PCR-free文库测序和其它文库测序没区别，只是建库过程不做PCR，由于两端primer不是互补结构，所以电泳会有偏移，所以文库insert分布较宽
测到的reads数取决于flowcell上长了多少cluster（1个模板分子扩增出的一簇分子），有多少cluster，理论上就得到多少reads（SE测序一个cluster得到一条序列，PE测序就是一对序列）。
flowcell上长多少cluster是通过文库上机浓度控制的，文库本身浓度较高，则稀释到一定浓度后再上机，以达到适中的cluster数量，一个文库如果DNA含量足够，浓度足够，可以上机多次。
PCR-free文库由于不做PCR扩增，所以对样品本身的DNA含量要求比较高，这样建出的文库才能达到上机浓度和DNA量的要求。
PCR-free文库作为一种建库方法的补充，可提高高GC区域的覆盖度。缺点是insert-size分布较宽，尤其在小片段区域分布较多。
峰的高低说明了信号的强弱，宽窄表示的是分离效果，可以对比板胶电泳的亮度和条带的宽窄。重叠则说明了样品中有长度相同但是序列不同的片段。 Q-1.为什么提供新鲜的菌液？如何提供新鲜的菌液？返回顶端 A-1.首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄露；也可以将培养好的 4~5ml菌液沉淀下来，倒去上清液以方便邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。 Q-2.DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?返回顶端 A-2.溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。 有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小，但根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。 Q-3.提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好?返回顶端 A-3.我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果您可以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。如果提供的DNA量不够，我们就需要对质粒进行转化，此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好，象TaKaRa、Qiagen、Promega的质粒制备试剂盒等。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。 有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序样品的提供”部分的说明。 Q-4.提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好?返回顶端 A-4.一般，菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。 平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。 制作穿刺菌时，可在1.5 ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中,37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。
DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】 1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11．POP 6测序胶ABI产品。
第十八章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序 仪 首页习题习题参考答案 名词解释选择题简答题 、名词解释 1. 荧光标记引物法 2 ?荧光标记终止底物法 3. 多色荧光标记引物法 4. 多色荧光标记终止底物法 5. Edman降解法 6. San ger双脱氧链末端终止法 7. 平板电泳型DNA测序仪 &毛细管电泳型DNA测序仪 9.缩微生物处理器 二、选择题 【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案） 1. DNA的一级结构是指（）； A. DNA空间构象 B. 核苷酸序列 C. 碱基序列 D. 氨基酸序列 E. DNA双螺旋结构 2. 下列有关测序反应体系反应原理的叙述中，错误的是（） A. 加入的核苷酸单体为2 '-脱氧核苷三磷酸 B. 低温退火时，引物与模板形成双链区
C. 沿着3 - 5的方向形成新链 D. DNA聚合酶结合到DNA双链区上启动DNA的合成 E. 形成的新生链与模板完全互补配对 3. 双脱氧链末端终止法测序反应与普通体外合成DNA反应的主要区别是（） A. DNA聚合酶不同 B. dNTP的种类不同 C. dNTP的浓度不同 D. 引物不同 E. 双脱氧链末端终止法测序反应体系中还需加入d dNTP 4. 下列荧光标记方法中，可以将A、C G T四个测序反应在同一管中完成而不影响测序结果的是（） A. 单色荧光标记引物法 B. 单色荧光标记终止底物法 C. 多色荧光标记引物法 D. 多色荧光标记终止底物法 E. 多色荧光标记法 5?下列哪一荧光标记法，必需将A、T、C G四个测序反应分管进行，但可以合并在一个泳道内电泳（） A. 单色荧光标记引物法 B. 单色荧光标记终止底物法 C. 多色荧光标记引物法 D. 多色荧光标记终止底物法 E. 多色荧光标记法 6. 毛细管电泳型测序仪电泳时仪器显示无电流，最常见的原因是由于（） A. 电极弯曲 B. 电泳缓冲液蒸发使液面降低 C. 毛细管未浸入缓冲液中 D. 毛细管内有气泡 E. 测序样本未注入毛细管中 7. 毛细管电泳型测序仪电泳时产生电弧，主要原因是（） A. 电泳缓冲液漏出
一、苏州普泰生物技术有限公司 4. 我需要用什麽样的胶跑电泳? 很多种聚丙烯酰胺凝胶与MS分析兼容，包括传统的Tris-Glycine凝胶，或市面上许多品牌的预制凝胶如Novax NuPAGE Bis-Tris，Tris-Acetate凝胶。在蛋白质鉴定中，我们还没有观察到不同比例的一个凝胶或梯度凝胶，或不同厚度的一个凝胶导致的显著影响。尽管如此，根据我们的经验我们还是建议不要使用Tricine凝胶进行蛋白质鉴定。 5. 我需要用什麽样的染色方法? 凝胶可以用许多不同的染色方法染色，包括考马斯蓝染色，胶体考马斯染色，铜染色，锌染色，荧光染料染色和银染色。传统的银染不兼容质谱分析，但一些修改的银染色程序，消除了以感光剂为主的glutaldehyde的使用，被认为更兼容MS分析。有几种商业银染色包声称与MS兼容。但是根据我们的经验，等量的蛋白质，胶回收时使用所谓与MS兼容的银染染色的胶带中肽的产量还是要比用胶体考马斯染色的胶带的产量低。虽然我们接受银染凝胶样品，我们还是建议我们的客户尽量使用胶体考马斯染色，铜染色，锌染色方法以纯化足够的蛋白质样品（检测最低限量为ng），而且使用银染时想要提纯更多的蛋白质太难了。从长远来看，优化纯化过程的收益往往是很大的，可以大大提高鉴定的成功率，得到一个高可信度的蛋白质鉴定结果，而且这些经验对以后的工作也很重要。 此外，请小心以避免在此步骤中样品被污染。直接用手接触、使用脏的容器或者被污染了的试剂都将可能导致鉴定的失败！ 6. 如何切割蛋白质胶带? 从凝胶中切割出蛋白条带时千万要十分小心！第一，采取一切预防措施，以避免用手或任何有可能被污染的表面直接接触到凝胶体，如灯箱、刀片或使用过的容器。您需要戴上干净的手套，将胶体放置在灯箱下的干净塑料薄膜上（如Sara Wrap ），并使用干净的刀片和凝胶容器。请记住，即使是极小块的人体皮肤也可能含有比凝胶带上蛋白质量高出数百倍的角蛋白。第二，切出来的凝胶切片的大小应接近该蛋白带的大小。太小的凝胶切片意味着宝贵的样品的损失，而过大的凝胶切片可能会降低酶切的消化效率和肽的回收率。蛋白带被切下来之后，小心转移到一个干净的500μl离心管中。盖上盖，贴上标签：用石蜡膜包裹，以防止凝胶片干燥（你也可以添加?10微升1％醋酸/水，以防止其干燥）。如果你需要切割出若干个蛋白带，一个一个的做，以免这些蛋白带混淆。每个错误将很难再追查。
多肽合成蛋白测序 433Ａ多肽合成系统——公认的经典高效全自动合成系统 合成规模0.1－1.0 mmol，可采用Fmoc和tBoc两种方法 特有的涡流混合式反应腔和NMP溶剂系统：活化氨基酸与 肽充分反应，偶联率高达99％以上 专利的零死体积阀门设计：去除交叉污染，减少试剂消耗 全套完备的试剂和树脂 全自动电脑控制，程序编辑快速简便 特有回馈监控功能，自动强化脱保护和偶联，保证高得率 491型蛋白质测序仪 Procise 系列HT和cLC，Ｃ型蛋白测序仪 独一无二的高灵敏高效率蛋白序列测定系统 适于各种方法制备样品的测序：电转移印迹法、PVDF膜上样品或HPLC等溶液样品，还适于各种蛋白的测序 全自动电脑监控：对于未知蛋白测序编辑新程序即可，并可同步监测反应情况随时调整以获得最佳结果，便于GMP控制 精确的试剂输送回馈调节系统：使试剂输送精确度，化学反应效率、灵敏度提高，达fmol 级样品 独立的高精度HPLC系统分析PTH氨基酸 Procise C 为Ｃ端测序系统
173毛细管HPLC及微量蛋白印迹制备系统 一体化的超微量高效液相色谱仪，样品分离收集一步完成 灵敏度高，回收率高，可用于500fmol蛋白/多肽样品制备 自动收集样品到PVDF膜上，避免了人为的误差 PVDF膜可直接用于蛋白测序仪：可与质谱仪联用 样品斑点只有2－3mm，无需进一步浓缩或转移，减少了样品的丢失及污染可能检测器灵敏度极高，专适于超微量分析和微量制备 多肽合成试剂 试剂分子量数量产品编号 DCM 84.9 1000 ml
GEN902017 DIPEA (density 0.742 g/mL) 129.2 4 x 9 ml GEN075000 DMAP 122.2 1 g GEN910015 DMF (Peptide synthesis grade, low amine content, 2 ppm) (25 L DMF available on request) 122.2 1000 ml GEN910003 2500 ml GEN002007 Fmoc-succinimidyl carbonate (For introduction of Fmoc group) 337.3 5 g GEN910016 20% (v/v) Piperidine/DMF 1000 ml GEN910008 TFA 100 ml GEN910004 脱保护试剂(20% (v/v) Piperidine(DMF) 4 升 GEN903081 DIPEA 1 升 GEN903082 DMF 4 升 GEN903080 DMF 25 升 GEN002507 活化试剂 DIPCDI (density 0.806g/ml) 126.2 25 ml GEN910006 HATU 380.2 5 g GEN076521 25 g GEN076523 100 g GEN076525 1000 g GEN076527 HOAt 136.1 5 g GEN076511 25 g GEN076513 100 g GEN076515 1000 g GEN076517
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用
随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不
浅谈蛋白质质谱分析方法及应用 董义龙 (单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031） 摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综 述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式 和应用，并对其发展前景着出展望。 关键词：蛋白质质谱分析原理与方法 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 1 蛋白质组学研究的背景和意义 1．1蛋白质组学的产生 20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。它摒弃经典分子生物学零敲碎打地研究个别基因的习惯，力求从细胞水平上解决基因组问题以建立对生命现象的整体认识。但是，生命现象的主要体现者是蛋白质，而蛋白质有其自身的特定活规律仅仅从基因的角度来研究是远远不够的l 31。因此，产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)。 1．2蛋白质组学的概念 “蛋白质组”是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams等于1994年在意大利一次学术会议上首次提出的，最早见诸于文献是在1995年7月的(Electrophoresisj)杂志上【41指的是基因组编码的全部蛋白质。』4一义上来讲，蛋白质组(proteome)是指：“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组是一个动态的概念，它是对应于一个基因组的所以蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。它不仅在同一个机体的不同组织和细胞表 达情况不同，在同一机体的不同发育阶段、直至消亡的全过程中也不断变化；机体处于不同生状态下不同，在不同外界环境下也是不同的。实际上每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体不同时间和空间出现并发挥功能的不同组合的结果。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律，包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。这一术语一经提出，很快得到国际生物学界的广泛关注。第～次国际性的“蛋白质组学”会议于1997年召开，同年出版了第
学习 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（本图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。由于临床专业的研究生，这些东西是没人带的，只好自己研究。开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对了数千份序列后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两
个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下： 说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面1～2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知
基因测序技术的优缺点及应用 随着人类基因组计划的完成,人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时,分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,使得基因检测技术得到了迅猛发展,基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术,到 2005 年,以Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 的相继出现,测序效率明显提升,时间明显缩短,费用明显降低,基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展,极大地提高了基因检测的检出率,并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月,约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术,发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2,标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年,《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后,通过 NGS 技术,与遗传相关的致病基因不断被发现,NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年,《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年,基因检测成为临床诊断和科学研究的热点,得到了突飞猛进和日新月异的发展,越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时,基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域,其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前,基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年,Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法,并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH,因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP,延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成,将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如,临床上采用 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达 90% 的
生物质谱技术在蛋白质组学中的应用（北京大学药学院 杨春晖 学号：10389071） 一、 前言[1，2] 基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道，也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组研究中发挥重要作用。 目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点，第一向在pH梯度胶内等电聚焦，然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展，生物质谱当上了主角，蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF，其分析容量大，单电荷为主的测定分子量高达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS 联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术，并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。 二、 生物质谱技术[3，4] 1．电喷雾质谱技术（ESI）[5] 电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 2．基质辅助激光解吸附质谱技术（MOLDI）[5-7] 基质辅助激光解析电离（MOLDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹烘干形成共结晶，放入离子源内。当激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配，因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少，可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞
第三代测序技术与质谱测序技术的 介绍和比较 质谱蛋白测序 质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。 在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。 串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。 在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
1.为什么TALEN和CAS9技术移码敲除项目需通过测序判定基因型？ TALEN和CAS9技术是通过特异识别和核酸酶切割，使DNA双链断开，机体启动DNA损伤修复机制，在非同源末端连接修复过程中，碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。这一修复过程通常会产生1-30个左右的碱基缺失，PCR后凝胶电泳无法将碱基缺失链和wt链区分开，所以只能通过测序判断。 2.如何判断TALEN和CAS9技术移码敲除项目的基因型？ a. 野生型或基因敲除的纯合子基因型的判定： 1）如下图所示,只有单峰的为野生型或基因敲除的纯合子。 2）将只有单峰的序列文件与wt序列比对，可判定野生型或基因敲除的纯合子基因型（网站或生物软件比对均可）. 如下图的对比结果为野生型：
如下图的比对结果为缺失一个C的纯合子 b.杂合子基因型的判定： 1).如下图所示，测序图谱中出现叠峰的为杂合子 若将叠峰的序列文件直接与wt序列比对，叠峰后的序列会对应不上(因为叠峰的序列只显示了信号强一点的那个碱基，实际上每个叠峰对应两个碱基)，如下图所示：
所以不能通过直接比对来分析，需通过峰图分析，在峰图中峰的颜色与碱基对应关系如下：A：绿色 T：红色 C：蓝色 G：黑色 2)将wt的峰图与杂合子的峰图用软件同时打开，从出现叠峰的位置开始分析（杂合子的一条链是wt链，一条链是缺失链）： 上图第一个峰图是野生型的序列，与第二个峰图叠峰开始对应的序列为： Gttaact ccgagcagcaaagaaatgatgtccc 上图第二个峰图是杂合子的测序峰图，从叠峰位置开始的序列为： Gttaact ccgagcagcaaagaaatgatgtccc（wt链） Ccgagcagcaaagaaatgatgtcccaagcctt（缺失链） 由此可判定为该杂合子的基因型为缺失gttaact（-7）
PEAKS蛋白质从头测序技术 2003年，Ma等人开发了PEAKS。PEAKS是用于解析肽图谱的一种串联质谱蛋白质组学软件，可用于基于串联质谱的肽测序，蛋白质鉴定和蛋白质定量分析。他们在PEAKS方法中运用了新的从头测序模型和算法，分为四个步骤： 第一步将图谱进行预处理，包括图谱噪声过滤和图谱峰聚合； 第二步是在简化后的图谱中根据母离子质量列举出所有可能的候选肽段； 第三步和第四步为综合打分的差异分析以及分值正则化。 PEAKS蛋白质从头测序技术一般通过肽从头测序辅助的数据库搜索来进行肽鉴定。同时，它还通过基于肽序列标签的自动搜索（SPIDER）和PTM鉴定技术整合了PTM和突变表征。PEAKS可提供各种肽的完整序列，各个氨基酸序列的可信度评分，简单的高通量分析报告，以及其他信息。 PEAKS可以对多个数据库搜索引擎的结果进行比较。PEAKS inChorus会自动将测试结果同其他蛋白质ID搜索引擎（例如Sequest，OMSSA，X!Tandem和Mascot）进行交叉检查，这样可防止肽鉴定结果的假阳性。 PEAKS Q是一种用于蛋白质定量的附加工具，支持标记（ICAT, iTRAQ, SILAC, TMT, 018等）和非标记两种定量法。 其中SPIDER是PEAKS中基于序列标签的搜索工具，可处理从头测序误差和同源突变之间可能出现的重叠部分。它可通过自动且有效地结合从头序列标签和同源物，重建正确的肽序列。 SPIDER 重建正确的肽序列过程（来源：百泰派克） PEAKS软件中使用的一系列算法已经过修改配置到PEAKS AB软件中，成为用于自动单克隆抗体测序公认的首选方法。
第十三章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪 一、名词解释 1.荧光标记引物法：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5′端，称为荧光 标记引物法。 2.荧光标记终止底物法：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上， 称为荧光标记终止底物法。 3.多色荧光标记引物法：是DNA测序反应常用的一种荧光标记方法。将荧光染料 预先标记在测序反应所用引物的5′端，当相同碱基排列的寡核苷酸链作为骨架分 别被4种荧光染料标记后，便形成了一组（4 种）标记引物。特定颜色荧光标记的 引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系。 4.多色荧光标记终止底物法：是D NA 测序反应常用的一种荧光标记方法。将荧光染 料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上。反应中将4种d dNTP 分别用4种不同 的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP 在掺入DNA 片段导致链延伸终止的同时，也使该片段3′端标上了一种特定的荧光染料。根据荧光颜色的不同来判断所代表 的不同碱基信息。 5.Edman降解法：是检测蛋白质一级结构的方法。在弱碱条件下，多肽链N末端N H2 与P ITC 反应，生成PTC－多肽。在无水强酸如三氟醋酸的作用下，可使PTC－多 肽形成ATZ 衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽。剩余多肽链可以进行下 一次以及后续的降解循环。如此不断循环，可依次使多肽链的氨基酸逐一降解， 形成A TZ 衍生物。ATZ 衍生物经水溶酸处理转化为稳定的P TH 氨基酸。 6.Sanger 双脱氧链末端终止法：是检测D NA 序列的一种方法。其原理是利用P CR，但反应体系中除了dNTP 外，还有ddNTP。ddNTP 可掺入到正在延伸的DNA 链中， 但不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA 链在此终止。由于 存在ddNTP 与dNTP 的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。 7.平板电泳型DNA测序仪：为D NA 测序仪的一种类型。平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于 0.4mm 或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳。它具有样品判读序列长（600bp～900bp）、一块凝胶板上可同时进行多个样品测序的优点。 8.毛细管电泳型DNA测序仪：为D NA 测序仪的一种类型。将凝胶高分子聚合物灌 制于毛细管中（内径50m～100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现D NA 片 段的快速分离。 9.缩微生物处理器：是一种新型D NA 自动测序装置。其基本结构为3层玻璃薄片和 一层聚二甲基硅氧烷薄片，各层间紧密粘合形成圆盘状，直径仅 10 厘米。在 这些薄片之间有各种反应小室、毛细管电泳通道和微瓣膜，可完成纳升级标本 的S anger DNA 测序。 二、选择题 【A型题】 1.DNA的一级结构是指（B） A.DNA空间构象
蛋白质质谱分析研究进展作者：汪福源蛋白质质谱分析研究进展摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。1．质谱分析的特点质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。2．质谱分析的方法近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。3．蛋白质的质谱分析蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI
DNA测序结果分析比对（实例） 关键词：dna测序结果2013-08-22 11:59来源：互联网点击次数：14423 从测序公司得到的一份DNA测序结果通常包含.seq格式的测序结果序列文本和.ab1格式的测序图两个文件，下面是一份测序结果的实例： CYP3A4-E1-1-1(E1B).ab1 CYP3A4-E1-1-1(E1B).seq .seq文件可以用系统自带的记事本程序打开，.ab1文件需要用专门的软件打开。软件名称：Chromas 软件Chromas下载 .seq文件打开后如下图： .ab1文件打开后如下图： 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（下图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱
基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。一般认为等位基因位点假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下：
说明： 第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面 1~2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。 一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。 通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份 PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知突变位点的发现，通常还需要用到更精确的酶切技术。 (责任编辑：大汉昆仑王)