2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5′侧翼序列比较*
刘晓庆，丁志鑫，刘 晶，崔喜艳**
吉林农业大学生命科学学院，长春130118
摘 要：比较了扩增已知序列5′侧翼序列的2种PCR方法。方法一是反向PCR（IPCR），以大豆基因组酶切后的DNA 片段自身环化产物做模板，用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5′侧翼序列。方法二是热不对称交错PCR （TAIL-PCR），以大豆基因组DNA为模板，用3个巢式特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环。IPCR 和TAIL-PCR 2种试验方法分别扩增获得438bp和867bp特异产物。经测序发现：两片段两侧均含有设计的引物，其部分序列均与已知序列相一致，两者也有部分序列完全相同，但TAIL-PCR技术简单，重复性好，能够在短时间内获得目标片段。试验结果表明：TAIL-PCR技术在克隆侧翼序列时优于IPCR。
关键词：反向PCR；热不对称交错PCR；大豆；rbcS启动子
中图分类号：S52；Q78 文献标识码：A文章编号：1000-5684(2011)
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Comparison between Two PCR Techniques for Amplifying the 5′ Flanking Sequence of the rbcS Promoter from Glycine max
LIU Xiao-qing, DING Zhi-xin, LIU Jing, CUI Xi-yan
College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: The research was conducted to compare two PCR techniques for isolating a target DNA segment flanking the known sequence. Inverse PCR(IPCR), with two pairs of specific primers, was performed using genome DNA as the template digested with Eco RI, followed by self-ligation. TAIL-PCR, with combination of three nested specific primers and an arbitrary degenerated primer, respectively, was performed using the same genome template. 438bp and 867bp of specific fragments were obtained by IPCR and TAIL-PCR, Sequencing results confirmed primers and the known sequence. Comparatively, TAIL-PCR technique is very simple and reproducible and can obtain the target fragment in a shorter time. The results showed that TAIL-PCR is more efficient than IPCR in identifying the flanking sequence.
Key words: IPCR; TAIL-PCR; Glycine max; rbcS promoter
随着植物基因工程的发展，常需要构建能高水平
启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件[1]。因此，选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。目前人们越来越重视特异表达启动子的研究和应用，已分离鉴定了一批特异性启动子。如种子特异性启动子[2]、微管特异性启动子[3]、光诱导表达启动子[4]、根部特异性启动子[5]等组织特异性启动子。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。
1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco）存在于所有高等植物中，是光合植物叶片中含量最丰富的蛋白质（约占可溶性总蛋白的50%），也是光合作用中的关键酶[6]。Rubisco由8个大亚基（rbcL）和8个小亚基（rbcS）组成，其中由核基因编码的小亚基基因的表达受光调控,并具有叶组织特异性[7]。作为一种光诱导表达启动子，rbcS启动子经证实是一种高效表达的调控元件[8]。
启动子克隆的方法很多，包括常用的利用启动子探针型载体筛选，PCR方法，以及相继出现的一些基于PCR的克隆启动子技术，如载体锚定PCR、反向PCR、接头PCR、热不对称PCR等[9]。文中采用2种PCR技术扩增大豆rbcS启动子5′侧翼序列，一种是反向PCR（IPCR），一种是热不对称交错PCR
CNKI:22-1100/S.20110419.0835.006
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（TAIL-PCR ），同时比较了2种方法的优劣，为快速分离目的基因的启动子序列提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 大豆（Glycine max ）“吉农13”种子由吉林农业大学李海燕老师提供。大肠杆菌JM109菌株保存于吉林农业大学生命科学学院生物化学实验室；pMD18-T 载体，r Taq DNA 聚合酶，T 4 DNA 连接酶均为TaKaRa 公司产品；AxyPrep 基因组小量提
取试剂盒，DNA 凝胶回收试剂盒为AxyGEN 产品；其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 引物 IPCR 及TAIL-PCR 的巢式特异引物参照大豆RuBP 羧化酶小亚基基因（rbcS ）编码区上游DNA 序列（GenBank accession:M16889）设计；随机简并引物AD1，AD2，AD3保存于吉林农业大学生命科学学院生物化学实验室；依据TAIL-PCR 所得序列和已知序列设计特异引物SS ，SA ，引物名称及碱基组成见表1。引物均用Primer Premier5.0软件设计，由上海生工合成。
表1 引物名称及碱基组成
Table 1. Denomination and base composition of primers
中，放在养，白天相对湿度验材料。
AxyPrep 在酶切片[10-11]。的反应体，取5 T 4 DNA 14℃体系及条表2 反向PCR 反应体系及条件
Table 2. Reaction system and condition of inverse PCR
反应 Reaction
反应体系中各物质的量/μL
Amount of substance in the reaction system 扩增条件 Condition of PCR 循环数 Number of cycles
10倍 PCR Buffer 2.5 94℃ 5 min
1 dNTPs mixture （2.5 mmol/L ） 2
94℃ 30s, 48℃ 1 min,72℃ 2 min
30 IPS1(10μmol/L) 1 72℃ 10 min 1 IPA1(10μmol/L) 1 4℃ 15 min
1 连接产物 1 rTaq DNA 聚合酶 0.5 第一轮 Primary
加ddH 2O 至 25
10倍PCR Buffer 2.5 94℃ 5 min
1 dNTPs mixture （2.5 mmol/L ）
2 94℃ 30 s, 53℃ 1 min,72℃ 2 min
30 IPS2(10 μmol/L) 1 72℃ 10 min 1 第二轮 Secondary
刘晓庆等：2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5′侧翼序列比较第一轮PCR产物 1
rTaq DNA聚合酶0.5
加ddH2O至25
1%琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR产物，用DNA 凝胶回收试剂盒回收单一条带。回收产物与pMD18-T 载体连接，转化E.coli JM109感受态细胞，进行IPTG，X-gal筛选。挑白色单菌落扩大培养后提取重组质粒[13]，重组质粒经PCR鉴定后，将阳性菌液送上海生工测序。
1.2.4 热不对称交错PCR（TAIL-PCR）克隆5′侧翼序列热不对称交错PCR(TAIL-PCR)是由Liu和Whitter首次研究并报道，是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术的出现，解决了有关基因操作的一系列难题，如酶切、连接、加尾等[14]。
TAIL-PCR的操作程序参照刘耀光等[15]的方法，以大豆基因组DNA为模板，3个巢式特异性引物和简并引物组合进行TAIL-PCR扩增。将第1轮PCR产物稀释50倍作为第2轮PCR的模板，将第2轮PCR产物稀释100倍作为第3轮PCR的模板。1%琼脂糖凝胶电泳检测3轮PCR产物，并用DNA凝胶回收试剂盒回收第3轮PCR中的单一条带并测序，方法同本文“1.2.3”。3次PCR反应体系及条件见表3。
SA。以大豆基因组DNA为模板，以SS，SA为引物扩增大豆rbcS启动子序列，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。将纯化产物与pMD18-T载体连接，转化E.coli JM109感受态细胞,进行蓝白斑筛选，选取重组质粒PCR及酶切鉴定均为阳性菌液送生工生物工程（上海）有限公司测序。
将测序所得序列用nBlast程序对GenBank数据库进行检索;利用启动子在线软件(http://www.dna.affrc. go.jp/ PLACE)对其进行顺式作用元件分析。
2 结果与分析
2.1 反向PCR（IPCR）结果 积中自身环化，以检测不同连接体系对IPCR扩增结果的影响，电泳分析结果（图1）显示：在50 μL体积中进行连接扩增出3条带，在80 μL体积中进行连接扩增出单一条带，在100 μL体积中进行连接扩增出2条带，因此将在80μL体积中进行连接扩增的单一条带回收
并进行测序。将测序所得的566 bp碱基与设计引物的大豆rbcS基因比对，发现其3′和5′端均与已知序列的部分序列一致，表明克隆所得序列为大豆rbcS启动子5′侧翼序列。
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M. DL2000；1.在50 μL 连接体积中的PCR 产物PCR product in the reaction system of 50 μL ；2.在80μL 连接体积中的PCR 产物PCR product in the reaction system of 80μL ；3.在100 μL 连接体积中的PCR 产物PCR product in the reaction system of 100 μL
图1 反向PCR 产物的电泳分析
Fig.1. Analysis of inverse PCR products by agarose
electrophoresis
2.2 热不对称PCR（TAIL-PCR）结果
用1%
琼脂糖凝胶电泳检测TAIL-PCR 的3轮PCR 产物，在3个基因特异巢式引物（SP1，SP2，SP3）和简并引物组合中，均能扩出不同大小和亮度的产物，尤其是AD2简并引物和特异引物组合在第三轮PCR 产物中有清晰的单一扩增带（图2）。将AD2第三轮PCR 产物中的特异条带回收并测序。通过把测序所得序列与已知序列进行比对，发现所得序列的3′端不仅与已知序列部分序列一致，也与IPCR 所得序列的部分序列一致，说明扩增所得DNA 片段为大豆rbcS 启动子5′侧翼序列。
M ．DL2000；1~3.AD1和特异引物组合所得的第1，2，3轮PCR 产物Products of AD1 in the primary, secondary and tertiary reactions ；4~6. AD2 和特异引物组合所得的第1，2，3轮PCR 产物Products of AD2 in the primary, secondary and tertiary reactions ；7~9. AD3和特异引物组合所得的第1，2，3轮PCR 产物Products of AD3 in the primary, secondary and tertiary reactions
图2 TAIL-PCR 产物的电泳分析
Fig.2. Analysis of TAIL-PCR products by 1% agarose
2.3 大豆rbcS 启动子序列克隆及分析
依据TAIL-PCR 的测序结果和已知序列设计引物SS ，SA ；以大豆基因组DNA 为模板，SS ，SA 为引物进行PCR 扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：在约1500bp 处有单一的特异条带（图3），大小与推测的理论值相符；测序结果分析表明克隆所得序列的部分序列分别与IPCR ，TAIL-PCR 所得序列完全一致，与已知序列的部分序列也完全一致；同时将此序列进行nBlast 比对，进一步表明已成功克隆到大豆rbcS 启动子序列（图4）。
用PLACE 分析所得大豆rbcS 启动子序列，发现共有10个GATA 盒（GATA ），5个I 盒（GATAAG ），1个GT-1位点（GGTTAA ），5个GT-1保守序列(GRWAAW)，3个REalpha 元件（AACCAA ），这些都是在光诱导表达启动子中的保守元件，能够调节基因受光诱导后的转录活性（图5, 图中方框内序列为TATA 框、CAAT 框；标有下划线部分序列为启动子的顺式作用元件）。
M. DL2000；1.大豆rbcS 启动子的PCR 产物PCR product of rbcS
promoter from soybean
图 3 大豆rbcS 启动子序列的电泳分析 Fig.3. Analysis of soybean rbcS promoter on agarose
electrophoresis
图4 大豆rbcS启动子序列的nBlast比对
图5 大豆rbcS启动子序列
Fig.5. Nucleotide sequence of soybean rbcS promoter
3 讨 论
本研究采用IPCR及Tail-PCR技术分别获得了438bp，867bp的大豆rbcS启动子5′侧翼序列，经测分吻合。研究结果表明：本试验所描述的TAIL-PCR 技术在克隆5′侧翼序列时优于IPCR。
在IPCR试验中，基因组DNA经Eco RI酶切后，经反复试验，在样品DNA浓度相同的情况下设计了
不同的连接体系，在80μL连接体系中进行反应避免了多聚体的生成，使IPCR产生约500bp的特异性条带；而TAIL-PCR直接以基因组DNA为模板进行PCR 扩增，避免了IPCR方法中对基因组DNA酶切及自连接，节省了PCR反应前的许多费时、费力的操作程序。采用TAIL-PCR在很短的时间内克隆到867bp 的大豆rbcS启动子5′侧翼序列，进一步证实了TAIL-PCR在克隆已知序列侧翼序列时，具有简单易行、产物特异性高、重复性好、能快速获得目标片段等优点，是分子生物学研究中的一种实用技术。
本试验依据TAIL-PCR和已知序列重新设计特异引物，成功克隆了1538bp的大豆rbcS启动子序列，用PLACE分析此序列上潜在的顺式作用元件，发现存在许多光诱导元件，能够调节基因受光诱导后的转录活性。大豆rbcS启动子的克隆可为将生物技术应用于大豆品质改良提供理论依据。
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高中生物科学家及其实验总结 （1）19世纪30年代，德国施莱登和施旺提出了细胞学说，指出细胞是一切动植物结构的基本单位。 （2）1543年，比利时维萨里发表巨著《人体构造》揭示人体器官水平的结构法国比夏指出器官是由低一层次的结构——组织构成 （3）1665年，英国虎克用显微镜观察植物木栓组织并发现由许多规则的小室组成，并把“小室”称为——细胞 （4）荷兰著名磨镜技师列文虎克，用自制显微镜观察到不同形态的细菌、红细胞和精子等。 耐格里用显微镜观察了多种上植物分生区新细胞的形成，发现新细胞的产生原来是细胞分裂的结果。 (51858年，德国的魏尔肖总结出“细胞通过分裂产生新细胞” 英国的桑格经过10年努力，终于在1953年测得牛胰岛素全部氨基酸的排列顺序（6）19 65年我国科学家完成结晶牛胰岛素的全部合成 （7）19世纪末，欧文顿提出膜是由脂质组成的 （8）1959年，罗伯特森提出生物膜的模型，所有生物都是由蛋白质——脂质——蛋白质（静态模型）（9）1972年桑格和尼克森提出流动镶嵌模型 （10）1773年，意大利科学家斯帕兰札尼，通过实验证明，胃液有化学性消化作用。 （11）1857年法国微生物学家巴斯德，通过显微镜观察，提出酿酒中的发酵是由于酵母细胞的存在，没有活细胞的参与，糖类是不可能变成酒精的 （12）德国化学家李比希认为引起发酵的是酵母细胞中某些物质 （13）德国化学家毕希纳将酵母细胞中引起发酵的物质称为酿酶 （14）美国科学家萨姆纳从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并且通过化学实验证实脲酶是蛋白质 （15）20世纪80年代，美国科学家切赫和奥特曼发现少数RNA也具有生物催化功能
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/4e12657982.html, 基于PCR技术进行侧翼序列分离的方法比较 作者：曾满谢志雄 来源：《科学与信息化》2016年第32期 摘要利用PCR分离已知序列的侧翼序列是分子生物学相关研究工作中经常用到的技术。本文综述比较了常用的热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、反向PCR（IPCR）、接头介导的PCR（LM-PCR）等方法。评估了各自的优缺点，旨在为研究者选择合适的技术解决相关问题提供依据。 关键词侧翼序列；TAIL-PCR；反向PCR；接头介导PCR 侧翼序列是指染色体特定位点两侧的DNA序列。在现代分子生物学和微生物学研究领域，经常需要分离已知序列或位点的侧翼序列，对其进行分析或克隆，以研究基因的相关功能。因此，侧翼序列克隆技术的发展应用越来越受科学研究者的重视。目前，常用的分离侧翼序列的技术方法主要有：热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、反向PCR（IPCR）、接头介导的PCR（LM-PCR）等。本文重点介绍这三种PCR技术中具有代表性的方法，比较其各自的优缺点，分析其不同的适用范围，为研究者针对不同研究目的和需求选取不同方法提供参考。 1 热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR） 1991年Parker等提出目标步行PCR，1993年Sarkar等报道了限制位点PCR。这两种PCR 技术均是通过设计一批随机引物，在退火阶段，使它们与已知序列的特异性引物结合，继而进行PCR扩增。该方法由于操作复杂，在实际操作过程中使用很少。随后，在此基础上进行改进，产生了一些新的方法，如热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）。 热不对称交错PCR技术是一种快速准确定位已知序列附近未知DNA序列的方法。该技术的原理是依据已知序列设计3个具有高退火温度的嵌套特异性引物（special primer，简称 sp1， sp2， sp3），依据蛋白质保守氨基酸序列设计一系列退火温度较低的简并引物（Arbitrary degenerate prime，简称AD），以基因组为模板，通过控制复性温度调节特异性引物和简并引物与模板之间的复性，进行3轮热不对称分级反应的PCR扩增，从而得到已知序列的侧翼序列。 2014年，本实验室利用该技术分离了Pseudomonas donghuensis HYST铁载体合成与调控 相关基因[1]，目前仍在利用该技术分离P. donghuensis HYST对Caenorhabditis elegans的相关毒性基因。在实验过程中，为了提高分离效率，将原PCR方法进行改良，主要有：①调整退火温度。原TAIL-PCR方法中，高特异性退火温度为63℃，本研究中由于特异性引物的设计 模板与原方法不同，退火温度进行了相应调整，根据Primer 5.0设定并优化最终定在56℃～
第一节化学实验基本方法 一．化学实验安全 1．遵守实验室规则。 2. 了解安全措施。 （1）做有毒气体的实验时，应在通风厨中进行，并注意对尾气进行适当处理（吸收或点燃等）。进行易燃易爆气体的实验时应注意验纯，尾气应燃烧掉或作适当处理。（2）烫伤宜找医生处理。 （3）浓酸沾在皮肤上，用水冲净然后用稀NaHCO3溶液淋洗，然后请医生处理。 （4）浓碱撒在实验台上，先用稀醋酸中和，然后用水冲擦干净。浓碱沾在皮肤上，宜先用大量水冲洗，再涂上硼酸溶液。浓碱溅在眼中，用水洗净后再用硼酸溶液淋洗。（5）钠、磷等失火宜用沙土扑盖。 （6）酒精及其他易燃有机物小面积失火，应迅速用湿抹布扑盖。 3．掌握正确的操作方法。例如，掌握仪器和药品的使用、加热方法、气体收集方法等。二．混合物的分离和提纯 1．过滤和蒸发 实验1—1 粗盐的提纯
注意事项： （1）一贴，二低，三靠。 （2）蒸馏过程中用玻璃棒搅拌，防止液滴飞溅。 2.物质除杂与检验 1．原则：杂转纯、杂变沉、化为气、溶剂分。 2．注意：为了使杂质除尽，加入的试剂不能是“适量”，而应是“过量”；但过量的试剂必须在后续操作中便于除去。
②几种重要阳离子的检验 （l）H+能使紫色石蕊试液或橙色的甲基橙试液变为红色。 （2）K+用焰色反应来检验时，它的火焰呈浅紫色（通过钴玻片）。 （3）Ba2+能使用稀硫酸或可溶性硫酸盐溶液产生白色BaSO4沉淀，且沉淀不溶于稀硝酸。（4）Al3+能与适量的NaOH溶液反应生成白色Al(OH)3絮状沉淀，该沉淀能溶于盐酸或过量的NaOH溶液。 （5）Ag+能与稀盐酸或可溶性盐酸盐反应，生成白色AgCl沉淀，不溶于稀HNO3，但溶于氨水，生成［Ag(NH3)2］ （6）NH4+铵盐（或浓溶液）与NaOH浓溶液反应，并加热，放出使湿润的红色石蓝试纸变蓝的有刺激性气味NH3气体。 （7）Fe2+能与少量NaOH溶液反应，先生成白色Fe(OH)2沉淀，迅速变成灰绿色，最后变成红褐色Fe(OH)3沉淀。或向亚铁盐的溶液里加入KSCN溶液，不显红色，加入少量新制的氯水后，立即显红色。 （8）Fe3+能与KSCN溶液反应，变成血红色Fe(SCN)3溶液，能与NaOH溶液反应，生成红褐色Fe(OH)3沉淀。 （9）Cu2+蓝色水溶液（浓的CuCl2溶液显绿色），能与NaOH溶液反应，生成蓝色的Cu(OH)2沉淀，加热后可转变为黑色的CuO沉淀。含Cu2+溶液能与Fe、Zn片等反应，在金属片上有红色的铜生成。 ③几种重要的阴离子的检验 （1）OH－能使无色酚酞、紫色石蕊、橙色的甲基橙等指示剂分别变为红色、蓝色、黄色。（2）Cl－能与硝酸银反应，生成白色的AgCl沉淀，沉淀不溶于稀硝酸，能溶于氨水，生成[Ag(NH3)2]+。 （3）Br－能与硝酸银反应，生成淡黄色AgBr沉淀，不溶于稀硝酸。 （4）I－能与硝酸银反应，生成黄色AgI沉淀，不溶于稀硝酸；也能与氯水反应，生成
高中生物实验总结 1 实验设计的一般程序： 明确实验目的；分析实验原理；选择材料用具；设计实验步骤； 预测实验结果；观察收集数据；分析推理得出结论。 2 实验设计遵循的原则： ⑴单一变量原则 ①自变量与因变量 自变量是实验中由实验者操纵的因素或条件，而因变量是指由实验变量而引起的变化结果，二者之间是前因后果的关系。实验的目的就在于获得和解释前因与后果。 例：关于“唾液淀粉酶水解淀粉”的实验中，“低温(冰块)、适温(37℃)、高温(沸水)就是实验变量，而这些变量引起的实验变化结果就是反应变量。该实验旨在获得和解释温度变化(自变量)与酶的活性(因变量)的因果关系。 ②无关变量与额外变量 无关变量是指实验中除实验变量外的影响实验结果与现象的因素或条件。由无关变量引起的变化结果就叫额外变量。它们之间也是前因后果的关系。但它们的存在对实验与反应变量的获得起干扰作用。 例如：“唾液淀粉酶实验”中，除实验变量(温度)外，试管的洁净程度、唾液的新鲜程度、淀粉浓度、温度处理的时间长短等等就属于无关变量。实验变量，或称自变量，指实验假设中涉及的给定的研究因素。反应变量，或称因变量，指实验变量所引起产生的结果或结论。而其他对反应变量有影响的因素称之为无关变量，观察其对实验结果的影响。 强调：不论一个实验有几个实验变量，都应确定一个实验变量对应观测一个反应变量，这就是单一变量原则，它是处理实验中的复杂关系的准则之一。
⑵对照性原则对照实验是指除所控因素外其它条件与被对照实验完全相等的实验。 ①空白对照 空白对照是指不做任何实验处理的对象组。如，在“唾液淀粉酶催化淀粉”的实验中，实验组滴加了唾液淀粉酶液，而对照组只加了等量的蒸馏水，起空白对照。 ②条件对照 条件对照是指虽给对象施以某种实验处理,但这种处理作为对照意义的,或者说这种处理不是实验假设所给定的实验变量意义的，或不是所要研究的处理因素。即虽给对照组施以部分实验因素，但不是所研究的实验处理因素； 这种对照方法是指不论实验组还是对照组的对象都作不同条件的处理，目的是通过得出两种相对立的结论，以验证实验结论的正确性。 例,“动物激素饲喂小动物”实验,其实验设计方案是：甲组：饲喂甲状腺激素(实验组)；乙组：饲喂甲状腺抑制剂(条件对照组)；丙组：不饲喂药剂(空白对照组)。显然,乙组为条件对照。该实验既设置了条件对照,又设置了空白对照, 通过比较、对照,更能充分说明实验变量---甲状腺激素能促进蝌蚪的生长发育。 ③自身对照 自身对照是指实验与对照在同一对象上进行,即不另设对照。如“植物细胞质壁分离和复原”实验,则是典型的自身对照。自身对照,方法简便,关键是要看清楚实验处理前后现象变化的差异,实验处理前的对象状况为对照组,实验处理后的对象变化则为实验组。 ④相互对照 相互对照是指不另设对照组,而是几个实验组相互对比对照。如“植物激素与向光性向重力性实验”和“温度对唾液淀粉酶活性的影响的实验”中,所采用的都是相互对照,较好地平衡和抵消了无关变量的影响,使实验结果具有说服力。
基于PCR技术进行侧翼序列分离的方法比较 摘要利用PCR分离已知序列的侧翼序列是分子生物学相关研究工作中经常用到的技术。本文综述比较了常用的热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、反向PCR（IPCR）、接头介导的PCR（LM-PCR）等方法。评估了各自的优缺点，旨在为研究者选择合适的技术解决相关问题提供依据。 关键词侧翼序列；TAIL-PCR；反向PCR；接头介导PCR 侧翼序列是指染色体特定位点两侧的DNA序列。在现代分子生物学和微生物学研究领域，经常需要分离已知序列或位点的侧翼序列，对其进行分析或克隆，以研究基因的相关功能。因此，侧翼序列克隆技术的发展应用越来越受科学研究者的重视。目前，常用的分离侧翼序列的技术方法主要有：热不对称交错PCR （TAIL-PCR）、反向PCR（IPCR）、接头介导的PCR（LM-PCR）等。本文重点介绍这三种PCR技术中具有代表性的方法，比较其各自的优缺点，分析其不同的适用范围，为研究者针对不同研究目的和需求选取不同方法提供参考。 1 热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR） 1991年Parker等提出目标步行PCR，1993年Sarkar等报道了限制位点PCR。这两种PCR技术均是通过设计一批随机引物，在退火阶段，使它们与已知序列的特异性引物结合，继而进行PCR扩增。该方法由于操作复杂，在实际操作过程中使用很少。随后，在此基础上进行改进，产生了一些新的方法，如热不对称交错PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）。 热不对称交错PCR技术是一种快速准确定位已知序列附近未知DNA序列的方法。该技术的原理是依据已知序列设计3个具有高退火温度的嵌套特异性引物（special primer，简称sp1，sp2，sp3），依据蛋白质保守氨基酸序列设计一系列退火温度较低的简并引物（Arbitrary degenerate prime，简称AD），以基因组为模板，通过控制复性温度调节特异性引物和简并引物与模板之间的复性，进行3轮热不对称分级反应的PCR扩增，从而得到已知序列的侧翼序列。 2014年，本实验室利用该技术分离了Pseudomonas donghuensis HYST铁载体合成与调控相关基因[1]，目前仍在利用该技术分离P. donghuensis HYST对Caenorhabditis elegans的相关毒性基因。在实验过程中，为了提高分离效率，将原PCR方法进行改良，主要有：①调整退火温度。原TAIL-PCR方法中，高特异性退火温度为63℃，本研究中由于特异性引物的设计模板与原方法不同，退火温度进行了相应调整，根据Primer 5.0设定并优化最终定在56℃～58℃范围内。 ②提高循环次数。在实验过程中，为了大量积累目的片段，将原方法中超级循环次数进行相应增加，第一轮的12次超级循环提高至15次，第二轮的10次超级循环提高至12次。③提高模板浓度。原TAIL-PCR中利用前一轮产物的1000倍稀释物为模板进行后一轮PCR；本研究中则将前一轮产物的50倍稀释物作为模板，旨在提供高浓度的目的片段，有助于最后PCR产物回收时得到足够浓度的
[系统图示] [19个教材实验分类汇总]
第1讲扎牢实验基础——4大类教材实验汇总让你“以不变应万变” - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -考点一 显微观察类实验- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 一、抓牢主干知识——学什么 列表比较六个显微观察类实验(填表) 三、掌握方法技巧——怎么办 1．观察类实验操作流程 直接观察类应选有颜色的材料；染色观察类应选取无色的材料 ①滴水或染液→取材→盖片
②解离→漂洗→染色→制片(观察细胞分裂) ①先低倍镜观察，后高倍镜观察 ②观察质壁分离与复原：始终用低倍镜 依据原理和所观察到的现象，得出正确的结论 2．盐酸在实验中的应用 - 一、抓牢主干知识——学什么 1．列表比较五个鉴定类实验(填表) 2．熟记常用化学药品及作用(填表)
三、掌握方法技巧——怎么办 1．鉴定类实验的操作流程 | 应选取无色且富含被鉴定物质的材料 | 制备组织样液或制片 ? ? 根据实验原理和要求，准确添加所需的鉴定试剂 ? ? 对应实验目的进行准确描述，并做出肯定结论 2．关于颜色反应的实验归纳总结
。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -考点三模拟调查类实验- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- 一、抓牢主干知识——学什么 1．列表比较几种调查类实验(填表) 2．模拟尿糖检测实验的原理(填空) (1)葡萄糖试纸是一种酶试纸，由葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色的化合物固定于滤纸上制成的。 (2)当尿液滴加到酶试纸上时，尿液中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和氧，氧可以将滤纸上无色的化合物氧化成有色的化合物，使试纸呈现特定的颜色，再与标准比色卡相比对，即可知道尿液中葡萄糖的含量。 三、掌握方法技巧——怎么办 1．调查类实验一般操作流程
全基因组扩增——微量DNA分析的金钥匙 来源：青年人(https://www.doczj.com/doc/4e12657982.html,) 更新时间：2010/3/8 19:51:27 【字体：小大】 聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大地促进了法医学、古生物学、分子诊断学和分子病理学的发展。但即便是对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PC R反应。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增技术应运而生。 一、全基因组扩增的概念 全基因组扩增（whole genome amplification, WGA）是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。常用的方法有IRS-PCR（interspersed repeat sequence PCR）［1］、LA-PCR（linker ada ptor PCR）［2］、T-PCR（Tagged-PCR）［3］、DOP-PCR（degenerate oligonucleotide pr imed PCR）［4］、PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）［5］等。其中最具代表性方法是DOP-PCR和PEP-PCR。 DOP-PCR和PEP-PCR的基本原理都是通过其随机引物与基因组DNA多处退火从而使大部分基因组序列得到扩增。DOP-PCR的引物是由其3′和5′端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。其PCR程序是先在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度，进行几十个循环的严谨扩增。由于DOP-PCR的引物3′端设计的是在基因组中高频出现的序列，因此，在首轮的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大［4］。与DOP-PCR不同的是，PEP-PCR的引物是由15个随机核苷酸组成的完全随机引物。PCR由50个循环组成，每个循环的退火温度都是由37℃连续升温至55℃，从而确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，使整个基因组得到放大［5］。 二、全基因组扩增的质量控制 全基因组扩增的主要目的是在如实反映基因组原貌的基础上最大限度地增加DNA 量。因此，扩增效率和保真性是衡量全基因组扩增技术优劣的主要标准，此外，扩增片段的大小对于序列较长的基因片段分析来讲也是一个重要因素。 （一）扩增效率 DOP-PCR和PEP-PCR均能较大幅度地扩增模板DNA的量。据Cheung等［6］报道，DOP -PCR可将原模板扩大12至2万倍，而且，模板量越少，扩增倍数越高，这主要是由于
化学实验基本方法知识点总结 1.1. 化学实验基本方法 1.1.1 化学实验安全 A. 常见危险化学品 爆炸品:KClO3 KMnO4 KNO3 易燃气体:H2 CH4 CO 易燃液体:酒精乙醚苯汽油等自燃物品:白磷P4 遇湿易燃物品:Na Na2O2 氧化剂:KMnO4 KClO3 剧毒品:KCN 砷的化合物腐蚀品:浓H2SO4,浓NaOH,HNO3 1.1.2 混合物的分离和提纯 A.过滤和蒸发(例如:粗盐的提纯) 过滤时注意事项:一贴(滤纸与漏斗内壁紧贴) ,二低(滤纸边缘低于漏斗边缘;溶液边缘低于滤纸边缘),三靠(上面烧杯紧靠玻璃棒;玻璃棒靠在三层滤纸上;漏斗下端紧靠烧杯内壁) 蒸发操作步骤:1.放置酒精灯 2.固定铁圈位置 3.加上蒸发皿4.加热搅拌 5.停止加热,余热蒸干 检验硫酸和可溶性硫酸盐的方 法:Na2SO4+BaCl2=BaSO4↓+2NaCl 在滤液中加入NaOH的目的:除去粗盐中混有的Ca2+,Mg2+主要是除掉Mg2+ 除掉Mg2+化学方程式:MgCl2+2NaOH=Mg(OH)2↓+2NaCl 在滤液中加入Na2CO3的目的:除去粗盐中混有的Ca2+,Mg2+
主要是除掉Ca2+ 除掉Ca2+化学方程式:Na2CO3+CaCl2=CaCO3↓+2NaCl 检验SO42-离子为什么加盐酸酸化? 解答:溶液中的CO32-,SO32-等离子,与Ba2+反应生成BaCO3,BaSO3是不溶于水的白色沉淀.但它们溶于盐酸,而BaSO4不溶于盐酸中,加入盐酸可以消除CO32-,SO32-等离子的干扰.同时,溶液中的Ag+离子与Cl- 反应生成AgCl 也是不溶于酸的白色沉淀,加入盐酸可消除Ag+ 离子的干扰.另外,SO32-能被强氧化性的硝酸氧化成SO42-离子,所以先用硝酸酸化是不妥当的. 问题探讨:能否将NaCl 中含有的CaCl2,MgCl2,Na2SO4等一一除去?写出实验步骤和操作. 解答:实验步骤,试剂与反应如下: ① 加入过量BaCl2溶液,过滤(除去硫酸根离子.注意:引入新的杂质BaCl2) Na2SO4+BaCl2=BaSO4↓+2NaCl ② 向滤液中加入过量NaOH溶液,过滤(除去镁离子.但有引入一种新的杂质NaOH) MgCl2+2NaOH=Mg(OH)2↓+2NaCl ③ 向滤液中加入Na2CO3,过滤(除去钙离子和引入的新杂质钡离子.同时又引入新的杂质Na2CO3) ④ 向滤液中加入稍过量的盐酸(除去OH-和CO32-离子) ⑤ 蒸发结晶.
实验方法总结 1．模型方法。（必修一、P54） 模型是人们为了某种特定目的而对认识对象所作的一种简化的概括性的描述，这种描述可以是定性的，也可以是定量的；有的借助于具体的实物或其他形象化的手段，有的则通过抽象的形式来表达。模型包括物理模型、数学模型、概念模型等。 ⑴以事物或图画形式直观地表达认识对象的特征，这种模型就是物理模型，沃森和克里克制作的DNA双螺旋结构模型，就是物理模型。 ⑵数学模型是用来描述一个系统或它的性质的数学形式。如“J”型增长的数学模型：t 年后种群数量为Nt=N0t。（必修三、P65） 建立数学模型的步骤：①观察研究对象，提出问题。②提出合理的假设。③根据实验数据，用适当的数学形式对事物的性质进行表达。④通过进一步实验或观察等，对模型进行检验或修正。 2. 提出假说（必修一、P66） 提出假说：莫得成分和结构的初步阐明，最初都是先根据现象和有关知识，提出假说，而不是通过实验观察直接证实的。假说的提出要有实验和观察的依据，同事还需要严谨的推理和大胆的想象。假说需要通过观察和实验进一步验证和完善。 3. 控制变量（必修一、P79） 实验过程中可以变化的因素称为变量。其中认为改变的变量称为自变量；随着自变量的变化而变化的变量称做因变量。除自变量外，实验过程中可能还会存在一些可变因素，对实验结果造成影响，这些变量称为无关变量。 除了一个因素以外，其余因素都保持不变的实验叫做对照实验。上述实验中只有反应条件是改变的，其余因素（如反应物的性质和浓度）都没有变化。对照实验一般要设置对照组和实验组。在对照实验中，出来要观察的变量外，其他变量都应当始终保持相同。 4. 对比实验（必修一、P93） 设置两个或两个以上的实验组，通过对结果的比较分析，来探究某种因素与实验对象的关系，这样的实验叫做对比实验。对比试验也是科学探究中常用的方法之一。 5. 同位素标记法（必修一、P102） 同位素可用于追踪物质的运行和变化规律。用同位素标记的化合物，化学性质不会改变。科学家通过追踪同位素标记的化合物，可用弄清化学反应的详细过程。这种方法叫做同位素标记法。
一．原理 基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子) 或下游序列的方法。 其原理如下：首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性内切酶消化基因组 DNA，然后将预先设计好的 DNA 接头连接在 DNA 的两端, 这样的一组两端带有接头的 DNA 片段就称为所谓的无载体的 DNA 文库；根据接头和目的基因的序列设计两组引物，以上述的DNA为模板，先以外侧的一组引物进行第一轮 TD-PCR ( touchdownPCR ) 扩增，然后以内侧的一组引物进行巢式 TD-PCR 扩增，扩增产物即为所需的DNA片段。在接头中，由于2条链中较短的一链的3’末端被 2NH2 封闭，使得引物 AP1 在第一次 PCR 之前没有结合位点，在 PCR 的第一循环过程中只能从 GSP1 延伸，没有 AP1 的延伸产物。而GSP1 的延伸产物产生了 AP1 的结合位点，在第二循环就开始从两端进行延伸反应。这样，就减少了非特异性扩增，从而提高了 PCR 的特异性.基因组步行由 2 轮 TD-PCR 反应组成。在 TD-PCR 的初始循环中，所采用的退火和延伸温度比引物的 Tm 值略高，在这种情况下引物退火的效率会下降，但是特异性将增加；另外，在极少数情况下接头的 2NH2 也会延伸，补平接头，这样也产生了 AP1 的结合位点，从而增加了非特异性扩增，但在高温下，接头的自我退火比引物与接头退火的效率高，就提高了针对于 AP1 的 PCR 抑制效应，减少非特异性扩增。在随后的循环中，退火和延伸温度比 Tm 值略低，有利于特异性产物的指数增长。基因组步行技术主要应用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆，该技术也可用于确定内元/外元的连接以及从任何序列标签位点(Sequence2tagged site, STS) 或 EST 两端进行扩增获得相应的序列。尽管一次步行获得的片段长度短于 6 kb，但可通过多次反应获得更长的片段。该方法对于填补基因组中的一些间隙，特别是当这些缺失的克隆通过常规的筛选文库很难得到时非常有 一、高质量基因组DNA 的提取 1 材料 实验鱼，尾静脉取血100 μl(含抗凝剂) 2 试剂 QIAGEN Genomic 20/G；Tip Holders；Buffer C1；Buffer QBT；Buffer QF 抗凝剂 : 0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖 3. 方法 1）样品的处理和裂解 (1) 将100μl鱼血用PBS稀释至1ml (2) 加入1倍体积冰冷的Buffer C1，3倍体积（3ml）的ddH O 。 2 (3) 翻转数次至悬冷液成半透明 (4) 冰浴10min。 (5) 4℃，1300g离心15min，弃上清液。 (6) 加入250μl冰冷的Buffer C1，750μl冰冷的ddH2O。 (7) 轻弹，溶解沉淀。 (8) 4℃，1300g离心15min，弃上清液（如沉淀不是白色，重复洗涤步骤）。 (9) 加入1ml Buffer G2，最大速漩涡10-30s，充分重悬核酸沉淀物（时间要控
第一章从实验学化学 第一节化学实验基本方法 一、教材分析 1.教学内容分析 “化学实验基本方法”在强调化学实验安全性的基础上，通过“粗盐的提纯”实验，复习过滤和蒸发等操作。蒸馏则是在初中简易操作的基础上引入使用冷凝管这一较正规的操作。在复习拓宽的基础上又介绍一种新的分离和提纯方法——萃取。本节还结合实际操作引入物质检验的知识，这样由已知到未知，由简单到复杂，逐步深入。 2.教学重点的分析与确定： 化学是以实验为基础的科学，通过让学生讨论一些实验问题来初步体会化学研究的方法。初中化学已经介绍了药品的取用、物质的加热、仪器的洗涤、天平的使用等基本操作，也介绍了过滤、蒸发等分离操作。本节选择粗盐提纯这一涉及基本操作较多的典型实验，复习实验原理和步骤，使学生掌握溶解、过滤、蒸发、离子检验等基本操作。进而继续学习蒸馏和萃取等新的分离方法，使学生的实验技能进一步提高。基于以上观点： 教学重点：混合物的分离与离子的检验，分离与提纯过程的简单设计。 3.教学难点的分析与确定： 从三维目标的层面上来看，掌握化学实验方法是学习化学的重要途径。能根据物质的性质设计分离和提纯的方案，并在初步掌握溶解、过滤的基础上学习蒸馏、萃取的操作，可以由已知到未知，由简单到复杂，逐步深入，并可为选修课《实验化学》中相关知识的学习打下良好的基础。基于以上观点： 教学难点：物质检验试剂的选择，蒸馏、萃取的操作，分离与提纯过程的简单设计。 二、学生分析 1.学生有一定知识基础，学习较为主动，有学习动机和兴趣，能与教师和同学进行良好的交流与合作，能够达到预定的学习目标与要求，积极关注教师创设的问题情景，积极主动参与到学习活动中去，学生在学习活动中能提出有意义的问题或能发表个人见解，能按要求正确操作，能够倾听、协作、分享。 2.学生在初中的学习过程中已经接触到一些实验知识，本章第一节的内容是对初中已有的有关实验知识的拓宽和提升。初中学生实验过程中已经涉及一些实验安全问题、分离的方法。已经初步了解了粗盐提纯的方法，蒸馏的简易装置。在本章中要在初中学习的基础上巩固粗盐提纯的操作，掌握蒸馏的实验室正规的装置和规范的操作，学习新的分离提纯的方法——萃取，还要了解有关离子的验检。可以看到第一节中学生学习的重点是混合物的分离与离子的检验。在分离提纯的学习过程中纯盐提纯有关的操作学生比较熟悉，其学习的难度不大。但对于课本中提到的提纯后溶液依然存在的杂质如何设计简单的实验进行分离提纯，对
高中生物实验题的解题技巧 一纵观全题，审清题意 实验题的逻辑性是很强的，题目中的每一个条件，每一个步骤，都有着紧密的联系。所以，遇到实验题时，通读全题，仔细分析题目的每一个条件、问题，把握好题目前后的相关性，对题意有一个总体的了解，找出解题的方向。 二确定是探究性实验还是验证性实验 探究性实验中的结论是不确定的，有多种可能，而验证性实验是在已知实验结论的前提下，对其加以证实，即结论只有一个。在大多数情况下，出现“探究”一词的为探究性实验，出现“验证”一词的为验证性实验。但判断此类题目的依据不能只看是否有“探究”或“验证”这两个名词，应以题目的具体含义为准。 三认真分析实验用具及材料 认真分析实验用具及材料是解答实验题中的一个重要环节。 首先，实验用具及材料可以帮助你们准确地安排实验步骤。有些实验的操作方法可能有多种，而不同的方法需要不同的用具及材料。所以在选择实验方法时，应以题目给出的用具及材料为准。另外，题目给出的实验用具及材料，可能会依据实验的具体操作需要从中选择使用。但题目没有给出的用具和材料，在实验操作步骤中不能出现。 四遵守单一变量原则(和等量原则) 这是对照实验中的一个重要事项。实验组和对照组的处理，只
能有一项条件不同，其他条件要相同且适宜。 五时刻注意题目给出的条件 题目给出的条件是解答实验题的重要依据，所以一定要把握好。在解答每一个小题时都应该谨慎小心，防止漏用、误用每一个条件。尤其是实验题的条件都比较长，可能有的同学在做到最后几个小题时把前面给出的条件忘记了，所以，此时重读题干，就很有必要了。 六实验步骤中的常用词语 在书写实验步骤时，一定要注意一些常用词语的使用。如分组实验时要编号，加试剂时要注意用到“相同”“等量”“平均”等，这样能保证实验步骤的严密性。 七实验步骤中的最后一步 如果所用的实验材料为有生命的物质，在完成实验装置的操作后，最后一步可以这样解答，“放在适宜的条件下，培养一段时间，观察记入……”这一句话的使用频率是相当高的。当然，还要根据具体的情况稍作变动。 八注意实验结果及实验结论的合理性 实验结果也就是一种实验现象，而实验结论是根据实验结果推出来的，二者不可混淆。做题时，一定要看清题目的要求，问得是实验结果还是实验结论，二者要分开来答.验证性实验的结论只有一个，而探究性的实验需要讨论，但并不是把所有的可能结论全部答出来，还要注意其合理性。 观察类实验
全基因组扩增(whole gemome amplification，WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增 的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。其基本原理为：采用 的多重置换扩增（MDA）技术，能对基因组DNA进行稳定的扩增。利用随机六碱基引物在多 个位点与模板DNA退火，接下来在高扩增效率和保真性的Phi29 DNA聚合酶在DNA的多个位 点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为 新的模板来进行扩增，因此最终我们可以获得大量高分子量的DNA。 全基因扩增中使用独特的Phi 29 DNA聚合酶，该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的高保真性。目前市场上普遍采用Qiagen公司的Repli-g Mini Kit 系列全基因组试剂盒。本试剂盒的开发对国内用于全基因扩增领域有着广泛的应用前景。 可以从少量样本中稳定扩增全基因组DNA。该试剂盒的开发过程包括分离和扩增DNA的试剂，适用的样本广泛，包括已纯化的基因组DNA、全血、组织培养细胞、显微切割得到的细胞、速冻的组织切片、血浆血清中的细胞、口腔细胞、血斑。具有以下特点： 1.产物应用途径广阔 PCR（包括多重PCR、长片段PCR以及定量PCR）、克隆、文库构建、单倍型确定、测序、基 因芯片、遗传分析（片段差异、微卫星差异、单碱基差异、SNP、STR等）。 2、高产量 10ng基因组DNA经扩增后可产生〉15ug（20ul反应体系）的DNA反应产物，扩增倍数可达上 万倍。 3、扩增产物长度以及覆盖率有保证 这是我们公司全基因组扩增技术（多重置换扩增技术），这不是一个PCR过程。目前这个 技术比较流行，之前的技术已经有些过时。我们试剂盒里的BUFFER已经包含了引物，客 户无需另外购买。
一、初中化学实验常用仪器和药品的取用规则 （一）初中化学实验常用仪器 1、试管 （1）用途： a、在常温或加热时,用作少量试剂的反应容器 b、溶解少量固体 c、收集少量气体 （2）注意事项： a、加热时外壁必须干燥,不能骤热骤冷,一般要先均匀受热,然后才能集中受热,防止试管受热不均而破裂. b、加热时,试管要先用铁夹夹持固定在铁架台上（短时间加热也可用试管夹夹持）. c、加热固体时,试管口要略向下倾斜,且未冷前试管不能直立,避免管口冷凝水倒流使试管炸裂. d、加热液体时,盛液量一般不超过试管容积的1/3（防止液体受热沸腾溢出）,使试管与桌面约成45°的角度（增大受热面积,防止暴沸）,管口不能对着自己或别人（防止液体喷出伤人）. 2、试管夹 （1）用途：夹持试管 （2）注意事项：①从底部往上套,夹在距管口1/3处（防止杂质落入试管） ②不要把拇指按在试管夹短柄上. 3、玻璃棒 （1）用途：搅拌、引流（过滤或转移液体）. （2）注意事项：①搅拌不要碰撞容器壁②用后及时擦洗干净 4、酒精灯 （1）用途：化学实验室常用的加热仪器 （2）注意事项： ①使用时先将灯放稳,灯帽取下直立在灯的右侧,以防止滚动和便于取用. ②使用前检查并调整灯芯（保证更好地燃烧,火焰保持较高的的温度）. ③灯体的酒精不可超过灯容积的2/3,也不应少于1/3（酒精过多,在加热或移动时易溢出；酒精太少,容器酒精蒸气混入空气易引起爆炸）. ④禁止向燃着的酒精灯添加酒精（防止酒精洒出引起火灾） ⑤禁止用燃着的酒精灯直接点燃另一酒精灯,应用火柴从侧面点燃酒精灯（防止酒精洒出引起火灾）. ⑥应用外焰加热（外焰温度最高）. ⑦用完酒精灯后,必须用灯帽盖灭,不可用嘴吹熄.（防止将火焰沿着灯颈吹入灯） ⑧用完后,立即盖上灯帽（防止酒精挥发使灯芯水含量相对变多而不易点燃）. ⑨不要碰倒酒精灯,若有酒精洒到桌面并燃烧起来,应立即用湿抹布扑盖或撒沙土扑灭火焰,不能用水冲,以免火势蔓延. 5、胶头滴管、滴瓶 （1）用途：①胶头滴管用于吸取和滴加少量液体.②滴瓶用于盛放少量液体药品. （2）注意事项： ①先排空再吸液； ②悬空垂直放在试管口上方,以免污染滴管； ③吸取液体后,应保持胶头在上,不能胶头在下或平放；（防止液体被沾污,或腐蚀胶头）
高中生物实验设计专题 一、高考生物实验考试大纲 （1）能独立完成所列生物实验，包括理解实验目的、原理、方法和操作步骤，掌握相关的操作技能，并能将这些实验涉及的方法和技能进行综合运用。 （2）具备验证简单生物学事实的能力，并对实验现象和结果进行解释、分析和处理。 （3）具备对一些生物学问题进行初步探究的能力，包括运用观察、实验与调查、假说演绎、建立模型与系统分析等科学研究方法。 （4）能对一些简单的实验方案做出恰当的评价和修订。 二、生物实验设计的科学性分析 实验能力是“教案大纲”要求学生掌握的一项基本能力。就是能使用恰当的方法验证简单的生物学事实，并对结果进行解释和分析。此能力要求包括两方面的内容：一是能够设计简单的实验，验证简单的生物学事实；二是能对实验现象、实验结果作出正确的解释和分析。 实验能力也是高考“考试说明”要求学生掌握的一项基本能力（设计和完成实验的能力）。此能力要求也包括两方面的内容：一是独立实验的能力（大纲规定学生实验和教师演示实验），即理解实验原理、目的、要求、材料、用具；掌握实验的步骤、控制实验条件、使用有关仪器、安全问题处理；观察现象、分析数据、得出结论；常规实验非常规做法。二是能根据要求灵活运用已学过的自然科学理论、实验方法和仪器，设计简单的实验方案并处理相关的实验问题。用理、化、生三科实验中所学的知识去解决实际问题。实验所占比分为30%（基本不变，也可能在25%左右）。 实验设计是较高的能力要求，除要具备一定的知识基础外，还需要具有一定的创造能力。所设计的实验是建立在科学的基础上的，还应具有一定的观察和发现问题的能力。要提高这方面的能力，必须改变过去“背实验”的方法，亲自动手做实验，熟悉实验的操作步骤，弄清实验的原理，能运用所学知识对实验现象进行分析，以此来验证或探究某一结论。只有这样，才能促进实验能力的提高，促进科学思维的形成和发展，才能真正对实验的知识、内容进行举一反三。 1．实验设计的基本内容 1.1 实验名称是关于一个什么内容的实验。 1.2 实验目的要探究或者验证的某一事实。 1.3 实验原理进行实验依据的科学道理。 1.4 实验对象进行实验的主要对象。 1.5 实验条件根据实验原理确定仪器和设备；要细心思考实验的全过程。 1.6 实验方法与步骤实验采用的方法及必需（最佳）操作程序。每一步骤都必须是科学的；能急时对仪器、步骤进行有效矫正。 1.7 实验测量与记录对实验过程及结果应有科学的测量手段与准确客观的记录。 1.8 实验结果预测及分析能够预测可能出现的实验结果并分析导致的原因。 1.9 实验结论对实验结果进行准确的描述并给出一个科学的结论。 2．实验设计的基本原则 2.1 科学性原则 所谓科学性，是指实验目的要明确，实验原理要正确，实验材料和实验手段的选择要恰当，整个设计思路和实验方法的确定都不能偏离生物学基本知识和基本原理以及其他学科领域的基
1. 基因家族（Gene family） 又叫多基因家族（Multigene family），系指同一生物体中，从同一祖先基因经过复制、突变而来的一组具有相似的核苷酸序列结构、相似产物、相似功能的基因群体。从广义上讲，同一基因家族的各个成员也可看作是重复基因。但两者相比，基因家族不同成员之间的序列差异毕竟要比重复序列的大一些，也就是说序列一致性程度还是较低一些。 2. 基因簇（Gene cluster） 系指原核生物基因组中，由不同的或相关的一组相邻基因组成的一种特殊的排列组合方式。 3.基因家族与基因簇二者的区别 属于同一多基因家族的各个成员，可以存在于不同的染色体上，也可以是存在于同一条染色体上。同一基因家族成员的判断标准：a．多重性；b．紧密的连锁性；c. 核苷酸序列同源性； d. 相关的表型与功能。 基因簇的特点： a．同一基因簇的不同成员，在遗传上往往是紧密连锁的； b．同一基因簇的不同成员，可以是同属于同一个操纵子的不同结构基因，也可以是属于不同操纵子的不同结构基因。 c．同一基因簇的不同成员，可以是来自同一基因家族的不同成员，也可以是来自不同基因家族的不同成员。 4. 基因图（Gene map）：是描述染色体或DNA大分子上，不同基因的排列顺序及其间隔距离的一种线性图。 5. 基因作图（Gene mapping）：按照遗传学的方法或者是物理学的方法绘制基因图的过程，叫做基因作图。基因作图有时也叫做基因定位。它涉及如下两个具体的内容： a.其一是确定被研究的目的基因与细胞染色体之间的关系，也就是说将目的基因定位在某条特定的染色体分子上。 b.其二是测定目的基因与所在染色体的其它基因之间的间隔距离，以及它们之间的线性排列顺序，亦即是确定目的基因在染色体上的位置。 基因图包括遗传图和物理图两种。两者之间的本质差别在于前者表示的是以重组率为单位的基因间的相对距离，而后者表示的是以碱基对（bp）为单位的基因间的实际距离。 6.基因增加(Gene addition)：与基因扩增概念不同，它是通过将一种或一群外源基因导入受体细胞，从而使受体细胞中基因种类增加，用以观察并研究其功能作用的一种基因工程策略。 7.基因扩增(Gene amplification):特指基因拷贝数增加的过程，包括如下5种不同情况： ①在体外，应用PCR技术和适当的引物，可使特定基因的拷贝数得到成功的扩增。②克隆，将基因插入到高拷贝数的质粒分子上，于是在体内情况下该基因的拷贝数也变的相应富裕起来。 ③一些外界环境的压力因素可以使真核细胞产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因发生明显扩增。例如，高剂量的氨甲喋呤可导致二氨叶酸还原酶基因发生扩增。④程序基因扩增。包括全基因组扩增和选择性扩增两种模式。前者是指通过增加细胞基因组的拷贝数，而使特定基因的拷贝数得以增加；后者是指因特定发育需要而偶尔增加对其产物需求量高的基因的拷贝数。例如，非洲爪蟾在发育过程中rRNA基因的扩增。⑤进化扩增，在生物进化过程中发生基因加倍和扩增，结果使相关的基因在基因组上聚集成簇。
第一章从实验学化学 课程标准： 本章为高中必修模块的开篇第一章，从实验入手，重点介绍了化学实验的基本方法，包括化学实验应注意的安全事项、混合物的分离和提纯、物质的检验等，让学生知道化学是一门以实验为基础的自然科学。 另外，在做化学实验时，取用的药品都是可以称量的，但分子、原子、离子等肉眼看不见的粒子是难以称量的，为此，引入“物质的量”这一基本物理量，可将一定数目的原子、离子或分子与可称量物质联系起来。 物质的量表示含有一定数目粒子的集体，是七个基本物理量之一，单位是摩尔。物质的量及其由此导出的其它物理量如摩尔质量、气体摩尔体积、物质的量浓度等是中学化学的计算核心，也是进行定量实验的计算依据。 第一节化学实验基本方法 (第1课时) ; 教学目标： 1．树立安全意识，初步养成良好的实验习惯，并能识别一些化学品安全标识 2．通过识别一些化学品安全标识，提高学生的学习兴趣 3．使学生树立严谨的科学探究习惯 教学重点、难点 重点：树立实验安全意识，能识别一些化学品安全标识。 教学环节 & 教师活动学生活动 新课导入（ 在日常生活中，有关伤害的事件 非常多，你知道哪些哪些与化学 有关请你说出来与同学们共同 交流，并加以预防。 学生思考、讨论。 有一个学生回答，其他同学补充。 对化学实验，尤其要注意实验安 全，在初中化学学习中，你学习 了哪些实验安全问题对你有什 么启示 教师应及时肯定学生的成绩，以 激励学生的学习兴趣。 学生回顾、讨论交流，让一个学生 回答，其他同学补充。
\ 新 知 ~ 学习 \ 新~ 知学 习~ 投影 有关一些典型的伤害实例和违 规实验操作所发生的伤害。 通过血的事实，告诉学生实验安 全的重要性。 学生观看，感受颇深。 归纳整理 % 化学实验中应注意的安全问题 学生总结，交流，相互补充。 ? 思考交流 : 思考交流 要做到实验安全，你认为应注意 哪些问题 学生思考、交流、整理，相互补充， 达成共识。 " 偶发事件的处理 练一练1．进行化学实验必须注意 实验安全。下列说法正确的是 （） ? A．不慎将酸溅到眼中，应立即水 洗，边洗边眨眼睛 B．不慎将浓碱溶液沾到皮肤上， 要立即用大量水冲洗，然后涂 上硼酸溶液 C．不慎将酒精洒到桌面上着火时， 可用水将其扑灭 D．配制硫酸溶液时，可先在量筒 中加入一定体积的水，再在搅拌下 慢慢加入浓硫酸 对于危险品，都有特殊的标志， 你知道哪些请说出来与同学们 共享。对你有什么启示 学生回答，相互补充，达成共识。 … 板书 第一章从实验学化学 < 第一节化学实验基本方法 一、化学实验安全 1．实验安全应注意的问题 ⑴遵守实验室规则 ⑵了解安全措施 ⑶掌握正确的操作方法 2．常用危险化学品的标志 $ 巩固练习 1．下列做法正确的是（）A．用手接触药品