诱变和筛选方法在微生物育种中的应用
摘要: 本文综述了近年来国内微生物育种研究中理化因子等诱变方法和一些筛选方法的应用,并略述了理化诱变因子的诱变效应机制,以及这些诱变和筛选方法在科研和生产中的重要作用.
关键词:诱变筛选理化因子
引言
微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累,把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导,或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种.为达到这一目的,必须对微生物作诱变处理.在这一过程中,诱变和筛选是微生物育种的两个主要环节.目前, 国内微生物育种界主要采用的仍是常规的理化因子等诱变方法以及对目标菌株的筛选与检出方法.
一·诱变方法
1. 物理因子诱变
1.1紫外(UV)
DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力,最大的吸收峰在 260nm 紫外辐射能作用于DNA ,因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂. 对于紫外的作用已有多种解释 ,但研究的比较清楚的一个作用是使 DNA 分子形成嘧啶二聚体,即两个相邻的嘧啶共价连接.二聚体出现会减弱双键间氢键的作用 , 并引起双链结构扭曲变形 ,阻碍碱基间的正常配对,从而有可能引起突变或死亡.二聚体的形成 ,会妨碍双链的解开,因而影响DNA的复制和转录.紫外辐射可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等.
紫外线是常用的物理诱变因子,是诱发微生物突变的一种非常有用的工具. 由于 UV 的能量比X-射线和γ-射线低得多,在核酸中能造成比较单一的损伤, 所以在 DNA 的损伤与修复的研究中,UV也具有一定的重要性.
1.2 低能离子
低能离子生物学是我国首创的研究领域.离子注入生物体既存在能量、动量交换过程,又存在粒子沉积过程. 而动量、能量和质量三种作用都有其不同的生物学效应.离子注入与生物体相互作用存在峰值. 在峰值范围内,注入离子与生物体相互作用是局部的、双重的和不易修复的.在离于注入过程中,生物分子将吸收能量 , 经历着复杂的物理和化学的变化,这些变化的中间体是各类自由基. 所产生的活性自由基,能引起其它正常生物分子的损伤.可使细胞中的染色体畸变,DNA链发生断裂,也可使质粒DNA造成断裂点.由于低能离子在微生物诱变育种中的高效 ,它正在得到越来越广泛的应用.而且因为离子注入射程的可控性 , 随着微束技术和精确定位技术的发展 ,定位诱变将成为可能.
1.3 γ-射线
γ-射线属于电离辐射,是电磁波.一般具有很高的能量,能产生电离作用, 因而直接或间接地改变DNA结构.其直接效应是,脱氧核糖的碱基发生氧化,或脱氧核糖的化学键和糖 - 磷酸相连接的化学键,DNA的单链或双链键断裂.其间接
效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基,这些自由基与细胞中的溶质分子起作用 , 发生化学变化,作用于DNA分子而引起缺失和损伤.此外,电离辐射还能引起染色体畸变,发生染色体断裂,形成染色体结构的缺失、易位和倒位等.电离辐射通常用于不能使用其他诱变剂的诱变过程.γ- 射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一,实际应用的电离辐射还有X - 射线、β- 射线和快中子等.
1.4激光
激光是一种光量子流 ,又称光微粒.激光辐射可以通过产.生光、热、压力和电磁场效应的综合应用.直接或间接地影响有机体,引起细胞DNA或 RNA.质粒. 染色体畸变效应,酶的激化或钝化,以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变.光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用,都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异. 不同种类的激光辐射生物有机体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同作为一种新的诱变源,激光以其高亮度、高方向性、高相干性以及单色性 , 在微生物育种领域已得到广泛应用.而且,不同种类的激光辐照微生物,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同,这也给微生物诱变育种提供了便利条件.
1.5 空间条件、磁场、高温
国家开展863高技术航天领域空间诱变育种的研究,取得了很好的成绩.空间环境具有强辐射、微重力、高洁净、高真空等特点,有诱发突变的因素.在空间生命科学领域中 , 微重力和宇宙射线的生物学效应,是最重要的.宇宙射线作用于生物体的最直接效应是引起生物体内发生电离,产生许多次高能电子和自由基,自由基对生物大分子造成损伤,使生物产生变异病变,组织损伤致死等效应.
磁场及高温等诱变方法在微生物育种中也有运用,但并不很多.
2．化学因子诱变
化学诱变剂是一类能和DNA 起作用而改变其结构 , 并引起DNA变异的物质. 其作用机制都是与 DNA 起化学作用,从而引起遗传物质的改变,因而诱变效应与其理化特性有很大关系.
2.1烷化剂
NTG是最有效,也是用得最广泛的化学诱变剂之一.依靠NTG诱发的突变主要是 GC— AT转换,另外还有小范围切除、移码突变及 GC对的缺失.在自然条件下NTG容易分解,而在酸性(PH5. 5)条件下会产生 HN02.虽然 HNO2 本身就是诱变剂,但在NTG有活性时(PH6～9),它却无诱变效果.在碱性条件下,NTG会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因. 它的效应很可能是CH2N2 对DNA 的烷化作用引起的，另外,烷化剂中的EMS和DES,也是应用较为广泛的诱变剂。
2.2其它
除烷化剂外,常用的化学诱变剂还有嵌合剂,如吖啶橙;碱基类似物，如 52溴尿嘧啶(5 -Bu) ;以及抗生素类等.总之,化学诱变剂在微生物育种中的应用较多,有的诱变效果也较为理想.但因其对人体的致畸致癌作用,实际应用中也受到一定的限制.
3.复合因子诱变
复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用;同一种诱变剂的重复作用;两种或多种诱变剂的同时使用.普遍认为,复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用,复合诱变较单一诱变效果好.复合因子较单一因子诱变效果有很大优势.但因目前大多微生物,尤其是抗生素产生菌的遗传背景不清
楚,往往对诱变剂,特别是复合诱变剂的选择使用,带有很大的盲目性.
二·筛选方法
1.初筛和复筛
除了诱变过程的最适条件外,突变菌株的分离和筛选也是微生物育种的关键环节.筛选一般分初筛和复筛两个阶段。初筛可在摇瓶中完成,也可采用琼脂块法,即将适宜的反应试剂喷涂在平板上正在生长的菌落中,或采用混合指示剂在培养基上染色,直接观察特定的酶活性,或者将待测菌落打落,放置在涂有特定菌的检定盘上,依抑菌圈的大小定量测定菌株的抗菌活性物质的含量.初筛得到的高产菌株,再进行摇瓶复筛,对其生产性能作更精确的定量测定.
2．随机筛选和定向筛选
在初筛阶段进行的高产菌株的检出方法又有随机筛选和定向筛选之分.随机筛选具有很大的盲目性,且工作量很大.定向筛选常用来筛选抗性突变株和营养缺陷型突变株,其筛选效率远高于随机筛选.
2.1抗性突变株的筛选
抗性突变包括抗代谢产物,抗代谢类似物 ,抗噬菌体,抗前体及其类似物, 抗重金属离子或抗特定的有毒物质,抗培养基中的某些成分等.代谢产物等的积累,往往对其自身的合成具有反馈调节作用,筛选的抗性突变株,可以消除这些不利因素的抑制或阻遏作用,达到积累目的产物的作用.这些方法在抗生素生产中尤为重要,抗生素产生菌的抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密联锁而易发生共突变.在抗生素菌种选育中,抗性突变株往往就是高产突变株.
2.2营养缺陷型的筛选
营养缺陷型的本质是一种减低或消除末端产物以解除反馈抑制,使代谢途径中的中间产物或分枝合成途径中的末端产物得以积累.微生物育种中的筛选环节极为繁杂,工作量很大.同时,代谢产物生产能力强弱是数量性状,数量性状是微效多基因与环境条件相互作用的结果.由于发酵条件的不稳定性,发酵及测定操作中的人为误差,使得准确筛选的困难很大.如果建立起自动化测量等工作,效率及准确率将会大大提高.目前,重组 DNA 和原生质体融合等方法已用于菌种选育,但用于大规模生产的还不多,常规的诱变和筛选方法在微生物育种工作中仍占主导地位.
参考文献
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微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
微生物菌种的选育方法 菌种选育Loremreferentibus（英语：Strain selection 日语：ひずみの选択法语：la sélection des souches 俄语：Штаммвыбор 德语：Stammselektion ）微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。菌种用途广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 自然选育
自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。 自然选育的步骤主要是：采样，增长培养，培养分离和筛选等。采样筛选的菌种采集的对象以土壤为主，也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地，从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物，故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好，但是得到的微生物还是处于混杂状态，因为样品中本身含有许多种类的微生物。所以，为了取得所需的微生物纯种，增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种：即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法在溶液中再加入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落，然后对各个菌落进行有关性状的初步测定，从中选出具有优良性状的菌落。例如，对抗生素产生
育种的方法和应用 生物育种是一门很复杂的技术，针对不同的生物应采用不同的育种方式，要对各种育种方式进行比较，选择简易、可操作的方式。同一种育种方式应用于不同的生物也会有不尽相同的育种过程，所以我们无论在生产实践中还是有关习题训练中都应灵活应用。 一、几种育种的方法的比较 在高中阶段所介绍的育种方法主要有：诱变育种、杂交育种、多倍体育种、单倍体育种、细胞工程育种（组织培养育种）、基因工程育种（转基因育种）、植物激素育种等。 1、杂交育种 (1)原理：基因重组。 (2)方法：连续自交，不断选种。（不同个体间杂交产生后代，然后连续自交，筛选所需纯合子） (3)发生时期：有性生殖的减数分裂第一次分裂后期或四分体时期， (4)优点：使同种生物的不同优良性状集中于同一个个体，具有预见性。’ (5)缺点：育种年限长，需连续自交才能选育出需要的优良性状。 (6)举例：矮茎抗锈病小麦等。 2、诱变育种 (1)原理：基因突变。 (2)方法：用物理因素(如x射线、1射线等)、化学因素(如亚硝酸、秋水仙素等各种化学药剂)、生物因素或空间诱变育种(用宇宙强辐射、微重力等条件)来处理生物。 (3)发生时期：有丝分裂间期或减数分裂第一次分裂间期(DNA分子复制的时候)。 (4)优点：能提高变异频率，加速育种进程，可大幅度改良某些性状，创造人类需要的变异类型，从中选择培育出优良的生物品种；变异范围广。 (5)缺点：有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制；改良数量性状效果较差，具有盲目性。 (6)举例：青霉素高产菌株、太空椒、高产小麦、“彩色小麦”等。 3、多倍体育种 (1)原理：染色体变异。 (2)方法：秋水仙素处理萌发的种子或幼苗(秋水仙素能抑制细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成)。 (3)优点：可培育出自然界中没有的新品种，且培育出的植物器官大，产量高，营养丰富。 (4)缺点：结实率低，发育延迟。 (5)举例：三倍体无子西瓜、八倍体小黑麦。 4、单倍体育种 (1)原理：染色体变异。 (2)方法：花药离体培养获得单倍体植株，再用秋水仙素等诱导剂人工诱导染色体数目加倍。 (3)优点：自交后代不发生性状分离，能明显缩短育种年限，加速育种进程。 (4)缺点：技术相当复杂，需与杂交育种结合，其中的花药离体培养过程需要组织培养技术手段的支持，多限于植物。 (5)举例：“京花一号”小麦。 5、细胞工程育种 （1）方式：植物组织培养植物体细胞杂交细胞核移植 （2）原理：植物细胞的全能性植物细胞膜的流动性动物细胞核的全能性 （3）方法：离体的植物器官、组织或细胞→愈伤组织→根、芽→植物体去掉细胞壁
现代生物技术在育种上的应用 第二节现代生物技术在育种上的应用【学习目标】知识与能力方面： 1.描述转基因技术育种和细胞杂交育种等现代育种技术。 2. 列举现代育种技术在实践中应用的实例，探讨其前景。 3.关注转基因生物及其产品引发的社会问题。过程与方法方面：本节课主要采取学生通过小组合作探究的方法，探究转基因技术育种和细胞杂交育种等现代育种技术在农业、生活中的应用。在小组合作探究中理解科学、技术、社会三者的关系。培养学生的合作探究精神，和自我学习、搜集信息和处理信息的能力。情感态度、价值观方面：培养学生关爱社会、关注科技发展,关爱农业发展、热爱农业的情感，培养他们社会责任感。同时，关注转基因生物及其产品引发的社会问题。【学习过程】按照教师的安排探究转基因技术流程和细胞杂交育种一、探究转基因技术育种 1.转基因技术：转基因技术是指按照人们的意愿，把一种生物的某个基因克隆出来，加以修饰和改造，在转移到另一种生物的细胞中，从而定向改造生物的遗传性状。 2.流程： 2.转基因植物的实例. (1)转基因耐贮藏番茄（2）转基因抗虫作物（3）抗除草剂作物 3.转基因动物实例二、细胞杂交育种 1．概念：细胞杂交是指将同类或不同类生物体的原生质体或体细胞，在一定的物理或化学条件下进行融合形成杂种细胞，再创造条件将杂种细胞培养成完整的杂种生物个体。 ] 2．（1）植物细胞杂交示意图 【典题解悟】番茄在运输和贮藏过程中，由于过早成熟而易腐烂。应用基因工程技术，通过抑制某种促进果实成熟激素的合成能力，可使番茄贮藏时间延长，培育成耐贮藏的番茄新品种，这种转基因番茄已于1993年在美国上市。请回答： (1)促进果实成熟的重要激素是_________，它能够发生的化学反应类型有_________ 、_________和 _________。 (2)在培育转基因番茄的基因操作中，所用的基因的“剪刀”是_________。基因的“针线”是_________，基因的“运输工具”是_________。 (3)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是_________、 _________和 ____ _____ [解析]基因工程又叫基因拼接技术. 转基因技术是指按照人
一多倍体育种 定义：通过增加染色体组数以改造生物遗传基础，从而培育出符合人类需要新品种的方法。 多倍体是指由受精卵发育而来并且体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体。 多倍体育种利用人工诱变或自然变异等，通过细胞染色体组加倍获得多倍体育种材料，用以选育符合人们需要的优良品种。 最常用、最有效的多倍体育种方法是用秋水仙素或低温诱导来处理萌发的种子或幼苗。秋水仙素能抑制细胞有丝分裂时形成纺锤体，但不影响染色体的复制，使细胞不能形成两个子细胞，而染色数目加倍。 多倍体产生机制：通过卵细胞第二极体的保留或受精卵早期有丝分裂的抑制而实现。 多倍化后，多个等位基因互作产生了更多的组合和更多样的功能变化，从而比二倍体亲本拥有更高的杂合性和更迅速的环境适应力，表现为抗逆性增强及克服远缘杂交的不育性等特点 经典理论认为，植物天然多倍体基因组主要起源于体细胞有丝分裂异常、未减数分裂配子融合和种间杂交三个途径。 诱变方法： 人工诱变染色体加倍的方法很多，可分为物理诱变法、化学诱变法和生物诱变法。 物理法包括：机械损伤、高低温和射线照射等 生物学诱导途径包括：不同倍性材料间杂交育种，胚乳培养，细胞杂交等 化学诱变：主要利用化学诱变剂与细胞发生一系列生化反应阻止有丝分裂的正常进行，使分裂后期的染色体全部进入一个子代细胞中而产生多倍体。化学药剂包括秋水仙素、萘乙烷、异生长素、吲哚乙酸、氨磺灵...... 二杂交育种 1.概念：是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。 2.原理：基因重组。通过基因重组产生新的基因型，从而产生新的优良性状。 3.优点：可以将两个或多个优良性状集中在一起。 4.缺点：不会产生新基因，且杂交后代会出现性状分离，育种过程缓慢，过程复杂。 原则 ①亲本应有较多优点和较少缺点，亲本间优缺点力求达到互补。 ②亲本中至少有一个是适应当地条件的优良品种，在条件严酷的地区，亲本最好都是适应环境的品种。 ③亲本之一的目标性状应有足够的遗传强度，并无难以克服的不良性状。 ④生态类型、亲缘关系上存在一定差异，或在地理上相距较远。 三诱变育种
学习好资料欢迎下载 高中生物育种知识整理 安宁中学金志忠 育 种方式原理变异原因 发生 时期 方法优点缺点实例 杂 交育种基因重组 非同源染色 体上的非等 位基因自由 重组或一对 同源染色体 上的等位基 因交叉互换 减数第一次 分裂后期或 四分体时期 杂交—自交—选优— 自交—选纯 ①杂交→F1→F2→F3 →从自交后代中选出 不发生性状分离的优 良纯合体[用种子繁 殖] ②杂交→F1只要得到 所需的性状即可[用于 营养生殖] 可获优良 性状新品 种；可见 性强；操 作简单 育种年限 长，至少需 3年，一般 在8年左右 抗倒伏抗 锈病小麦 等 诱 变育种基因突变 DNA复过程 发生差错 多在有丝分 裂间期或减 数分裂第一 次分裂间期 ①物理方法：射线（X 射线、r射线、紫外线）、 激光等； ②化学方法：亚硝酸、 硫酸二乙酯等； ③作物空间诱变育种 提高突变 频率，加 速育种进 程，大幅 度改良性 状 需大量的 供试材料， 可预见性 不强；盲目 性大 青霉素高 产菌株， 太空椒等 单倍 体育种染色体变异 染色体成倍 减少 花药离体培养 （杂交）→F1 →………………→单 体人工诱导使染色体 加倍 ………………→纯合 体（从中选体） 明显缩短 育种年限 技术相对 复杂，不能 产生更多 的变异，不 能大幅度 的改良形 状。 多倍 体育种染色体变异 染色体组成 倍增加 用一定浓度的秋水仙 素处理萌发的种子或 幼苗得到多倍体 营养器官 大，营养 物质含量 高 结实率下 降，发育迟 缓 三倍体无 籽西瓜 基因 工程育种基因重组 人为地引入 外源基因和 生物体内原 有基因重新 组合 提取目的基因→目的 基因与运载体结合→ 将目的基因导入受体 细胞→目的基因的检 测与表达 可定向地 改变生物 的性状， 打破不同 物种之间 的不能杂 交界限， 迅速获得 优良性状 可定向地 改变生物 的性状，打 破不同物 种之间的 不能杂交 界限，迅速 获得优良 性状 抗虫棉
微生物诱变育种的方法 摘要:介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。 关键词:诱变; 微生物育种 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切，其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏，甚至影响人们的日常生活质量，所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导，或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状，人为地使某些代谢产物过量积累，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前，国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。 1 物理诱变 1.1紫外照射 紫外线照射是常用的物理诱变方法之一，是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释，但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对，所以可能导致突变甚至死亡[2]。 马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克 鲁维酵母菌株ZR-20，比优化前的酒精产率提高10.5%，较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体，获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株，其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L，分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。 紫外照射诱变操作简单，经济实惠，一般实验室条件都可以达到，且出现正突变的几率较高，酵母菌株的诱变大多采用这种方法。 1.2电离辐射 γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一，具有很高的能量，能产生电离作用，可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基，或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使
高中生物的几种育种方式 1 杂交育种 1.1 原理 以杂交方法培育优良品种或者利用杂种优势成为杂交育种。 1.2 方法 在杂交育种中应用最为普遍的是品种间杂交（两个或多个品种间的杂交），其次是远缘杂交（种间以上 的杂交）。在杂交育种时，应采用基因纯合体作亲本，正确识别表现型和基因型的区别。对杂种来说，表 现型相同的个体，基因型却不一定相同。纯合体不再分离，而杂合体后代继续出现分离。掌握了这个原理， 就能有效的指导育种工作。 1.3 优点 杂交可以使生物的遗传物质从一个群体转移到另一群体，是增加生物变异性的一个重要方法。不同类型 亲本的杂交可以获得性状的重新组合，杂交后代中可能出现优良性状的组合，甚至出现超亲代的优良性状。 1.4 缺点 也可能出现双亲的劣势性状组合，或者双亲所没有的劣势性状。另外时间长，需及时发现优良性状。 1.5 应用 从20世纪40年代起，世界各国共同发起了一场名为“绿色革命”的农业增产运动，大大提高了粮食产 量。而这一成就斐然、声势浩大的运动就是科学家通过杂交育种的育种方式，培育出了许多高产而且品质 优良的农作物而取得成功的。 小麦高茎D（易倒伏）、抗锈病T的纯种与矮茎d（抗倒伏）易染锈病t的纯种杂交，培育出矮茎、 抗锈病的品种。【小麦的抗病性状，多由显性基因控制，为获得稳定的抗病类型，必须连续自交选择。】 DDTT X ddtt ↓ DdTt ↓ D_T_ D_tt ddT_ ddtt 由于后代中矮茎、抗锈病的小麦品种的基因型为ddT_，不一定是纯合子，所以应将其连续自交，增大 纯合子的概率，达到育种的目的。 2 诱变育种 2.1 原理 指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，进 而培育成新的品种或种质的育种方法。 2.2 诱因 诱发突变的物理因素主要指某些射线，如x射线、B射线、Y射线和中子流等；化学诱变剂主要指某些烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物。 2.3 优点 能提高变异频率，加速育种过程，可大幅度改良某些性状；变异范围广。 2.4 缺点 有利变异少，须大量处理材料；诱变的方向和性质不能控制；改良数量性状效果较差。 2.5 应用 物理诱变方法应用于植物始于1928年。L.J.斯德勒首先证实了X射线对玉米和大麦有诱变育种。1930年和1924年H.尼尔逊.爱尔和 D.托伦纳分别用辐射诱变技术获得了有真实价值的大麦突变体和烟草突变 体。化学诱变剂在植物上德应用一般认为始于1943年，当时 F.约克斯用马来糖（脲烷）诱发了月见草、 百合和风铃草的染色体畸变。 理化因素的诱导作用，使得植物细胞的突变率比平时高出千百倍，有些变异是其它手段难以得到的。 当然，所产生的变异绝大多数不能遗传，所以，辐射后的早代一般不急于选择。 我国的诱变育种同样成绩斐然，在过去的几十年中，经诱变育种的品种数一直占到同期育种品种的1 0％左右。如水稻品种原丰早，小麦品种山农幅63，还有玉米的鲁原单4号、大豆的铁丰18、棉花的鲁棉1号等都是通过诱变育成的。 2.6 实例 太空椒正是用曾经遨游过太空的青椒种子培育而成的。与普通椒相比，太空椒的果实个大、肉厚、口感 好，维生素C的含量高，在大田生产中产量比普通青椒高25～30％。
转谷氨酰胺酶生产菌株的诱变选育方案 学生： 摘要：通过诱变育种选育转谷氨酰胺酶工业生产菌株，使目的菌株产酶量高、酶活高、到达最大产酶量的时间短，生长周期、最适产酶温度等条件尽可能地符合工厂要求。 关键字：筛选；工业菌株；诱变育种 前言： 工业微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造, 去除不良性质, 增加有益新性状, 以提高产品的产量和质量的一种育种方法。工业微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等, 育种技术的不断成熟, 大大提高了微生物的育种效果。 微生物发酵要想取得优良成绩, 有赖于优良菌种的利用。从工业发酵的观点来看发酵菌种的优异生产性能等于经选育的、符合经济要求的优良遗传背景加上经人为精心设计的、优化的发酵环境。菌种选育的最终目标, 就是通过人工干预, 使选出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。菌种分离、筛选、改良是贯彻微生物发酵始终的工作。 一．菌种选育的具体目标 (1) 提高产量。 (2) 提高产物的纯度。减少副产物; 提高有效组分;减少色素等杂质。 (3) 改变菌种性状。改善发酵过程, 包括: 改变和扩大菌种所利用的原料结构; 改善菌种生长速度; 提高斜面孢子化程度; 改善菌丝体形状, 采用菌球菌丝体发酵;少用消泡剂或使菌种耐合成消泡剂; 改善对氧的摄取条件, 降低需氧量及能耗; 耐不良环境: 抗噬菌体的侵染,耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的代谢产物; 改善细胞透性, 提高产物的分泌能力等。 (4) 菌种的遗传性状。生产性状稳定。 (5) 改变生物合成途径。以获得新产品。 二．获取优良菌种的有效途径 广义上说, 菌种改良可描述为采用任何科学技术手段( 物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种, 从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。 菌种改良的基本途径: 突变和选择; 基因重组( 遗传重组) 和基因工程( 遗传工程) MTG 生产菌株的诱变育种 诱变的方式包括了各种物理射线、化学诱变剂以及生物方面的噬箘体等等。用得最多的是前两种，也有将几种方式混合使用的。国内的王璋教授还曾借助“神舟”4 号飞船搭载MTG 生产菌种在外太空进行诱变实验，取得不错的效果。
第一章工业微生物育种诱变剂 1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。 包括紫外线、X射线、r射线。快中子。微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射） 2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。 3辐射作用的时相阶段： 物理阶段——直接作用DNA或作用于水 物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子 化学阶段——产生生物自由基 生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡 4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用 5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。 6紫外线的诱变机理及原因？ 机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体 原因：形成嘧啶二聚体 7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？ 光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。 暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。 8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm 9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示 10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算） 步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。将菌体培养至最佳状态（对数期）。 （3）制备菌悬液离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，要求菌体浓度108，107， 106 mL-1等 （4）紫外线照射紫外灯预热20min；避免光修复。 （5）后培养将照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h。 （6）稀释涂皿后培养结束后，从中取一定量培养物，经不同稀释，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液做对照皿，培养后，挑取菌落，以待筛选。 11化学诱变剂的概念：一类能够对DNA起作用、引起遗传变异的化学物质。 12以5-BU为例，详述碱基类似物的诱变机理：（见书43页） 答：诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺入诱变剂。 1）争产掺入错误复制
生物育种专题练习
生物育种专题 一、选择题(每题2分，共50分) 1．在红粒高秆的麦田里，偶然发现一株白粒矮秆优质小麦，欲获得白粒矮秆麦种，通常用的育种方法是() A．自交育种B．诱变育种 C．人工嫁接D．单倍体育种 答案 A 2．2008年9月25日21时10分，“神舟七号”载人飞船成功发射升空，随“神七”一起遨游太空的有珙桐、鹅掌楸的种子各50 g，这是我国迄今为止首次进行珍稀濒危林木航天诱变育种实验。下列有关太空育种的说法，不正确的是() A．太空育种常选萌发的种子或幼苗作实验材料 B．太空育种是利用太空微重力、强辐射等因素诱发基因突变 C．太空育种不一定就能获得人们所期望的优良性状 D．若改良缺乏某种抗病性的植物品种，不宜采用太空育种 答案 D 3．科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶主要蛋白。以下有关基因工程应用的叙述，正确的是() A．食用转基因马铃薯不会存在任何危险 B．目的基因导入受体细胞之后一定能够表达出人奶蛋白 C．马铃薯的受精卵、叶肉细胞都可作为受体细胞 D．转基因马铃薯的培育属于细胞水平上的技术 答案 C 4．用纯合的二倍体水稻品种高秆抗锈病(DDTT)和矮秆不抗锈病(ddtt)进行育种时，一种方法是杂交得到F1，F1再自交得到F2；另一种方法是用F1的花药进行离体培养，再用秋水仙素处理幼苗得到相应植株。下列叙述正确的是() A．前一种方法所得的F2中重组类型、纯合子各占5/8、1/4 B．后一种方法所得到的植株中可用于生产的类型比例为2/3 C．前一种方法的原理是基因重组，原因是非同源染色体自由组合 D．后一种方法的原理是染色体变异，是由于染色体结构发生改变 答案 C 5．在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是() A．限制酶和连接酶B．限制酶和水解酶 C．限制酶和运载体D．连接酶和运载体
第一章绪论 一、微生物遗传育种 对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。 二、微生物遗传育种的具体目标: 1、提高产量生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标 2、提高产物的纯度，减少副如色素；提高有效产物组分 3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌 4、遗传性状特别是生产性状稳定 5、改变生物合成途径，获得新产物 三、优良发酵菌株应具备哪些特性 1、遗传稳定 2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到 3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体） 4、种子生长旺盛 5、发酵周期短，产量高，产物单一 6、产物易于分离纯化 第二章微生物遗传学基础 一、名词解释： 基因：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。 转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。 转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重
组 接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。 菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 二、突变型的种类：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。 三、试质粒的性质及其在基因工程中的应用 性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。 第四章工业微生物诱变育种 一、物理诱变剂基本作用过程 物理过程：能量吸收和传递物理化学作用：分子激发 化学过程：DNA断裂、碱基异构、碱基化学共价交联、碱基脱氨基等 生物学过程：经过DNA修复、复制、细胞分裂、代谢，产生死亡、基因突变、染色体畸变、染色体倍性变化等，使细胞死亡或形成各种突变体 二、紫外线的诱变机制 1、造成NDA断裂、与蛋白质交联、形成胸腺嘧啶二聚体 2、形成胸腺嘧啶二聚体是UV 引起突变的主要原因。形成于单链相邻TT间、或双链间 3、单链上出现TT二聚体，复制可能在此停止，或超越这一点继续复制，使子代DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成突变 4、双链间出现TT二聚体造成复制无法进行 三、DNA中TT二聚体的修复方法 1、光复活：90％，可见光，在黑暗下TT与一种光激活酶结合成较稳定的复合物，但在可见光下这种酶吸收光能而解离，二聚体重新分解！！！紫外诱变时照射和分离均应在黑暗或红光下进行 1、切补修复：4种酶参与，识别、内切、外切、延伸、连接。紫外诱变照射后在冰
现代生物技术在育种中的应用及展望。 现代生物技术也称生物工程是在分子生物学基础上建立的创建新的生物类 型或新生物机能的实用技术，是现代生物科学和工程技术相结合的产物。现代 生物技术综合基因工程、分子生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、有机化学、无机化学、物理化学、物理学、信息学及计算机科学 等多学科技术，可用于研究生命活动的规律和提供产品为社会服务等。随着基 因组计划的成功，在系统生物学的基础上发展了合成生物学与系统生物工程学，开发生物资源，涉及农业生物技术、环境生物技术、工业生物技术、医药生物 技术与海洋生物技术，乃至空间生物技术等领域，将在21世纪开发细胞制药厂、细胞计算机、生物太阳能技术等发挥关键作用。 现代生物技术在农业育种上的应用主要有：作物组织培养技术、体细胞杂 交技术、农作物人工种子、转基因育种技术、分子标记育种技术等。农作物组 织培养技术主要用于品种培育和良种繁育，其次用于无性繁殖作物的脱毒和快 速繁育以及种质资源的保存；体细胞杂交可以创造出更有经济价值或更广泛适 应性的作物新品种；人工种子可对一些自然条件下不结实或种子昂贵的作物进 行繁殖，缩短育种年限，并可人为控制作物生长发育和抗性，防止种性退化；转基因育种是对农作物进行基因转移，使其获得新的优良品性，培育出具有抗寒、抗旱、抗盐、抗病虫害等抗逆特性及品质优良的作物新品系；分子标记辅 助育种技术是利用与目的性状基因紧密连锁的的分子标记，鉴定和筛选具有目 的性状的种质资源和育种后代，或分析和评价种质资源、亲本之间的亲缘关系 的一种方法，与传统育种依表现型进行选择相比，该项技术具有选择效率高， 结果准确等特点，特别是对隐性基因控制的性状选择更为有效。 现代生物技术在棉花育种中已经广泛应用。细胞工程中, 通过胚珠培养、 体细胞培养等技术获得了一些新种质材料;基因工程方面, 随着农杆菌介导法、 基因枪轰击法及花粉管通道法等技术的突破, 在棉花抗病虫害和及抗除草剂等 方面的育种获得成功, 相应的新品种已开始了商业化生产。我国棉花生物技术 在抗棉铃虫等方面达到世界领先水平,其他方面尚有差距。 现代生物技术中的单倍体育种技术、基因工程育种、分子标记辅助育种等 生物技术手段与常规育种技术的有机结合提高了玉米育种的效率, 开辟了玉米 育种的新途径。利用单倍体育种技术选育自交系已经成为自交系选育的重要手段、利用分子标记划分玉米杂种优势群和杂种优势模式已经得到了大家的认可 并在育种实践中加以应用, 转基因玉米已经逐步从实验室走向田间, 并将很快实 现产业化。而高成本、掌握难、重复性和通用性差等问题仍然制约着生物技术 在玉米育种中应用。 现代生物技术在育种中的应用，大大加快了育种速度，缩短了育种年限， 同时也为品种改良开辟了新的道路，是现代育种中不可或缺的技术手段。应加 大对现代生物技术的投入与研究力度，因为我国的生物技术水平，在现阶段，
工业微生物育种简介 刘春波-12生工2-20120802224 摘要：本文综述了工业微生物遗传育种的历史地位，介绍了遗传育种的方法和机理，并对其前景进行了展望。微生物遗传育种，所谓微生物遗传育种，即菌种改良，是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法[1]，使我们获得所需要的高产、优质和低耗的菌种，其目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。 关键词：工业微生物；遗传育种；方法；机理 工业微生物菌株选育在工业发酵中占有重要地位。用于工业生产的微生物菌种，最好具有以下特征：1.在遗传上必须是稳定的。2.易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体3.必须是纯种，不应带有其它杂菌及噬菌体。4.种子的生长必须旺盛、迅速。5.产生所需要的产物时间短。6.比较容易分离纯化。7.有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。8.能保持较长的良好经济能力。9.菌株对诱变处理较敏感，从而提高产量潜力高[2]。 1 历史地位 菌种选育技术的广泛应用为我们提供了各种类型的突变菌株，使得在食品工业、医药、农业、环境保护、化工能源、矿产开发等领域产生众多新的产品，促使传统产业的技术改造和新型产业的产生，同时使诸如抗生素、有机酸、维生素、色素、生物碱、激素以及其它生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千万倍地增长，并且产品的质量也不断的提高。与此同时链霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等抗生素也大规模的生产起来；在代谢控制育种的推动下使得产氨基酸、核苷酸、有机酸等次生代谢产物的高产菌株大批投入生产；由基因工程构建的工程菌株使得微生物次生代谢产物生产能力迅速提高，而且生产出微生物本生不能生产的外源蛋白质，如胰岛素、生长激素、单克隆抗体和细胞因子等等。由此可见工业微生物遗传育种技术是工业发酵工程的核心技术，在其作用下人们获得了许多的高产优质菌株，为生产实践发展起了强大的推动作用。 2 机理及方法 2.1 自然选育 就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配[3]。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。
微生物菌种选育方式(一) 关键词：地衣芽孢杆菌诺卡氏菌 ATCC 北京标准物质网 微生物菌种选育技术在现代生物技术中具有十分重要的地位，经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种五个阶段，各个阶段并不孤立存在，而是相互交叉，相互联系的。新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展。 1．自然选育 随着微生物学的发展，特别是在发明微生物的纯培养技术之后，出现了微生物纯种的自然选育。以基因自发突变为基础选育优良性状菌株的这种方法，是最早应用微生物遗传学原理．进行育种实践的一个实例。由于微生物体内存在光复活、切补修复、重组修复、紧急呼救修复等修复机制以及DNA聚合酶的校正作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10-10这样低的突变率导致自然选育耗时长、工作量大，影响了育种工作效率。在这种情况下，就出现了诱变育种技术。 2．诱变育种 1927年，Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。之后，人们发现其他一些因素也能诱发基因突变，并逐渐弄清了一些诱变发生的机理，为工业微生物诱变育种提供了前提条件。1941年，Beadle 和 Tatum 采用X射线和紫外线诱变红色面包霉，得到了各种代谢障碍的突变株。在这之后，诱变育种得到了极大发展。 诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的一种诱变方法。诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。其中，物理诱变剂包括紫外线、X射线、射线、快中子等；化学诱变剂包括烷化剂(如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等)、天然碱基类似物、脱氨剂(如亚硝酸)、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类(如氯化锂及硫酸锰等)；生物诱变剂包括噬菌体等。物理诱变剂因其价格经济，操作方便，所以应用最为广泛；化学诱变剂多是致癌剂，对人体及环境均有危害，使用时须谨慎；生物诱变剂应用面窄，其应用也受到限制。 现今，诱变育种已取得了显著的成果，如青霉素生产菌的青霉素产量在40年内增加了近万倍，达到lO万u／ml左右；谷氨酸产生菌经紫外诱变处理，产酸率提高了3l％；用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽
1.工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？ 工业微生物育种建立在： （1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上； （2）物理和化学诱变剂的发现和应用； （3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。 工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。 2.工业微生物发展经历了哪几个阶段？ 1)自然选育阶段 2)人工诱变选育阶段 3)杂交育种阶段 4)代谢控制育种阶段 5)基因工程育种阶段 3.工业微生物育种的核心指标有哪些？ 1)在遗传上必须是稳定的。稳定性。 2)易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。 3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。 4)种子的生长必须旺盛、迅速。 5)产生所需要的产物时间短。转化率。 6)比较容易分离提纯。 7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 8)能保持较长的良好经济性能。产率。
9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。 10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。 4.革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？ 5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理； 球状体：G-菌，残留部分细胞壁。 是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。 L型细菌：自发突变形成细胞壁缺陷菌株； 6.原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。 酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等。
微生物诱变育种研究进展 摘要：本文综述了国内外微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物的机理进行了总结。从物理诱变、化学诱变及复合诱变三个方面介绍了诱变效应、作用机制及在实践中的应用，并对微生物诱变育种的研究进展进行了概述。 关键词：微生物；诱变育种；机制；研究进展 常规的诱变育种方法主要为物理诱变育种和化学诱变育种。微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异菌体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大和方法简单等优点，是菌种选育的1个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的。诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。近年来，随着新诱变因子的不断发现和筛选体系的进一步完善，微生物诱变育种有了长足的发展。 1 微生物诱变育种的作用 从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合工业化生产的要求。理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。微生物发酵工业中，诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量；改善菌种特性，提高产品质量；简化工艺条件；开发新品种，产生新物质；用于研究推测产物的生物合成途径；与其他育种方法相结合[1]。 2诱变育种的过程 诱变育种包括三个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选突变基因的表达。 2.1突变的诱发 突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。功的经验。诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌株的遗传背景有关。菌种的生理状态、被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。
微生物的诱变育种 一、教学目标及基本要求： 1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应； 2. 学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。 二、实验原理 紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。 紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。 紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。 本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。 三、实验材料 1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9） 3. 其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。 四、方法与步骤 1. 菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。 2. 细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml 生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。 3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。按下式计算每毫升细胞悬浮液菌体的浓度（N0）。 菌体浓度(个/ml) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数 4. 诱变处理 (1) 取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。 (2) 开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。 (3) 取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做三个平皿）。将结果填入表1。 表1 紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响