非全日制硕士专业学位论文
环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157︰H7的研究
学位申请人：刘道亮
指导教师：张伟
校外导师：赵占民
学位名称：农业推广硕士
研究领域：食品加工与安全
授予单位：河北农业大学
答辩日期：二〇一二年十一月二十二日
分类号：单位代码：
密级：学号：
非全日制硕士专业学位论文
环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157︰H7的研究
Rapid Detection of Escherichia Coli O157:H7 in Meat Using an Improved Loop-mediated Isothermal Amplification Technology
学位申请人：刘道亮
指导教师：张伟
校外导师：赵占民
学位名称：农业推广硕士
研究领域：食品加工与安全
授予单位：河北农业大学
答辩日期：二〇一二年十一月二十二日
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
学位论文作者签名：签字日期：年月日
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学位论文作者签名：导师签名：
签字日期：年月日签字日期：年月日
摘要
国内外检测E.coli O157:H7的方法很多，我国进出口食品对E.coli O157:H7目前采用的方法是以行业标准SNT0973-2010作为依据。通过对样品增菌处理后，进行平板划线，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行判定。检测过程耗时长达4～7天，难以适应快速检验的要求。本研究针对 E.coli O157:H7, GenBank: S83460.1 编码O157 抗原的rfbE 基因序列和GenBank: AF228487.1编码鞭毛H7特异性抗原的fliC基因序列，运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物。对反应时间、反应温度、镁离子浓度等扩增条件进行了优化。确定25 μL的LAMP反应体系是：内引物（FIP 和BIP）各1.6 μm，外引物（F3和B3）各0.2 μm，环引物（LF 和LB）各0.8 μm ，2.5 mmol/L dNTP，4 mmol/L MgSO4，10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，8 U的Bst DNA聚合酶大片段，3 μLDNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。确定LAMP反应过程是首先在63℃水浴锅中反应20 min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴10 min终止反应，通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀。此外，取扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，以证实是否发生了LAMP反应。改良LAMP检测E. coli O157:H7的纯培养物的灵敏度达到1.4 CFU /mL。和人工污染检出限达到1.8 CFU/g。
比较了6种模板制备方法对LAMP检测肉及肉制品中E. coli O157:H7的影响。研究表明LAMP方法对制备模板DNA的要求不高。采用热裂解法提取DNA，不仅提取时间将大大减少，而且也将大大降低检测成本。对187份实际样品同时进行改良LAMP 检测和依据SNT0973-2010进行常规检测，结果证明，两种方法符合率达到99.47%。
研究表明LAMP快速检测E.coli O157:H7方法，其灵敏度高，特异性好，简便，快速，解决了传统检测方法耗时长、灵敏度低，血清凝集有交叉反应等问题，对于及时有效应对食源性突发公共卫生事件具有重大意义。
关键词：环介导等温扩增；LAMP；检测；大肠杆菌O157:H7；肉类
Rapid Detection of Escherichia Coli O157:H7 in Meat Using an Improved
Loop-mediated Isothermal Amplification Technology
Author: Liu Daoliang
Supervisor: Zhang Wei
Major: Food process and security
Abstract
Domestic and international testing of E.coli O157: H7 many ways, China's import and export food of E.coli O157: H7 is currently the method used is based on industry standards SNT0973-2010 as the basis. Flat crossed by sample enrichment process, then suspected colonies were picked for morphological, staining and serological tests, biochemical identification judging. The detection process takes up to 4 to 7 days, it is difficult to adapt to the rapid inspection requirements. We used E.coli O157: H7, GenBank: S83460.1 coding the O157 antigen rfbE gene sequences and GenBank: AF228487.1 encoding flagellar H7 fliC gene sequence-specific antigen, as target sequences and used Primer Explorer software, version 3(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html), to design LAMP primers. The reaction conditions were optimized including temperature, time and Mg2+ concentration etc. The LAMP mixture was made in 25 μl of reaction mixture containing a 1.6 μM concentration of each inner primer (FIP and BIP), a 0.2 μM concentration of each outer primer (F3 and B3), a 0.8 μM concentration of the loop primer(LF and LB), 2.5 mM each deoxynucleoside triphosphate, 4 mM MgSO4, 10×Bst DNA polymerase reaction buffer, 8U of the Bst DNA polymerase large fragment, 3 μl isolated DNA templates and sterilized double-distilled water. The mixture was incubated at 63℃ for 20 min and then heated to 80℃for 10 min to terminate the reaction. White pyrophosphate magnesium precipitation can be observed by the naked eye. After that, we confirmed whether or not the LAMP reaction conducted using electrophoresis. The sensitivity of the improved LAMP was 1.4 CFU/mL and the detection limit of artificially contaminated meat was 1.8 CFU/g.
The effect of six methods of extracting DNA from E. coli O157: H7 were compared. E. coli O157: H7 DNA was extracted using heat Cracking, not only time will be greatly reduced, but will also greatly reduce testing costs.The result indicates: The improved LAMP can obtain compliance rate of 99.47% with the industry standard SNT0973-2010.
Studies have shown that LAMP rapid detection of E.coli O157: H7 method, its high sensitivity, specificity, simple, rapid, to solve traditional detection methods and time-consuming, low sensitivity, the serum agglutination cross reaction.The great significance for the timelyeffective response to public health emergencies foodborne. Key words: loop-mediated isothermal amplification; LAMP; detection; Escherichia coli O157:H7; Meat
目录
1 引言 (1)
1.1 立题背景及意义 (1)
1.2大肠杆菌O157:H7简介 (2)
1.2.1 大肠杆菌O157:H7生物学性状 (2)
1.2.2 大肠杆菌O157:H7的流行病学 (2)
1.3 大肠杆菌O157：H7检测方法 (2)
1.3.1 传统分离鉴定方法 (3)
1.3.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR） (3)
1.4 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法 (3)
1.4.1 LAMP方法的概述 (3)
1.4.2 LAMP方法的特点 (4)
1.4.3 LAMP反应产物的检测方法 (5)
1.4.4 LAMP方法的应用 (6)
1.5 研究内容 (8)
2 材料与方法 (10)
2.1 试验材料 (10)
2.1.1 试验菌株 (10)
2.1.2 仪器与设备 (10)
2.1.3 主要培养基 (10)
2.1.4 样品与生化试剂 (11)
2.2 试验方法 (11)
2.2.1 大肠杆菌O157:H7培养 (12)
2.2.2 大肠杆菌O157:H7基因组DNA的提取 (12)
2.3引物设计、体系和操作程序 (12)
2.3.1 LAMP引物设计 (12)
2.3.2改良LAMP反应体系 (13)
2.3.3 LAMP操作程序 (13)
2.4 LAMP产物的检测 (14)
2.4.1 LAMP产物的可视结果 (14)
2.4.2凝胶成像方法检测LAMP产物 (14)
2.5 LAMP检测条件优化 (14)
2.5.1 适宜Mg2+浓度选择 (14)
2.5.2 dNTP浓度的优化 (14)
2.5.3反应温度的优化 (14)
2.5.4引物对LAMP反应的影响 (14)
2.5.5反应时间的优化 (15)
2.5.6 BST酶的优化 (15)
2.6 引物特异性的检测 (15)
2.7 E.coli O157:H7的灵敏度检测 (15)
2.7.1 LAMP检测E.coli O157:H7纯培养的灵敏度 (15)
2.8 E.coli O157:H7基因组DNA提取方法比较 (15)
2.8.1 试剂盒法 (15)
2.8.2 溶剂提取热裂解法 (16)
2.8.3 普通热裂解法： (16)
2.8.4 蛋白酶K法： (16)
2.8.5 FDA提取DNA法： (17)
2.8.6 饱和酚提取法： (17)
2.9检测人工污染样品的检出限 (17)
2.10 实际样品(肉类样品)检测 (17)
3 结果与分析 (18)
3.1 LAMP扩增结果 (18)
3.1.1 LAMP扩增的可视结果 (18)
3.1.2 LAMP扩增的凝胶成像结果 (18)
3.2 LAMP反应条件优化结果 (19)
3.2.1 Mg2+浓度的优化 (19)
3.2.2 dNTP浓度的优化 (19)
3.2.3 反应温度的优化 (20)
3.2.5反应时间的优化 (23)
3.2.6 BST酶的优化 (24)
3.3大肠杆菌O157:H7DNA提取方法比较 (25)
3.4引物特异性的研究 (25)
3.5 改良LAMP检测E. coli O157:H7的纯培养物的灵敏度 (27)
3.6人工污染样品的检出限 (27)
3.7 肉类样品检测 (28)
4讨论 (29)
4.1 环介导等温扩增(LAMP)方法评价 (29)
4.2 环介导等温扩增(LAMP)引物的确定 (29)
4.3 LAMP检测方法与其它检测方法的比较 (30)
5 结论 (31)
参考文献 (32)
作者简介 (37)
致谢 (38)
环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157︰H7的研究
1 引言
1.1 立题背景及意义
随着人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，已然成为一个重大的世界性公共问题。2000年，世界卫生大会通过了《食品安全决议》,制定了全球食品安全战略，将食品安全列为公共卫生的优先领域。有资料显示，病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一[1]。
大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是一类能引起严重食物中毒的致泻性大肠杆菌，是出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli ,EHEC)的主要血清型[2]，感染剂量极低，在食入不足5个细菌就可引起疾病[3]。大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）在1982年才被证实为致病菌[4]，它除了引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症(Hemo-lyticuremic syndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(Thrombocytopenic purpura，TTP)等严重的并发症[5]，且后者病情发展快，死亡率高，给人民健康和社会造成严重危害，自1982年美国首次被报告后，我国1986年已发现O157 ∶H7感染病人,并在安徽、江苏等地爆发了该菌引起的食物中毒[ 6 ]。1999年和2001年先后在浙江省杭州和宁波地区从肠道门诊腹泻患者粪便中分离到O157 ∶H7菌株[7、8]。大肠杆菌O157:H7已经在世界范围内得到普遍关注[9]。因此，建立快速、特异和敏感的检测方法成为及时有效地采取预防和治疗措施的迫切需要。但目前传统方法操作繁琐，检测时间长，且灵敏度较低。分子检测方法，如PCR，技术含量比较高，对操作、设备条件、工作环境均有较高的要求，仍不能进行广泛的普及和推广。
国内外检测E.coli O157:H7的方法很多，我国进出口食品对E.coli O157:H7目前采用的方法是以行业标准SNT0973-2010作为依据[10]。通过对样品增菌处理后，进行平板划线，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行判定。检测过程耗时长达4～7天，难以适应快速检验的要求。随着分子生物学技术的发展和应用，PCR等核酸扩增技术以其快速灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的检测方法，而且使以往无法完成的检测成为了可能。针对一些检测特异性病原体的方法，试剂盒已经被开发，并取代了病原体体外培养等传统的微生物检测方法。然而应用于常规检测，PCR技术始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核酸扩增技术无法更加广泛地推广和应用。研究开发灵敏、特异、快速、简便、廉价的核酸扩增技术，尤为重要。
近年来，随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增为基础的检测技术得到了迅猛发展。多种机制的等温技术不仅诞生了，而且有些已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学、食品检测等领域广泛运用。特别是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，由于核酸等温扩增技术不需要温度变化的过程，且摆脱了对精良仪器设备的依赖。
本研究针对E.coli O157:H7的0157特异性抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7特异性抗原基因(fliC基因)设计引物, 单管同时检测，建立了肉类中的E.coli O157:H7改良LAMP快速检测方法，
1
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其灵敏度高，特异性好，简便，快速，解决了传统检测方法耗时长、灵敏度低，血清凝集有交叉反应等问题[11]，对于及时有效应对食源性突发公共卫生事件具有重大意义。
1.2大肠杆菌O157:H7简介
1.2.1 大肠杆菌O157:H7生物学性状
大肠杆菌O157:H7为革兰氏阴性杆菌，在SMAC分离平板上菌落形态呈淡褐色中心，扁平透明、边缘光滑、直径约2mm，在科玛嘉显色平板呈紫色圆形光滑菌落。
大肠杆菌O157:H7的生化特性见表1
表1 大肠杆菌O157:H7生理生化特性
Table 1 Characteristic of E.coli O157:H7
性状结果性状结果性状结果革兰氏染色－氧化酶－三糖铁硫化氢- 三糖铁斜面+ 三糖铁底层+ 三糖铁产气+ 半固体动力试验＋吲哚+ MR + VP - 赖氨酸脱羧酸+ 鸟酸氨脱羧酶＋西蒙氏枸橼酸盐- 纤维二糖产酸- 棉籽糖+
1.2.2 大肠杆菌O157:H7的流行病学
大肠埃希氏菌( E. coli) 通常称为大肠杆菌,根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5 类: 致病性大肠杆菌( EPEC) 、肠产毒性大肠杆菌( ETEC) 、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC) 、肠出血性大肠杆菌( EHEC) 、肠黏附性大肠杆菌(EAEC) 。大肠杆菌O157 :H7 是出血性大肠杆菌主要血清型，大肠杆菌O157:H7是近年来引发食物中毒事件的重要病原。致病力很强，最低的感染剂量可少于10 CFU[12]，且食品中E. coli O157:H7 的污染量一般也很低[13]，主要通过食和饮水传播，大肠杆菌O157：H7感染性腹泻，成为世界范围内重要的公共卫生问题。
大肠杆菌O157:H7能产生2 种强有力的细胞毒素：志贺菌样毒素Stx1 和/ 或Stx2 。由于毒素能使Vero 细胞变性、溶解和坏死，故又称Vero毒素[14 ]。这些毒素具有与志贺菌毒素相似的细胞毒性、肠毒性和致死性。其主要作用部位是右半结肠,在盲肠、阑尾和升结肠引起粘膜的充血、水肿和细胞的变性坏死,甚至血性腹泻。Stx 毒素还可以引起毒血症，导致血栓形成、血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura ,TTP) 和溶血性尿毒症综合征(haemolytic uraemic syndrome，HUS)，严重者可以导致死亡。
1.3 大肠杆菌O157：H7检测方法
目前检测大肠杆菌O157:H7 的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子水平的检测。传统2
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分离培养方面, 现有的培养基如山梨醇-麦康凯琼脂已不能很好地满足大肠杆菌O157:H7 的分离；显色培养基的特异性也还需提高；生化鉴定检验时间较长, 且灵敏度较低。免疫学方法如酶联免疫吸附法、乳胶凝集试验等, 虽然可以缩短检测时间, 但会与大肠杆菌的多种血清型出现交叉反应。而在分子水平方面, 如PCR 方法则可以快速、灵敏地检测大肠杆菌O157:H7。
1.3.1 传统分离鉴定方法
国内外检测E.coli O157:H7的方法很多，我国进出口食品对E.coli O157:H7目前采用的方法是以行业标准SNT0973-2010作为依据。通过对样品增菌处理后，进行平板划线，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行判定。
大肠杆菌的抗原较复杂，与其他肠杆菌科的细菌密切相关。其完整的血清型包括菌体抗原(0抗原)、荚膜抗原(K抗原)、鞭毛抗原(H抗原)和菌毛抗原(F抗原)。O抗原是大肠杆菌分群鉴定的基础，有160余种，为脂多糖(LPS)，组成细胞壁耐热成分[15]。有些血清型还与细菌特殊毒力有关。肠杆菌科所包括的各属细菌均有特异0抗原，大肠杆菌的0抗原与沙门氏菌属、普鲁威登氏菌属或克雷伯氏菌属在血清学检测中可呈交叉反应。多数痢疾杆菌的抗原与某些大肠杆菌的O抗原有关，甚至完全相同，因此单靠血清学鉴定是无法区分所有肠道致病菌的。随着分子生物学的发展，对抗原形成基因的深入研究逐步揭示了0抗原的本质。O抗原特异的基因有编码0链聚合酶的Wzy基因、编码0链合成酶的帕基因、O链长度决定基因IVzz等，不同细菌的不同O链具有严格的特异性，检测特异基因即可明确0抗原的种类[16]。rfbE基因是合成0157菌体抗原的特异酶基因，检测rfbE基因即可检测0157菌体抗原。大肠杆菌0157：H7是肠出血性大肠埃希菌的一种主要血清型，在生化试验确定为大肠埃希菌后，其血清型的鉴定主要依靠血清凝集试验对菌体抗原和鞭毛抗原分型。由于外环境中存有大量菌体抗原0157和鞭毛抗原非H7的大肠埃希菌[17]，而且这些菌株的致病性与H7血清型菌株有很大差别，因此，H7鞭毛抗原的检测对于疑似菌株的鉴定十分重要。
1.3.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）
PCR技术的发展为快速检出大肠杆菌O157：H7提供了手段。GANNON(1992) [18]、徐建国(1995) [19]、周志江(1999) [20]等对用PCR检测大肠杆菌O157：H7进行了初步研究。由于所检测的基因不是大肠杆菌O157：H7所特异的，其实际应用受到限制。BILGE(1996)[21]、LEIWANG(1998)[22]、TARR(2000)[23]等发现大肠杆菌O157：H7的特异基因rfbE基因，为用PCR 快速、准确的检测大肠杆菌O157：H7提供了可能。
1.4 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法
1.4.1 LAMP方法的概述
3
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4 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification ，LAMP），2000年日本荣研化学
株式会的Notomi T等开发了一种新的核酸扩增方法。LAMP法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶（BstDNApolymerase）在恒温条件（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点，可以在1小时之内，将靶DNA片段扩增109～1010。在DNA延伸合成时，从脱氧核酸三磷酸基质（dNTPs）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生一种焦磷酸镁的衍生物，而高效扩增的LAMP法生成大量这样的衍生物，并呈现白色沉淀。可以把浑浊度作为鉴定指标，只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否[24,25]。因为LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，所以利于在一些基层机构的应用，有着极为广泛的应用前景[26,27,28]。
1.4.2 LAMP方法的特点
（一）LAMP方法具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点
1.只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性[29]。
2.特异性强[30]。应用六个区段，四条引物，并且这六个区段的顺序也有规定。原理上LAMP 法扩增的特异性很高，因此可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，即能够进行细菌或病毒的定性检测。
3.快速、高效扩增，耗时短。扩增不需要加热变性，省去了热循环步骤，40～60min即可完成扩增反应。且产率可达到0.5mg/ml。增加环引物的环介导等温扩增方法，使反应速度可提高1/2～1/3[31]。
4.灵敏度高，扩增模板可达10拷贝亦或更少。
5.扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，就能够完全像DNA基因扩增那样，一步实现RNA扩增[32]。
6.鉴定简便。在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2＋结合，产生副产物——焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否，进行实时监测。
（二）LAMP方法的缺点：产生非特异性扩增不可避免。
因为根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，一旦产生非特异扩增，不易察觉，容易发生误判。所以，预防非特异的扩增和污染成为重中之重。
1．通常的措施有严格分区操作基因扩增检验实验室一般分为四个隔开的工作区域，即只能从标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)和产物分析区。每一区域仪器设备专用，各区域标记明确，工作服区别标志明显，避免区域间设备、物品、试剂混用发生交叉污染。进入各个工作区域只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区。试剂贮存和准备区用于贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂溶液应分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染和试剂品质的下降。
2．实验室的清洁也应该引起注意，应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行，并且清洁用具专用。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面的紫外照射，由于扩
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增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此必须延长照射时间，最好是照射过夜。标本制备区用于标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。避免在本区内不必要的走动防止发生气溶胶所致的污染。用过的加样器吸头必须进行专门的消毒(例如10%次氯酸钠溶液浸泡不得少于24h)。在提取核酸的时候也要注意交叉污染，一般不要同时提取阴性样品和阳性样品，阳性样品提取时不要平行进行。不能从扩增区进入上游任何区域，打开反应管前快速离心数秒防止液体溅出。扩增产物分析区最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出，含有LAMP产物的所有液体及废弃物应放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡时间不宜少于6 h。本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。
3．每次试验必须做阴性对照。及时发现，及时解决。
1.4.3 LAMP反应产物的检测方法
（一）肉眼观察法
在LAMP的反应过程中，可以通过副产物焦磷酸镁沉淀的产生来通过肉眼直接判断扩增反应是否发生。
它的原理是：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应溶液中的镁离子（Mg2+）结合，生成副产物焦磷酸镁白色沉淀物。反应方程式如下：
（DNA）n-1+dNTP=(DNA)n+P2O74-
P2O74-+2 Mg2+= Mg2P2O7
所以可以直接根据是否形成白色沉淀来定性判断反应是否发生，常规的PCR反应中也可以产生焦磷酸盐或焦磷酸盐离子，但是它的含量比较小，很难直接通过沉淀进行产物检测，往往需要添加荧光染料或酶进行检测，而如果改变反应条件或是循环次数，又容易造成非特异扩增。副产物焦磷酸镁的产生也是LAMP反应的一个特点，从而简化了扩增产物的检测。
（二）添加荧光染料法
有的时候，通过肉眼观察白色沉淀是否产生来判断扩增是否发生会存在一定的视觉误差。所以我们也可以通过添加荧光染料，例如溴化乙锭（EB）、SYBR GreenI等进行呈色，从而检测扩增反应是否发生。
以SYBR GreenI为例。SYBR GreenI荧光染料只与双链DNA的小沟结合，当它与DNA双链结合的时候，会发出比原先强800～1000倍的荧光。在一个体系中，其荧光信号的强度代表了双链DNA分子的数量。在核酸大量合成的时候，SYBR GreenI会自动掺入双链DNA中。然后通过反应液中的荧光强度变化来判断产物的产生。如果发生了扩增反应，反应结束时混合液的颜色会由橙色变成绿色，并且伴有白色沉淀的产生，而如果没有发生扩增反应，反应结束时混合液的颜色就会保持SYBR GreenI的橙色不变。
（三）琼脂糖凝胶电泳法
根据LAMP反应的原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构（含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构。）所以，LAMP法的核酸扩增产物在1%的琼脂糖凝胶
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上呈现的并不是一条带而是呈现出典型的梯形条带。
（四）利用专门的仪器
日本荣研株式会已经利用LAMP反应过程中会生成白色沉淀——副产物焦磷酸镁这一特点，研制出专门用于LAMP检测的终点监控浊度仪和实时监控浊度仪，尤其实时监控浊度仪它可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。从而使扩增和检测一管一步完成。
1.4.4 LAMP方法的应用
LAMP作为一种新颖的、相对稳定的分子检测方法，己日益广泛地应用于各种样品中DNA 和RNA的检测和鉴定。
（一）病毒病原体的检测[33-48]
1．人类疱疹病毒的检测：
疱疹病毒(Herpesviruses)是一群中等大小的双股DNA病毒。侵犯人类的疙疹病毒有7种，即单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1，HSV-2)、水痘－带状疱疹病毒(Varicella－zostervirus，VZV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、爱泼斯坦－巴尔病毒(Epstein－Barrvirus，EBV)、人疱疹病毒6型(humanherpesvirus，HHV-6)和人疱疹病毒7型(HHV-7)、严重急性呼吸综合症冠状病毒(SARS－COV)的检测。Ihira M等用LAMP方法对人类疱疹病毒6型(HHV-6)的特异U31基因进行检测，能够准确对幼儿急疹(ES)患病初期的标本进行诊断,Yoshikawa T等用LAMP方法检测人类疱疹病毒7型(HHV-7)的U38基因，判断人体是否感染HHV-7病毒。2005年Enomoto 等采用LAMP建立了单纯疱疹病HSV-l和HSV-2的快速检测方法，他们分别扩增了HSV-1和HSV-2的特异Gg基因，通过浊度法和电泳法分析扩增产物，对HSV-1和HSV-2作出了准确判断。
2．流感病毒的检测：
Poon等采用LAMP和PCR方法分别对稀释成浓度的禽流感病毒(HumanlnfluenzaA ViruseS)样本进行检测，PCR只检测到10-2PFU，LAMP可检10-3PFU。2004年，Poon等采用LAMP法扩增甲型流感病毒。LAMP分析法的实验结果和病毒学诊断完全一致。
3．乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检测：
2000年Notomi T等首次应用LAMP法对乙型肝炎病毒（HBV-DNA）进行检测。我国的李青雅等和李启明等分别用LAMP和RT-LAMP对该病毒进行检测。
4．呼吸道病毒的检测：
2004年poon等应用LAMP法检测严重急性呼吸综合症冠状病毒（SARS-CoV）,同一年Hong 等根据LAMP的原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-CoV。Ushio等采用RT-LAMP等多种方法来检测呼吸道合胞病毒（RSV）。2006年Fukuda S等利用LAMP原理设计RT-LAMP来检测诺瓦克样病毒。
5．其它病毒的检测：
LAMP还可应用于番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的检测、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、植物中的李痘病毒(PPV)、多瘤病毒(BK)、风疹病毒(RV)、对虾黄头病(YHV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)、鱼类虹色病毒、腮腺炎病毒、新城6
环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157︰H7的研究
疫病毒(NDV) 、狂犬病毒（CDV）、细胞巨化病毒(CMV)、西尼罗河病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒（MV）、日本脑炎病毒（JEV，及乙脑病毒）、口蹄疫病毒等许多病毒的检测等许多病毒的检测。
（二）细菌病原体的检测[49-56]
1．分枝杆菌的检测：
Iwamodo等设计了16S核糖体DNA保守序列的分枝杆菌属公共引物，并且还根据gyrB基因序列分别针对结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌设计了特异性的引物，从而用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。2003年Iwamodo 等根据gyrB基因序列设计针对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的特异引物和16S 核糖体RNA保守序列的分枝杆菌属公共引物Muniv，用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。
2．牙周细菌的检测：
牙周炎是由牙周细菌引起的一种传染性疾病，可以引起牙周组织破坏，以至牙齿脱落。引起牙周炎的主要病原体有牙龈卜啉菌(P.gingivalis)、福氏类杆菌(T.forsythia)、齿垢螺旋体(T.dentieola)。Yoshida等针对这三种病原体分别设计引物，用LAMP方法扩增靶序列，在60min 内每隔10min对扩增产物进行检测。
3．艰难梭状芽孢杆菌的检测：
Kat0H等利用LAMP方法检测了C.difficile的毒素B的基因，并鉴定出了产毒素B的C.difficile菌株。该法敏感性好，可用于带菌者伏期患者的检测。
4．大肠杆菌0157:H7的检测：
2003年，Maruyama等将LAMP和原位杂交结合，用于检带stx2基因的Ecoli0157:H7，克服了原位PCR的一些缺点，原位LAMP等温条件下相对较低的温度，可减少对细胞的破坏，有利于应用荧光抗体进步细胞鉴定，并且其产物结构的特殊性防止了产物泄露到细胞外。
5．其它细菌病原体的检测：
2004年Horisaka T等针对假结核耶尔森氏菌的inv基因设计引物进行LAMP检测。2005年Seki M等针对肺炎链球菌的特异性基因lytA对肺炎链球菌进行定量检测。同年，Song T等通过设计引物来扩增志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌均携带的侵袭性质粒抗原基因(ipa H)，用LAMP法来检测志贺菌属及侵袭性大肠埃希菌及产毒素的大肠杆菌。我国近年来，也有将LAMP 法用于细菌检测的报道，如徐芊等针对副溶血性弧菌的不耐热溶血毒素基因（tlh）设计引物进行LAMP扩增。匡燕云和程天印等建立了嗜水气单胞菌的LAMP检测方法。LAMP还可应用于藤黄微球菌、爱德华菌、粪肠球菌、迟钝华氏菌(E.tarda)、沙门氏菌等许多细菌的检测。
（三）真菌病原体和寄生虫病的检测[57-60]
1．真菌病原体的检测：
2004年Endo S等针对真菌巴西类球孢子菌(PB)的特异基因gp43设计引物，进行LAMP反应，只需3h，大大缩短了检测真菌的时间。
2．寄生虫病的检测：
疟疾病原体的检测：2006年Poon等用LAMP方法检测疟疾虫的小亚基核糖体rRNA(SSUrRNA)基因，可准确判断人体是否患有疟疾。
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河北农业大学非全日制硕士专业学位论文
8 非洲锥体虫的检测：2003年Kuboki等利用LAMP方法分别对锥体个物种T.brucei和
T.congolense的PFRA和P0基因进行扩增，有效地检测出这两种锥体虫。
巴贝西虫的检测：2004年Ikadai等根据巴贝西虫的18SrDNA序列设计引物，采用LAMP 和PCR的方法进行扩增反应，并且将LAMP和PCR的检测结果与光学显微镜的检测结果进行对比分析。结果显示两种方法的检出限一样，但是LAMP法比PCR更省时。
（四）其它方面的应用[61-66]
1．转基因食品(GM0s)的检测：
LAMP已逐步应用于食品分析中，世界卫生组织在20世纪90年代提出了对转基因食品进行安全性评价的要求，规定转基因食品必须标示。由于大多数转基因食品都含有CaMV-35S启动子，因此，检测CaMV-35S启动子的存在与否可判断转基因食品。Fukuta、Shiro等利用LAMP 方法通过检测CaMV-35S启动子来确定大豆是否进行了转基因改良。
2．动物胚胎性别鉴定：
在胚胎研究中，胚胎性别的判断是一项很重要的工作。研究初期主要依靠非分子生物学方法，如免疫学方法、细胞学方法、X-相关酶法。近年来，随着DNA 体外重组技术的发展，主要采用分子生物学的方法进行胚胎性别鉴定。而基于Y 染色体上特异序列的检测，可判别胚胎的性别。Irayama 等将LAMP 方法用于检测牛胚胎的性别，取得了很好的效果。经过显微切割的胚胎标本，处理后提取DNA，然后被均分在 2 个试管中，进行2次LAMP 反应，即雄性特异的和雌雄共有的LAMP 反应。用于检测雄性胚胎的特异序列S4 是染色体上的一段重复序列，而用于雌雄共有的LAMP 反应的特异序列是1.715 卫星序列DNA。只有 2 个LAMP 反应都为阳性，才能判定胚胎的性别为雄性；反之，如果只有雌雄共有的反应为阳性，则胚胎性别为雌性。如果雌雄共有的反应为阴性，则反应无效。这种基于此技术的胚胎性别检测方法，具有很高的敏感性和准确性，用3～5 个细胞样本可很准确地判别性别，而用1～2个细胞，准确性也达到75.0%～94.4%，而且能减少胚胎切割后的流产率。整个过程包括提取DNA 在内不超过1h，产物的检测则可非常方便地利用其生成的白色沉淀进行浊度分析。
综上所述，LAMP适用范围广泛，其操作简单、所需模板量少、特异性强及可以快速获得大量特异性扩增产物等优点，必将成为核酸研究的重要工具，在卫生防疫检验和食品检测中大显身手，成为应对大规模突发公共卫生事件最强有力的武器之一。
到目前为止，改良LAMP法同时检测E.coli O157:H7的O157特异性抗原rfbE基因、鞭毛H7特异性抗原fliC基因的研究至今未见报道，本课题研究探索了一种更为特异、灵敏的分子检测样品中E.coli O157:H7的新技术。
1.5 研究内容
本课题采用LAMP技术直接检测肉类中的E.coli O157:H7的方法。以E.coli O157:H7的O157特异性抗原rfbE基因、鞭毛H7特异性抗原fliC基因序列作为靶序列，分别设计两套增加了环引物的改良LAMP引物序列，单管同时检测，通过肉眼观察白色沉淀，判断检测结果。观察梯形条带，以证实是否发生了LAMP反应。
环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157︰H7的研究本课题主要研究内容包括以下几个方面：
设计LAMP 引物，优化LAMP反应条件，建立LAMP检测体系。
引物的特异性和菌株纯培养物的灵敏度试验。
3．对几种从食品中高效提取E.coli O157:H7DNA的提取方法进行比较。
4．检测人工污染的肉类中的E.coli O157:H7，确定检出限。
5．对实际样品进行检测，与其他方法进行比较，对LAMP检测E.coli O157:H7的方法进行评价。确定该方法的特异性、敏感度、符合率。
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河北农业大学非全日制硕士专业学位论文
10 2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验菌株
E.coli O157:H7（ATCC43889）、E.coli O157:H7（IQCL10102）、E.coli O157:H7（EDL933）、E.coli O157:H7（CMCC44828）、E.coli O157:H7（CICC21530）大肠艾希氏菌（E. Coli CGMCC 11229）、沙门氏菌（salmonella CMCC47005、CMCC50047、CMCC50083、CMCC50104）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii ATCC29544、ATCC51007、ATCC51024）、鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii CMCC51149）痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae CMCC51054）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri CMCC51061)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens CICC22949)、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC 7064）、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa CMCC10104)、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus CGMCC26003) 、单核细胞增生李斯特菌(L .monocytogenes ATCC7644)。ATCC购自美国菌种保藏中心；IQCL购自中国检验检疫科学研究院；EDL购自中国医学细菌保藏管理中心；CMCC购自中国药检所；CGMCC和CICC购自中国工业微生物菌种保藏中心。
E.coli O157:H7、6株E.coli O157:H7其它大肠杆菌血清型（E. coli O6：K15、E. coli O20：K17、E. coli O144：K90、E. coli O128：K67、E. coli O125：K70; E. coli O124：K72）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(L .monocytogenes)、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）为本实验室分离保藏。
2.1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅DK-98-1（天津市泰斯特仪器有限公司）、小型台式离心机SIGMA1-14（德国西格马公司)、恒温培养箱LRH-150B（广东省韶关市鑫腾科普仪器有限公司）、凝胶成像系统MINIBIS Pro（以色列DNI公司)、电泳仪DYCP-31DN型（北京市六一厂生产)、微量移液器0.1～1mL Finnpipette（美国)等。
2.1.3 主要培养基
（一）LB 培养基
LB 液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，用1mol/LHCl 调节pH 至7.4，121℃高压灭菌20min。
LB 固体培养基：在LB 液体培养基中加入1.5%琼脂。
(二) 营养琼脂
摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。 关键词：恒温扩增；PCR 引言： 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。 1滚环核酸扩增 1. 1 滚环核酸扩增的原理 滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。线性RCA 用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，线性扩增倍数为105。指数RCA 原理与线性RCA 相同，采用与环状DNA 序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA 产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针 的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。指数RCA 可用于非
核酸环介导等温扩增技术原理及引物设计与实例 1．LAMP引物的设计： LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F 3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因 的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’ 端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成，和靶基 因的B3c区域互补。 如图所示：
2．扩增原理 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c 结合（如图B所示），在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链（如图C 所示）。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构（如图C所示）。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
文章编号:1001-764X(201105-378-03 ·研究生园地·环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸* 沈会平1,张耀祺1,杨坚2,石磊1,陈涛3,李国周4,赵红波5,莫自耀5(1．华南理工大学轻工与食品学院,广州510640;2．迪澳生物科技有限公司,广州510663;3．广东省结核病防治研究所,广州510630;4．东莞市慢性病防治院,广东东莞 523008;5．广州医学院呼吸疾病国家重点实验室,广州510230 摘要:目的建立一种快速准确的检测结核分枝杆菌(MTB核酸的环介导等温扩增(LAMP方法。方法以重复插入序列IS6110为目的基因,设计LAMP引物,特异检测MTB核酸。用本法与痰涂片抗酸染色镜检法、实时荧光PCR法对100例可疑患者痰标本进行对比检查。结果LAMP法特异性强,仅扩增MTB复合群核酸;灵敏度高,检测限达100fg;而实时荧光PCR 检测限为1pg。对100例疑似结核病患者痰液标本检测,涂片抗酸染色法、LAMP法、实时荧光PCR法的阳性率分别为28%、39%和38%。结论本研究建立的LAMP方法检测MTB核酸特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为临床快速检测MTB的新方法。 关键词:结核分枝杆菌;环介导等温扩增法;IS6110基因;实时浊度仪 中图分类号:R378．91文献标志码:A Rapid detection for Mycobacterium tuberculosis by loop-mediated isothermal amplification SHEN Hui-ping1,ZHANG Yao-qi1,YANG Jian2,SHI Lei1,CHEN Tao3,LI Guo-zhou4,ZHAO Hong-bo5,MO Zi-yao5(1．College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou510640,Guangdong;2．Diao Bio-Technology Co．Ltd,Guangzhou510663,Guangdong;3．Guangdong Research Institute for Mycobacterium tuberculosis Control,Guangzhou510630, Guangdong;4．Dongguan Hospital for Chronic
作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院(蔡哲钧、冯杰雄);310006杭州,浙江大学医学院(朱圣禾)?综述? 核酸环介导等温扩增技术 蔡哲钧综述 冯杰雄 朱圣禾审校 【摘要】 介绍环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景。环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可检测乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、水痘2带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒、结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。 【关键词】 核酸类; 基因扩增 上世纪90年代以来,出现了几种新的核酸扩增方法:核酸等温扩增法(nucleic acid sequence2based amplification,NAS2BA)、自序列复制法(self2sus2 tained sequence replication,3SR)和链置换扩增法(st rand displacement amplification,SDA)等。Noto2 mi等[1]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(loop2mediated isot hermal amplification,LAM P),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAM P是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。现将该项技术的研究进展作一综述。 L AM P法的原理 该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在15～60min扩增109～1010倍;特异性高,所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的[2]。 1.引物的设计:基于靶基因3′端的F3c、F2c和F1c区以及5′端的B1、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP引物:上游内部引物,由F2区组成,F2区与靶基因3′端的F2c区域互补,与靶基因5′端的F1c区域序列相同。F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。B IP引物:下游内部引物,由B2区组成,B2区与靶基因3′端的B2c区域互补,与靶基因5′端的B1c区域序列相同。 B3引物:下游外部引物,由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。 2.扩增原理:DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下,以FIP引物F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补,以3′末端为起点,通过链置换型DNA聚合酶的作用,一边置换先头FIP引物合成的DNA链,一边合成自身DNA,如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA 链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链,这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,于是发生自我碱基配对,形成环状结构。同时,BIP引物同该单链杂交结合,以B IP引物的3′端为起点,合成互补链,在此过程中环状结构被打开。接着,类似于F3,B3引物从B IP引物外侧插入,进行碱基配对,以3′端为起点,在聚合酶的作用下,合成新的互补链。通过上述两过程,形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列,自然发生自我碱基配对,形成环状结构,于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAM P法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成L AM P法基因扩增循环的起点结构。LAM P 法基因扩增循环:首先在哑铃状结构中,以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。与此同时,FIP引物F2与环上单链F2c杂交,启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样,在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c,B IP引物上的B2与其杂交,启动新一轮扩增。经过相同的过程,又形成环状结构。通过此过程,结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构[2]。 3.L AM P扩增产物的检测:(1)荧光定量检测:利用S Y BR GreenⅠ荧光染料只与双链DNA小沟结合,当它与DNA双链结合时,发出较原先强800～