mCherry标签抗体—可进行WB/IF应用的mCherry单抗
mCherry是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定位等。不同于其它从维多利亚水母中分离的GFP蛋白和其它绿色荧光蛋白变体，mCherry以及其它大多数红色荧光蛋白是从Discosoma菌种中分离出来的蛋白。mCherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为587nm和610nm。
如何选择合适的mCherry标签抗体？
我们在选择mCherry抗体时，主要根据自己的需要，特别是实验应用上的需要。其中需要考虑的因素包括了，mCherry抗体的应用检测类型、mCherry抗体的克隆性及制备来源等。比如该mCherry抗体是否能用于免疫荧光的检测？是否可以用于免疫沉淀IP实验？我是否需要特异性更好的单克隆GST标签抗体？我是否需要考虑下是选择小鼠来源的还是兔来源的？
另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl mCherry 抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:4000，最终使用液相当于400ml），要比效价低的1ml的mCherry抗体（假如WB检测的稀释比率是1:200，最终使用液相当于200ml）性价比更高。
我买了Abbkine的mCherry标签抗体做WB和IF实验的，都比较理想；后来试了一下IP实验，虽然说明书上没有写，但是效果也超出预期，很不错。——武汉同济医院一客户
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常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；
3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；
荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，
第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex
G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效
荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠发。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1、原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白结合物。 2、标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如体积大于5mL，则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体112.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M pH9.5碳酸盐缓冲液0.25mL，继续搅拌3~4小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。 （8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M、pH7.4的PB缓冲液透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000rpm/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3、结果判定 （1）定性及效价测定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散实验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA（或正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（见（三）工作浓度的选择）。 （2）本法标记步骤比较简单，重复性好，缺点是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶与蛋白质结合。 4、试剂和器材 （1）0.1M、pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49mL ，0.2M NaH2PO4 51mL, NaCl 1.8g，加蒸馏水至200mL。 （2）12.5mL/L戊二醛液：取250mL/L戊二醛50mL与pH6.8的PBS确？mL混合。 （3）1M、pH9.5碳酸盐缓冲液（PBS）：取1M Na2CO3 3mL 与1M NaHCO3 7mL混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸盐缓冲液1mL中。 （5）0.15M、pH7.4的PBS及生理盐水。 （6）pH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG、MW2000）。 （8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 （9）HRP（RZ>3.0）。 （10）SephadexG-25层析柱（2cmX50cm）。 （11）搅拌器、分光光度计、离心机。 （12）透析袋、大小烧杯，试管，吸管等。
免疫组化常用抗体标记物 （一）上皮源性标记物 1、一般性标记物（1） CK（角蛋白）CK亚型：CK5/6、CK7、CK8、CK10/13、CK18、CK19、CK20 （2） EMA（上皮膜抗原） 2、特异性和（或）相对特异性上皮标记物 （1）CEA（癌胚抗原，标记胃肠道癌、肺腺癌等）（2）CA242（肿瘤相关粘液抗原、标记胰腺癌、结、直肠癌等）（3）TG（甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌）（4）PSA（前列腺特异性抗原，主要用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断）（5）PSAP（前列腺特异性酸性磷酸酶，主要用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断）（6）34βE12（高分子量细胞角蛋白，标记前列腺基底细胞）（7）AFP（甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌等）（8）Hepatocyte （标记肝细胞癌）（9）β-HCG（β绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养叶细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤）（10）CA125（卵巢癌抗原） （二）间叶源性标记物肌源性标记物 1、 Desmin（Des，结蛋白） 2、 Actin（肌动蛋白） 3、 SMA（平滑肌肌动蛋白） 4、 MSA （肌特异性肌动蛋白） 5、 Myosin（肌球蛋白） 6、 Myoglobin（MG，肌红蛋白） 7、 Myogen （肌浆蛋白） 8、 MyoD1（肌调节蛋白） （三）血管源性标记物 1、 FVⅧRAg（第8因子相关抗原） 2、 CD31 3、 CD34 4、 UEA-1 5、 BNH9 （四）组织细胞源性标记物 1、 CD68/KP-1 2、 Lysozyme（溶菌酶） 3、α-AT（α1-抗胰蛋白酶） 4、α1-ACT（α1-抗胰糜蛋白酶） 5、 Mac387 （五）淋巴造血组织源性标记物 1、全淋巴细胞（1）CD45/LCA（白细胞共同抗原）（2）TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）（3）CD30/ki-1 2、全B细胞（1） Igκ（2） Igλ（3） CD20/L26 （4） CD79α（5） BLA36（B淋巴细胞抗原）（6） Pax-5（B细胞系特异性激活蛋白） 3、 B细胞亚型（1） CD10 （2） CD21（标记滤泡性树突状细胞）（3） CD23 （4） CD35（标记滤泡性树突状细胞）（5） CD38 4、全T细胞（1） CD3 （2） CD5 （3） CD43 （4） CD45RO/UCHL-1 5、 T细胞亚型（1） CD1α（2） CD4 （3） CD8 6、 NK细胞（1） CD56 （2）CD57/Leu-7 （3） CD16/Leu-11 7、粒细胞和单核细胞（1） CD11c/LeuM5 （2） CD15/LeuM5 （3） Lysozyme（溶菌酶）（4）α-AT（α1-抗胰蛋白酶）（5）α1-ACT（α1-抗胰糜蛋白酶）（6） CD68 （7） S-100蛋白（8） Mac387 8、其他（1） EMA（上皮细胞膜抗原）（2） CD99（尤因肉瘤标记物）（3） ALK-1（间变性淋巴瘤激酶）（4） HLA-DR （5） Bcl-2 （6） Bcl-6 （7） Bcl-10 （8） Ki-67 （9） CyclinD1（周期素D1）（10） CD25 （11） CD34. 六）神经源性标记物
HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法) 一、戊二醛二步法戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成 酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 二、简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的 HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失， 是目前最常用的方法。 1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定 （1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节(三)工作浓度的选择)。（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 （3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材 （1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO449ml, 0.2M NaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 （2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。 （3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 （5）0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 （6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
一、单体 Porter等对血清IgG抗体的研究证明：Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成。 轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。 二、轻链和重链 1、轻链（light chain，L链） 由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量为24kD，有两个由链内二硫键组成的环肽，L链可分为：Kappa（κ）与lambda（λ）2个亚型。 2、重链（heavy chain，H链）
由450-550个氨基酸残基组成，分子量55-75kD，含糖数量不同，4-5个链内二硫键，可分为5类，μ、γ、α、δ、ε链，不同的H链与L链（κ或λ）组成完整的Ig分 子。分别称为：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。
三、可变区和恒定区 通过对H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现： 其N-末端序列变化很大，称此区为可变区（V区）； C-末端氨基酸则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区（C区）。 1、可变区（Variable region，V区） L链N端1/2处（VL）108-111个氨基酸残基，H链N端1/5-1/4处（VH）118个氨基酸残基，V区有一个肽环65-75个氨基酸残基。
可变区可分为高变区（hypervariable region ，HVR ）和骨架区（framework region ，FR ），VL 的HVR 在24-34，50-56，89-97氨基酸位置。VH 的HVR 在31-35， 50-56，95-102氨基酸位置。分别称为VL 和VH 的HVR1，HVR2，HVR3。
抗体标记标准化步骤 以h-FABP抗体（NP24）标记AE、BIO为例 标记步骤： ①300ul的反应体系 1、抗体解冻后，混匀离心10s，取50ul于离心管，然后取1ul AE（原倍AE不需要吹打）于离心管壁，最后用99ul标记液CB将AE向下冲散混合(如果AE 已预先和抗体混合，弃用)； 2、37℃水浴标记1小时后取出，在此之前将透析袋提前浸泡，然后将离心管内液体吸出，加入至透析袋，再加150ul 20mM PBS，混匀后，扎好透析袋进行透析（透析液为PH 7.4 20mM PBS，体积为2L）； 3、4-8小时更换透析液一次，在每次换透析液前要先测量上一次透析液中残留AE发光值，当测量发光值在3000左右即可停止透析； 4、收集：将透析袋里的抗体取出至EP管中，用20mM PBS补充至一个定值，按标记抗体：抗体储存液=4:1的体积比例加入抗体储存液，再按加完储存液后的体积1：1加入甘油，然后贴好标签，并加上透明胶带，最后放置-20℃冰箱保存； 5、以标记好的抗体NP24-AE和NP24-BIO进行样品测试，验证标记抗体是否可用，并考察信噪比。 ② 150ul的反应体系 1、抗体解冻后，混匀离心10s，取50ul于离心管，然后取1ul AE（原倍AE不需要吹打）于离心管壁，最后用49ul标记液CB将AE向下冲散混合(如果AE 已预先和抗体混合，弃用)； 2、37℃水浴标记1小时后取出，在此之前将透析袋提前浸泡，然后将离心管内液体吸出，加入至透析袋，再加50ul 20mM PBS，混匀后，扎好透析袋进行透析（透析液为PH 7.4 20mM PBS，体积为2L）； 3、4-8小时更换透析液一次，在每次换透析液前要先测量上一次透析液中残留AE发光值，当测量发光值在3000左右即可停止透析； 4、收集：将透析袋里的抗体取出至EP管中，用20mMPBS补充至一个定值，按标记抗体：抗体储存液=4:1的体积比例加入抗体储存液，再按加完储存液后的体积1：1加入甘油，然后贴好标签，并加上透明胶带，最后放置-20℃冰箱保存； 5、以标记好的抗体NP24-AE和NP24-BIO进行样品测试，验证标记抗体是否可用，并考察信噪比。 所用试剂： 标记液：PH 9.5 50mM CB 抗体储存液：PH 7.4 0.1M PBS+2％BSA+1‰Tween-20+2‰NaN3 注意事项： 1、加AE和BIO时应注意，应将AE和BIO加至离心管壁上，然后用CB将其冲散，最后与抗体混合，如果AE或BIO从管壁滑落与抗体结合，应弃用；
1.目的 规范单克隆抗体标记荧光FITC (快速标记法）标准操作程序 2.适用范围 适用于本公司抗体标记荧光FITC (快速标记法）操作 3.术语和定义 单克隆抗体采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)。其标记原理: FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加（异）硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记。 4.职责和权限 实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。 5.实验试剂. 5.1溶液配制
5.2其他试剂 6.操作流程 6.1抗体活化 将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。 6.2与FITC反应形成共轭物 将抗体混合液（步骤6.1）加入mg FITC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。 6.3荧光淬灭 向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4透析 PBS中4度避光透析，3小时换液一次，连续透析8小时。或者PBS中4度避光透析过夜后换液一次，继续透析三小时。 6.5保存 收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。
抗体的HRP标记 服务内容 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上的过程，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。康为世纪提供生物拥有国内领先的抗体服务技术、先进的仪器设备和专业的抗体技术人员，可为客户提供一流的抗体标记服务，包括HRP标记、Biotin 标记、FITC和胶体金（CO-AO）标记等服务。 服务优势 ·拥有丰富的抗体标记技术服务经验 ·所有标记物均来自美国PIERCE公司提供的原装产品。 ·我们提供的标记服务，可根据您科研的需求，满足您的需要，质量保证，价格合理。 样品要求 ·待标记抗体＞2mg，纯度＞90% 浓度＞2mg/ml。 ·抗原0.5mg 浓度＞1mg/ml。 终产品 ·标记后抗体及主要理化指标； ·ELISA鉴定报告； ·完整实验报告。 抗体的Biotin标记 服务内容 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上的过程，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。康为世纪提供生物拥有国内领先的抗体服务技术、先进的仪器设备和专业的抗体技术人员，可为客户提供一流的抗体标记服务，包括HRP标记、Biotin 标记、FITC和胶体金（CO-AO）标记等服务。 服务优势 ·拥有丰富的抗体标记技术服务经验 ·所有标记物均来自美国PIERCE公司提供的原装产品。 ·我们提供的标记服务，可根据您科研的需求，满足您的需要，质量保证，价格合理。 样品要求 ·待标记抗体＞2mg，纯度＞90% 浓度＞2mg/ml。 ·抗原0.5mg 浓度＞1mg/ml。 终产品 ·标记后抗体及主要理化指标； ·ELI SA鉴定报告； ·完整实验报告。 抗体的FITC标记 服务内容 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上的过
荧光素标记抗体技术 (一)原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓ 收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。
HRP标记抗体的方法 抗体 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易 过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤： (1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则 以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去 除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定： (1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选 择)。 (2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量 克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝─── × 4 40,000 160,000 IgG量 (3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材： (1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 (2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。 (3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 (4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
抗体APC荧光素标记操作流程记录
1.目的 规范单克隆抗体标记荧光APC (快速标记法）标准操作程序 2.适用范围 适用于本公司抗体标记荧光APC (快速标记法）操作 3.术语和定义 别藻蓝蛋白（allophycocyanin ，APC ）由藻蓝胆素与蛋白质结合而成，APC具有荧光性，伴随着非常高的光吸收和高量子效率。 4.职责和权限 实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。 5.实验试剂. 5.1溶液配制 0.01mol/L PBS溶液配制 0.01 mol/L Phosphate Buffered Saline，pH 7.40 试剂名称配方量批号用量 Water 1L NaCl（MW 58.44）0.799g 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
0.2g KH2PO4（MW 136.09） KCl（MW 74.55）0.2g 2.89g Na2HPO4·12H2O （MW 358.14） 调节pH 7.40后，加水定容至 1.0L，再调节pH至7.40，过滤备用。 Storage Buffer，pH 7.40 试剂名称配方量批号用量 0.01mol/L PBS / BSA 0.5% NaN3 0.1% 调节pH 7.40后，加水定容至 1.0L，再调节至pH 7.40。 5.2其他试剂 试剂名称厂家批号 活化液（modifier） 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
淬灭剂（quencher） APC荧光素 6.操作流程 6.1抗体活化 将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入 mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。 6.2与APC反应形成共轭物 将抗体混合液（步骤 6.1）加入mg APC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。 6.3荧光淬灭 向共轭物（步骤 6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。淬灭开始时间：至结束时间：。 6.4层析 将共轭物（步骤 6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。 6.5保存 收集得到的标记抗体（步骤 6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除