate (%)T ail length (L m)09.64?2.529.37?3.7210.20?1.239.86?4.179.80?4.069.73?1.820.0533.53?7.50*
17.92?10.
33*
85.23?9.08*,#
33.58?26.
87*,#
27.30?1.
53*,v
9.83?6.17v 0.1066.03?6.03*
57.22?24.92*100*
,#
112.90?38.27*,#47.12?9.68*,v 30.19?21.55*,v 0.50
100*
104.59?19.27*
100*
154.80?46.76*
,v
88.77?3.06*
,v
84.57?23.20*
,v
*P <0.05,compared w ith th e control(0mm ol/L K 2Cr 2O 7);#P <0.05,com pared w ith the sam e concentration of p ol B +/+an d p ol B oe;v P <0105,compared w ith th e sam e concentration of p ol B +/+
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远远高于其他两种细胞,此时,p ol B+/+细胞的尾长接近60L m,几乎是p ol B oe细胞的2倍(P< 0105)。以上结果提示:pol B表达水平对细胞DNA 的自发损伤没有显著影响,而po l B高表达对K2Cr2O7诱导的DNA损伤具有保护作用,po l B缺陷则使细胞对K2Cr2O7诱导的DNA损伤效应更为敏感。
3讨论
BER作为DNA损伤修复的基本方式,在应对各种DNA损伤、维持细胞基因组稳定性方面起着重要的作用[5]。po l B是BER中的核心成分,其公认的生物学功能是催化填补DNA合成缺口以及从无嘌呤/嘧啶(AP)位点催化5c dRP释放,从而参与DNA损伤修复[6]。另有研究显示pol B可能还参与了DN A重组以及跨损伤DNA合成,并在胚胎发育过程中有着至关重要的作用[7]。然而po l B表达水平对细胞生物学特性、自发突变性的影响及其对环境污染物/致癌物诱导的遗传效应的差异尚无统一结论。本实验采用的p ol B缺陷型细胞(p ol B-/ -)是通过基因敲除技术构建;而p ol B高表达型细胞(p ol B oe)则在缺陷型细胞基础上通过稳定转染野生型p ol B基因真核表达质粒而建立,这两种细胞系与小鼠胚胎成纤维细胞p ol B野生型(p ol B+/ +)均是由SV-40病毒转染后获得永生化的细胞系,并可在体外长期稳定传代[3]。因此,这3种小鼠胚胎成纤维细胞具有相同的遗传背景而po l B表达水平截然不同,是研究不同po l B表达水平对细胞生物学和遗传学效应的理想模型。
关于基因表达水平的改变是否影响细胞的生长特性,既往的研究结果不尽相同,有学者认为通过基因转染建立的细胞株由于外源基因的负荷可使细胞的生长速度减慢[8],而本实验室前期通过转染核酶基因构建的H OGG1低表达细胞株与其母体细胞相比其生长速度和生长特性并没有明显变化[9];金戈等[10]运用脂质粒转染构建的po l B稳定高表达的NIH3T3细胞株与其母体细胞在生长曲线形态上基本一致,细胞周期亦无明显改变。事实上,p ol B基因属于看家基因,其表达不受细胞周期增殖调控,酶活性也不随细胞的生长情况变化;也有学者认为,在一般情形下po l B不参与DNA复制[11],因此在细胞周期及细胞增殖的调控中pol B并不起主要作用。本研究对3种po l B表达水平不同的细胞形态、生长特性、生长速度和群体倍增时间进行了比较,结果显示p ol B基因表达水平的改变对细胞的基本生物学特性没有明显的影响,提示p ol B作为一种DNA修复基因,在细胞的生长、增殖和细胞周期中并不起关键性的作用。
po l B表达水平对细胞遗传不稳定性的影响是目前肿瘤学与毒理学研究的热点,但研究结果尚无统一结论。理论上讲,p ol B作为一种重要的DNA 损伤修复基因,其表达缺失势必会降低细胞DNA 修复能力,从而增加遗传不稳定性;相反表达的增高可能在一定程度上对维护细胞基因组的稳定起到保护作用。但是由于pol B缺乏3c-5c核酸内切酶校读功能,DNA损伤修复保真度较低[6],有学者认为高表达的po l B可以通过参与DNA复制、使DN A能进行带错复制以及在静止细胞内导致突变等途径,成为基因组不稳定性的一个来源[2]。有研究显示高表达野生型po l B的细胞在没有任何外来物质作用下细胞的自发突变频率增加[12],然而耶鲁大学Sw easy实验室发现高表达野生型p ol B的小鼠C127细胞完全不具有恶性转化的特性,只有高表达突变型p ol B的C127细胞能够发生恶性转化[13]。为探讨po l B的表达水平是否会造成细胞的遗传不稳定性增加,本研究用H GPR T基因突变实验和单细胞凝胶电泳实验对3种细胞的自发突变频率和DNA损伤进行了检测。结果显示:在没有外源性化学物作用下,p ol B基因缺陷并没有增加细胞的自发DNA损伤和自发突变频率。对于该结果,我们认为可能与以下因素有关:BER是一个多蛋白参与的多步骤过程,po l B在相关酶的协同作用下完成DNA 损伤修复过程,因此,在没有外源性化学物作用下,即便是po l B缺乏,自发的少量DNA损伤完全可以由其伙伴基因代偿性修复[1416];而高表达的野生型po l B也不增加细胞的遗传不稳定性,与Sw easy实验室的研究结论一致[13],这可能是由于p ol B作为一种重要的DNA修复基因,在应对大量、急剧DNA损伤时(比如化学物作用时)可以迅速发挥其修复细胞遗传损伤的作用,但由于其保真度较低,导致掺入不正确的脱氧核糖核苷酸或突变的碱基类似物频率增高,从而在完成DNA损伤修复的过程中可能增加了细胞的遗传不稳定性;另一方面,在没有外源性化学损伤时,细胞自发的DNA损伤是少量的且发生缓慢,在这种情形下,即便是pol B高表达也不会导致细胞基因组不稳定性的增加。
大量研究显示,pol B缺失可增加细胞对烷化剂、电离辐射、氧化剂等DNA损伤因素的敏感性。
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Robert等[17]报道切除5c dRP的过程是pol B的核心功能,具有不可替代性,因此,在应对严重DNA 损伤时,po l B的缺失会使细胞BER关键步骤无法完成,从而造成DNA损伤修复能力大大降低。另一方面,杜柳涛等[18]发现高表达pol B的细胞在甲基磺酸甲酯(MM S)作用下出现G1期阻滞从而为细胞赢得额外的时间用于DNA损伤的修复,使细胞应对外源性损伤的能力大大提高。本研究采用单细胞凝胶电泳实验检测3种不同pol B表达水平的细胞对K2Cr2O7诱导的DNA损伤效应,结果显示p ol B+/+、p ol B-/-及p ol B oe细胞在不同浓度的K2Cr2O7作用后拖尾率和尾长都随染毒剂量增加而增加。在相同染毒浓度下,p ol B-/-细胞对K2Cr2O7诱导的DNA损伤最为敏感,p ol B+/+细胞次之,p ol B oe细胞敏感性最低。提示pol B在DNA的氧化损伤修复中起着重要的作用,而野生型p ol B高表达则增加了细胞应对DNA损伤的能力,在一定程度上对细胞具有保护作用。
综上所述,pol B表达水平对细胞的生长速度和增殖能力等特性无明显影响,p ol B的缺陷增加了细胞对DNA损伤的敏感性,而p ol B高表达并不引起细胞自发突变率增加,且对重铬酸钾诱导的DNA 损伤具有保护作用。
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编辑汤洁
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限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A 之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。 DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 DNA聚合酶：催化脱氧核苷酸之间的聚合反应。主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA 聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。 反转录酶：属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。
1. T4DNA连接酶: 本酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，（将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键），需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA 连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'-磷酸末端和3'-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA 或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。 粘末端的连接反应: 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段 DNA浓度及分子大小来计算。 平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的2～5倍左右。 与粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果。 (0.05-0.1 μg／ul以上)。 反应温度：该酶的最适温度为37℃，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1-2小时左右的话也可在室温下进行反应。 抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg 2+，因此螯合Mg 2+的EDTA 的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的 DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。 2. T4 DNA聚合酶： T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以依赖于DNA模板对5' 端突出末端进行补平；同时可对3' 端突出末端进行削平。也可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5'→3'方向催化DNA合成反应。 特点：T4DNAPolymerase由于同时具有5'→3' DNA聚合酶活性和
DNA聚合酶和DNA连接酶的比较 “红细胞”专题复习 山东省青岛市第九中学辛建福 红细胞不仅在动物体内起着非常重要的生理作用，还作为生物科学某些领域研究的好材料, 且课本涉及的地方有多处。因此，有关红细胞知识点常成为高考命题的切入点。现将有关的考点归纳总结如下：
考点1.组成细胞的分子 例1.“朴雪”乳酸亚铁口服液可以有效地治疗人类缺铁性贫血症，这是因为其中的Fe2+进入人体后能（） A.调节血液的酸碱平衡 B.调节血液的渗透压 C.构成中的血红蛋白 D.促使更多红细胞的产生 解析:此题考查红细胞内血红蛋白特有的无机盐组成和无机盐的生理作用。某些无机盐可以用来构造细胞内某些复杂化合物的重要组成部分，如Fe2+进入人体后构成血红蛋白的主要成分，Mg2+是叶绿素分子必需的成分。故答案选C。 答案: C 考点2.细胞的基本结构 例2.若从成熟的红细胞上获取细胞膜，可用来处理细胞的试剂是（） A.10%盐酸 B.蛋白酶 C.磷脂酶 D.清水 解析:此题考查成熟红细胞膜的化学物质组成和分离出纯细胞膜的方法。获取细胞膜就是让其破裂，让内部物质释放出。10%盐酸浓度高，使红细胞皱缩甚至杀死；脂类和蛋白质是细胞膜的主要组成物质，故蛋白酶、磷脂酶均使膜结构遭破坏；清水使细胞渗透吸水胀破，内部物质流出只剩细胞膜。故选D。
答案: D 例3.人的红细胞和精子的寿命都很短，这一事实体现了（） A.环境因素的影响 B.功能对寿命的决定 C.核质相互依存的关系 D.遗传因素的作用 解析:此题考查红细胞的寿命和细胞的完整性。细胞的各个部分不是彼此孤立的，而是互相紧密联系、协调一致的，实际上一个细胞就是一个有机的统一整体，细胞只有保持完整性，才能够正常地完成各项生命活动。例如人体成熟的红细胞、人工去核的细胞和丢弃大部分细胞质的精子细胞，一般不能存活多久，有力地说明细胞完整性的重要意义。故答案选C。 答案：C 考点3.细胞的生命历程 例4．青蛙红细胞的分裂方式是（） A.二分裂 B.无丝分裂 C.有丝分裂 D.减数分裂 解析:此题考查非哺乳类动物红细胞的结构和蛙的红细胞独特的分裂方式。无丝分裂的特点是在分裂开过程中核膜、核仁并不消失，也无染色体变化和纺锤体丝出现，它是真核细胞的一种分裂方式，如蛙的红细胞分裂方式就是这样。二分裂是指单细胞生物（如细菌）一种常见的繁殖方式，进行分裂生殖时，先是核逐渐延长，然后逐渐分成两个新个体。虽然两者都要“一分为二”，但分裂的机理和本质有所不同。人和哺乳动物
T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需A TP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA 或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。 用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和载体、linker或adaptor等的连接。也可以用于缺刻修复及Ligase 介导的RNA检测。 来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。 活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM(300 μg/ml)。200U等于1个Weiss unit，以Weiss unit计，本产品共1000单位。 纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规连接反应要求。 酶储存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50%(v/v)glycerol。 10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM A TP。 失活或抑制：65℃孵育10分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA Ligase。 包装清单： 产品编号产品名称包装 D7008-1 T4 DNA Ligase(1000U/μl) 200,000U D7008-2 10X Ligation Buffer 1.5ml －说明书1份 保存条件： -20℃保存。 注意事项： 对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。 需进行平端连接或快速连接时，推荐使用碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase 可以进行平端连接，但效率较低。 普通的连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65℃孵育10分钟使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(band shift)。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。