微生物实验教案
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
一、实验目的
以染色玻片为例,熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理
1 显微镜油镜使用的原理
(1）光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。它使检视物放大, 造成物象.（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端)两点之间距离的能力，可用公式表示为:
D=λ/2n·sin（α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离.
λ：可见光的波长（平均0。55μm）
n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜口角（即入射角）。3油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时,由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料
1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。
四、实验方法与步骤
(1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度.
(3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器,在标本中央滴一滴香柏油,使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
（6)绘出所观察到的细菌形态图像。
（7)、换片:另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
(8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒,先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原.
五、实验报告
油镜使用的原理绘制细菌形态
六、思考题
1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？
2使用油镜时,为什么必须用镜头油？
七、实验注意事项
1不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。
2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度.
3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜,最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
4观察时，两眼睁开,养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。
5拿显微镜时,一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿,更不可倾斜拿。
6显微镜应存放在阴凉干燥处,以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片.
八、教学反馈
实验二细菌的简单染色
一、实验目的
熟练掌握显微镜油镜的使用方法。学习染色的基本技术，
二、实验原理
简单染色的原理
大多数微生物细胞质是带负电荷,简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
三、实验材料
1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
2、培养12—18h的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。
3、简单染色液(美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）
四、实验方法与步骤
1、活菌制片观察
取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分,按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。
2、简单染色
(1）涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片)，调匀并涂成薄膜.注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
(2）干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。
(3）固定:于火焰上通过2—3次.
(4) 染色:在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红,染色１分钟。
（5）水洗:倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。
（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热.
（7）镜检:在油镜下观察细菌形态.
五、实验报告
油镜使用的原理绘制细菌形态
六、思考题
1镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？
2根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
七、教学反馈
实验三细菌的革兰氏染色
一、实验目的
1掌握革兰氏染色。
2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理
1 革兰氏染色的原理
革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成,在染色过程中，当用95%乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色,因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低,脂类物质含量高,当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫—碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
三、实验材料
1大肠杆菌24h的斜面培养物.
2葡萄球菌24h的斜面培养物。
4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石碳酸复红）
5载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等.
6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、实验方法和步骤
附表1细菌染色法分类
附表2 微生物染色常用染料
A酸性染料:如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等.
B碱性染料:一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
C中性(复合)染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。D单纯染色：这类染料物，不溶于水,但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类(Sudan b）的染料
2革兰氏染色
（1）涂片。
(2）初染:在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液,流水冲洗至无紫色。
（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
（4）脱色：除去残水后，滴加95％酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。
（5)复染:滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干.
(6）镜检：观察染色结果。
五、实验报告
1 革兰氏染色的基本原理和意义
2 革兰氏染色成败的关键
六、思考题
1根据实验体会，你认为制备染色标本时,应注意哪些事项？
2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么?
4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠?
七、教学反馈
实验四培养基的配制
一、实验目的
1学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤
2学会实验室灭菌锅的使用方法
二、实验材料
1牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。
2试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。
3 灭菌锅
三、实验方法
（一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，琼脂15—20g,水1000mL，pH7.4-7。6。
1称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量，随后放人热水中,牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或
溢出,最后补足所失的水分。
3调pH：检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节.pH 的调节通常放在加琼脂前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利结果的观察。
5分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。
分装量:固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。
6加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁,不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后,再于棉塞外包一层牛皮纸.然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放人冰箱内暂存.
9摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度,使斜度的长度不超过试管总长度的1/2。
10无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内,备用。
四、实验结果和报告
记录本实验配制培养第的名称、数量,并图解说明其配制过程，指明要点。
五、问题和思考
1配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题？为什么?
2培养基配制完成后,为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查，
3试设计实验对饮料进行无菌检查。
六、演示
1培养基的分装方法。
2试管斜面的搁置方法
七、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖.调PH时要小心操作，避免回调.不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
八、教学反馈
实验五土壤的稀释、分离、纯化及无菌操作技术
一、实验目的和内容
1学习从上壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术.
2用稀释法分离细菌、放线茵和霉菌.
3用平板划线法分离微生物。
4学习平板接种等无菌操作技术。
二、实验材料
1金黄色葡萄球菌和普通变形菌斜面菌种。
2已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶。
3无菌培养皿12套、无菌EP管10支、土壤样品、天平、称量纸、药匙、试管架、记号笔、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul枪头、200ul 枪头、20ul枪头。
4无菌水(49。5mL、带玻璃珠） 1瓶、80%乳酸、10％酚液、95％乙醇。
三、实验方法
（一）土壤稀释分离
1取土壤：取表层以下5-10ml处的土样．放入灭菌的袋中备用,或放在4℃冰箱中暂存。
2制备稀释液
(1)制备土壤悬液:称土样0.5g，迅速倒人带玻璃珠的无菌水瓶中，振荡5—10min,使土壤充分打散，即成为10—2的土壤悬液。
（2）梯度稀释:用移液器吸10—2的土壤悬液100ul，放入装有900ul无菌水的EP 管中，上下颠倒数次,即为10—3的稀释液，如此重复，可依次制成10—3—10—8的稀释液。
注意：每一个稀释度换用一支枪头。
（二)平板划线分离微生物
1倒平板：按无菌操作要求，在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固体培养基(约50℃),倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，平放桌上待其充分凝固,备用。2划线分离：使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落。
3培养:方法同“土壤稀释分离”
（三) 平板接种培养
1混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10—8、10—9号码，每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取10—9稀释液各1ml放入编号10—9的3个平板中,同法吸取10—8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10—7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基（图22—2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。
2涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0。1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22—3），每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数.
四、实验结果和报告
1记录土壤稀释分离结果，并计算出每克土壤中的细菌、放线曲和霉菌的数量。
计算方法：选择长出菌落数30—300之间的培养皿进行计数，技以下公式：总个数／g＝同一稀释度几次重复的菌落平均数x稀释倍数
2分别记录平板划线、平板接种的结果，并自我评价。
五、问题和思考
1在测定土壤微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法？
2试设计实验,从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。
3试设计实验,从水或者空气中分离微生物，并进行计数。六、注意事项1一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。
2在土壤稀释分离操作中,每稀释10倍，最好更换一次移液管，使计数准确。
3放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。
六、教学反馈
实验六水中细菌总数和大肠菌群的检测
一、实验目的
(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
（2）学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理
水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物.
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义,同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定,饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个,细菌总数每mL不超过100个。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落（colony—forming unit,cfu)数，故其单位应是cfu/g （mL）。它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称,主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源,由于大肠菌群在肠道内数量最多,所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标.目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样.
多管发酵法包括初(步）发酵实验、平板分离和复发酵实验三个部分。
1、初（步）发酵实验:
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管，乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气，为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂,细菌产酸后,培养基即由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢细菌生长的作用。
水样接种于发酵管内,37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在少量的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验,才能确定是否是大肠菌群.48小时后仍产气的阴性结果。
2、平板分离:
平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo’s medium）或尹红美蓝琼脂(eos in methylene blue agar,EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色,大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物,使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长,尹红美蓝琼脂平板含有与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色(龙胆紫的紫色）菌落.初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
3、复发酵实验：
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏染色阴性无芽孢杆菌者，通过此实验再进一步证实。原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果.
三、实验器材
1菌落总数的测定：
1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2）器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿,灭菌吸管，灭菌试管等。
2大肠菌群的测定；
（1）、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管)，三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），尹红美蓝琼脂平板；
2）、材料：无菌水、载玻片、灭菌带玻璃塞空瓶、无菌吸管、无菌试管等。
四、实验方法
（1）水样的采集：
1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析.
2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的,需放入冰箱中保存.
(2)细菌总数的测定：
1）水样稀释及培养:
①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：
⑦根据对水样污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度（饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1：10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1：100、1：1000三种稀释度;污染水—被选择1:100、1：1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
2)计算方法：
作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏.在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。
3）计数的报告：
①平板菌落数的选择：
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准.一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数.若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。
②稀释度的选择：
a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以该稀释倍数报告之(表1例1）.
b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间,则视二者之比如何来决定.若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2,则报告其中较小的数字(l例2、例3）。c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4）。
d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（1例5）.
e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(表1例6)。