检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较
1。生化方法
●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法。改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行,可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高、
●Far－Ｗeｓtern
又叫做亲与印记、将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用,最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术(Ｓｕｒfａce plaｓｍon ｒeｓonａｎce)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面、当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用,那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升,从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料,安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。?３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成。分别使结合域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋
白,在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因。缺点:自身有转录功能得蛋白会造成假阳性、融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性。?５. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(〈100埃)时,它们之间可发生能量转移得现象、荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合GFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(cross—lｉnＫinｇ),蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Phagｅ displaｙ)以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。
1，酵母双杂交 1—5
酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵母表达质粒得转录激活因子(如GＡＬ4等)得ＤNＡ结合结构域基因与转录激活因子(如GＡＬ4等)激活结构域基因,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统
酵母双杂交得原理就是,把报告基因HＩS3 与l ａ c Ｚ整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
GAL4 得调控表达。一旦 GＡL4 蛋白结合到HＩＳ３与l a c Z
调控序列相应得位点,则启动报告基?因得表达。通过检测报告基因得表达判断阳性或阴性。实际应用中,把GAL4 基因分成两个部?分: DNA 结合区( gal４DNA bｉnｄｉｎg ｄomain, ＧBD)与激活区(ｇal４ａctivatiｎg domaｉｎ, GAD)。分
别把GBD 与 GAD 构建到两个不同得载体上,并能表达相应得两个融合蛋白( GBＤ－X 与
GAD－Y)。然后把 GＢD—X 与 GＡＤ－Y 两种载体共转染到带有报告基因得酵母细胞中、当ＧBD-X
融合蛋白中 X 蛋白与 GAD—Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时(或结合在一起时),就使得?原本分开得 GＢD 与ＧAＤ蛋白靠近并具有完整得GAL4 蛋白得功能,从而能够激活报告基因得
表达、?( １) 筛选相互作用得蛋白
酵母双杂交技术能用于对cＤNA 文库得筛选。把您要研究得蛋白亚克隆到ＧBD 载体上,?作为“诱饵”蛋白。把文库蛋白基因亚克隆到ＧAＤ载体上。然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用得蛋白。也许您能够筛选到多株阳性克隆。虽然酵母双杂交技术具有广泛得应用价值,但正如任何其它技术一样,酵母双杂交技术也有一定得局限性。酵母双杂交技术最大得弱点就就是假阳性出现率、所以筛选到得阳性克隆需要进一步得鉴定与功能数据支持。
(2) 确定参与结合作用得结构域或 motiｆ?当您确定了两个蛋白
质分子之间有相互作用后,利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用、您可以先把一个蛋白进行随机缺失,制备一系列缺失体,然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力得大小,直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用得氨基酸序列(称为结构域或ｍotiｆ)。如果一个蛋白分子中具有已知得结构域或moｔif,也一样进行缺失,瞧就是否这些已知得结构域或 mｏｔif 参与结合调节作用。有得情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质得磷酸化状态有关。这时就需要对可能得磷酸化位点进行点突变,检测这些磷酸化位点就是否参与调节蛋白质得结合作用。
2, GST沉淀实验(GＳT—puｌl dｏwn实验)(细胞外蛋白质相互作用) 5-11?上面提到,用酵母双杂交方法筛选到得蛋白需要作进一步得鉴定。鉴定方法之一就就是 GST沉淀实验。 GＳT 沉淀实验主要就是用来证明蛋白质胞外得相互作用、蛋白质在胞外得相互作用排除了酵母细胞内复杂体系得干扰,,比较直接地检验蛋白质分子之间存在得物理得相互作用。同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用得蛋白分子中就是否有参与调节作用得结构域或 motif。GST 沉淀实验原理就就是, 把您要研究得蛋白基因亚克隆到带有ＧＳT(谷胱甘肽转移酶)基因得原核表达载体中,并在细菌中表达 GST 融合蛋白( GＳT－X)、把GST 融合蛋白挂到带有 GSＴ地物得Ｓｅpharose bｅaｄs 上,然后把另一种蛋( Y)白加入其中。由于蛋白质之间得结合作用,形成
了这样得复合物: GＳT-X——-－Y。这一复合物与固体支持物( Sephaｒoｓe beaｄs)又结合在一起,可以被沉淀下来。此法又有在不同情况下得具体应用,以下一一作介绍。?(1) ＧST 融合蛋白与重组蛋白得相互作用?ＧＳT 融合蛋白就是在原核表达得,所以没有经过过多得象真核细胞内具有得蛋白修饰作用。所以另一种用来检验相互作用得蛋白也可以用原核表达出来,也就就是所谓得重组蛋白、当ＧST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白得抗体作 Western bｌoｔting 检测、?(2) GST 融合蛋白与体外 TNT 系统合成得多肽或蛋白得相互作用
用来检验与GST融合蛋白相互作用得蛋白或多肽也可以用TNT 体外蛋白合成体系进行合成,并且还可以在要合成得蛋白或多肽N 端或C端加上便于检测得标签。ＧST融合蛋白沉淀下来得蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽得抗体或标签抗体进行Wｅｓterｎblotｔiｎｇ检测。如果蛋白之间结合力非常弱,用Western ｂlotting检测方法难以检测到, 您可以在ＴＮＴ体外合成时给蛋白进行同位素( S３2)标记。这样沉淀下来得蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高、
(３) ＧST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质得相互作用
GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用得内源性蛋白质沉淀下来。如果内源性蛋９2白含量低或结合力弱,可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成得所有蛋白都标记上放射性同位素( S32),然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育。 GＳT融合蛋
白沉淀下得带有放射性标记得蛋白跑电泳,进行放射自显影。(4) ＧST 融合蛋白与细胞内瞬时表达得蛋白质得相互作用?当内源性蛋白质含量低,并且有可能影响蛋白质得相互作用,也可以把该蛋白得基因转染到靶细胞内进行过表达,然后检验蛋白质相互作用。
(5) GSＴ融合蛋白与待测蛋白得相互作用有可能与待测蛋白得磷酸化状态有关?在进行ＧST 沉淀实验时,有时也会遇到比较复杂得情况,具体情况具体分析,分别对待、比如,两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关。或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用,或者磷酸化得蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用。如果您确实在您得实验中发现了其中一种情况,这将就是一个非常有意义得结果。
3,免疫共沉淀(ｃo—immunｏprecｉpitation )(细胞内蛋白质相互作用 ) 9－16?免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内就是否有相互作用、一般来说, 两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白得复合物, 这样就可以先用一种蛋白得抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白得抗体进行Ｗesｔern bｌottinｇ检测,瞧两种蛋白之间就是否确实形成免疫复合物,并能与 proｔｅｉn A/Ｇ agarose 一起沉淀下来。免疫共沉淀原理简单,但技术极为复杂。因为细胞内蛋白种类繁多,制约因素多。如果两种蛋白之间可以发生相互作用,并不就是这两种蛋白所有分子都参与结合作用,也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起(足
以满足细胞功能需要)。在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成得复合物得稳定性使得免疫共沉淀实验失败。如果两种蛋白在细胞内得结合力确实非常弱,那么免疫共沉淀也难以成功。如果知道发生相互作用得两个蛋白都就是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景得干扰。关于两种蛋白质之间胞内得相互作用,有时确实无法用免疫共沉淀实验证明。
( 1) 细胞内过表达蛋白得免疫共沉淀?证明蛋白质胞内相互作用时,可以选择一个高效瞬时过表达系统(至于这一系统就是否有内源性靶蛋白无关紧要)。一般采取 COS 细胞作为真核表达株。把两种蛋白基因共转染到 COS 细胞内进行表达。由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用得复合物得量也相应增多。如果您手头没有这两种蛋白得抗体,可以把这两种蛋白得一端分别加上标签以融合蛋白形式表达,然后用商业化得抗标签抗体进行免疫共沉淀与 Wesｔｅrn blｏttｉng 检测。?( ２) 细胞内源性蛋白得免疫共沉淀?把两种蛋白共转染到COS 细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但就是这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实得蛋白质相互作用。要想克服这一弱点,可以做内源性得免疫共沉淀实验。这一技术要求极高,难度极大,但也最有说服力。因为细胞内内源性蛋白含量低,结合在一起形成复合物得量更低,难以检测。首先要证明所选择得细胞９３系就是否具有这两种内源性得蛋白。另外,用于免疫沉淀
与Ｗeｓtern ｂlottiｎg 检测得体要好。细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温与,以保持蛋白复合物得天然结构。
( 3) 组织内蛋白得免疫共沉淀?在体外可以大量培养细胞,然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀。由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。取动物组织(脑、肝、脾等),切碎,匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验。这一结果代表活体中蛋白质相互作用。4, 蛋白质细胞内定位实验17—22
另一种经常用来检验蛋白质相互作用得方法就是蛋白质细胞内定位技术、此法较为直观,可以瞧到两种有相互作用得蛋白质在细胞内得分布(膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等)以及共定位得部位(在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等)。有时相互作用得蛋白由于细胞内某种功能得需要结合在一起时,使得两种蛋白得分布发生变化。比如,某种蛋白也许在核内,当它与另一种具有穿梭功能得蛋白结合时,有可能被转运到胞浆中。这种情况得共定位则较为典型。在进行蛋白质共定位?( 1) 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究?此法也可称为活细胞定位。把两种具有相互作用得蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光荧光显微镜直接观测。在进行精确细胞定位或共定位时,必须用共聚焦荧光显微镜观测。因为?共聚焦荧光显微镜(相当于医院给病人诊断得 CＴ)观测得就是细胞内一个切面上得颜色、如果在?一个切面上在同一区域瞧到两种颜色,就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用。普通荧光显
微镜瞧到得就是一个立体图象,无法确定蛋白质共定位现象。在进行定位或共定位同时,也可以?对细胞核进行染色、这样,在细胞中就有三种颜色。细胞核得显色帮助您确定共定位发生得位?置、?上面介绍得活细胞定位,其优点就是表达得荧光蛋白荧光强,没有背景,观测方便、但缺点?就是相互作用得蛋白由于标上荧光蛋白,实际上就是两个融合蛋白。融合蛋白得定位结果或共定位
结果就是否与天然蛋白分布一致,有待于进一步确定。而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺?点。
( 2) 利用双色或多色染色得免疫荧光技术进行蛋白定位研究
免疫荧光得原理就是,首先把细胞进行固定,然后用待检测靶蛋白得抗体(一抗)与细胞内
靶蛋白进行免疫反应,再用荧光素(如 FITC 与 TRITＣ等)标记得二抗与一抗进行反应、这样?就在细胞内形成免疫复合物(靶蛋白 --－-一抗－—-二抗),结果靶蛋白被标上颜色,然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果。
免疫荧光技术最大优点就就是可用来检测细胞内源性蛋白得定位及相互作用。当然也可以对?靶细胞进行转染表达目得蛋白,然后
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标记目得蛋白进行观测。免疫荧光技术得缺点就是荧光相对?较弱并且背景较高,结果受到干扰,所以这项技术不好掌握、为了结果得可靠性,要求严格设?
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.doczj.com/doc/491337705.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是和其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，和抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体和其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术
第十一章蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions) 1. 概况 随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。因此，蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。下面以Wnt 信号通路为例对此加以说明。 Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。Wnt信号通路的作用分子包括：Wnt蛋白家族成员、卷曲(frizzled) 蛋白、Dishevelled蛋白、β-联蛋白(β-catenin)、轴蛋白(axin)、结肠癌抑制因子(APC)、糖原合酶激酶(GSK3β)、β-TrCP蛋白、淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF) 等。当没有Wnt信号时，GSK3β、APC、axin组成破坏复合体，使β-联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。细胞核内，转录抑制因子Groucho家族成员与转录因子TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。当有Wnt信号传入时，通路中的下游分子Dsh抑制了破坏复合体的作用，β-联蛋白在胞质中积累进入核内，TCF与入核的β-联蛋白结合，导致其与Groucho的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的转录。 从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面： ⑴多亚基蛋白质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠 杆菌DNA合成复合酶等。 ⑵多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。 ⑶瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。 这类相互作用几乎参与调节细胞内基本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。 除了蛋白质修饰以外，其他过程如转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨膜运输、新生肽链的折叠、也包含了瞬时的蛋白质相互作用。 2. 蛋白质相互作用的研究策略与方法 2.1生化方法 2.1.1蛋白质亲和层析 ⑴方法 在一定的条件下，某种蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖(Sepharose) 上，用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质，抽提物过柱后，用低盐溶液洗脱下未结合的物质，然后用高盐溶液或SDS 洗脱下结合在柱上的蛋白质。有时污染物的存在会影响相互作用的结果，因此蛋白质纯化是蛋白质亲和层析成功的前提。 ⑵蛋白质的纯化方法 获得纯化蛋白质的一个简单方法就是利用融合蛋白，目前常用的融合蛋白为谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)，可以在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。其他的还有staphylococcus蛋白A可在含IgG的柱上纯化；含少数组氨酸的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可以在含直链淀粉的柱子上纯化。
蛋白质相互作用的主要研究方法
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A 或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆
蛋白质相互作用的主要研究方法． 蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作
用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性
相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting 分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克 隆．
金属离子与血清白蛋白的相互作用 一、实验目的： 测定过渡金属离子对蛋白质功能的影响 二、实验原理： 金属离子在许多生命过程中发挥关键作用，研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要内容，是化学和生命科学研究的前沿领域。血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质。由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯，从上世纪50年度（国内80年代末）开始，人们对血清白蛋白与金属离子（和药物分子等）的相互作用展开了大量研究，以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。 许多蛋白质含有金属离子，金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用。在人体基因组编码的蛋白质中，超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离子；所有酶中，超过40%的蛋白质含有金属离子，它们在生命活动过程中发挥着各样的生物学功能。许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。 目前用于研究金属离子与蛋白质相互作用的研究方法主要有：（1）紫外-可见吸收光谱法；（2）荧光光谱法；（3）平衡透析法；（4）毛细管电泳法；（5）电泳法等。 （一）紫外-可见光谱法 蛋白质通常有3个明显不同的紫外吸收带：（1）210nm以下的吸收来自肽键的吸收以及许多构象因素；（2）210-250nm为芳香族和其他残基的吸收、某些氢键的吸收、与其他构象和螺旋相关的相互作用等多种因素；（3）250-290nm附近为芳香族的残基，其中酪氨酸残基在278nm（Tyr，260-290nm）附近有强吸收，色氨酸残基（Trp）在290nm附近有强吸收，而苯丙氨酸（Phe，250-260nm）的吸收较弱。外界因素如溶剂极性以及pH等会影响吸收光谱。 当金属离子与蛋白质结合时，蛋白质或金属离子吸收光谱的强度或者谱带位置会发生变化，可分为两种情况：（1）蛋白质微扰的金属离子光谱变化，可以推断金属离子的配位环境；（2）金属离子微扰的蛋白质光谱变化，可以推断生色基微环境及蛋白质结构的变化。通过对光谱的比较分析和计算，可以推断金属离子与蛋白质的结合情况。
Protein-Protein Interactions
Protein Structure ?The fundamental unit of protein structure is a domain. ?This region of a polypeptide chain folds into a distinct structure and mediates the protein’s biological functionality.
Abstract View of Protein Structure ?Proteins are represented as shaded areas and the domains as geometrical figures. ?We assume that protein domain (or domain combination) interactions are responsible for protein interactions.
Gen ome: 30.000 genes Transcript ome: 40-100.000 mRNAs Prot eome: 100-400.000 proteins >1.000.000 interactions Dimensions of Information Complexity Genomics vs. Post-Genomics Human Genome Human Proteome Transcripts Protein Interaction 105 106
检测两种蛋白质之间相互作用检测 两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1.生化方法 ?免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ? Far-Wester n 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2.等离子表面共振技术(Surface plasm on reso nance )该技术是 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互
作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3.双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和 激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如 果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造 成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5.荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（＜100 埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可 以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互 作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP 给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross - linKing ）,蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display ）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。
1. 生物信息学的定义及主要研究内容 利用计算机存储、检索、分析、预测生物分子组成与结构的科学 2. 目前世界上主要的基因组数据库、蛋白质序列数据库及蛋白质结构数据库是什么 基因组数据库：GenBank、EMBL、DDBJ；蛋白质序列数据库：SWISS-PROT 、PIR、NCBI 蛋白质数据库；蛋白质结构数据库：PDB 3. Sequence alignment 的定义是什么？ 将两个序列的各个字符（代表核苷酸或者氨基酸残基）按照对应等同或者置换关系进行对比排列，其结果是两个序列共有的排列顺序，它是序列相似程度的一种定性描述 4. 什么是多重序列比对 多重序列比对研究的是多个序列的共性。序列的多重比对可用来搜索基因组序列的功能区域，也可用于研究一组蛋白质之间的进化关系。 5. 什么是BLAST？ 是Basic Local Alignment Search Tool 基本局部比对搜索工具的英文缩写。 6. BLAST包含哪些子程序，分别有什么功能？ BLAST 包含5个子程序： blastn为核酸—核酸比对程序，用户输入一个核酸序列可以找到NCBI核酸数据库中与该序列最相似的序列。 blastp为蛋白—蛋白比对程序，用户输入一个蛋白质序列可以找到NCBI蛋白数据库中与该序列最相似的序列。 blastx为核酸—蛋白比对程序，用户输入一个核酸序列，程序会将其按照6种读码形式翻译成蛋白质序列，然后在NCBI蛋白数据库中找到与该序列最相似的序列。tblastn为蛋白—核酸比对程序，用户输入一个蛋白质序列，程序按照氨基酸密码子将蛋白序列转换成核酸序列，然后在NCBI核酸数据库中找到与该序列最相似的序列。tblastx为核酸—核酸比对程序，用户输入一个核酸序列，程序会将其按照6种读码形式翻译成蛋白质序列，同时将数据库中的核酸序列也按照6种读码形式翻译成蛋白质序列，然后比较转换后的蛋白质序列相似性，进而找到核酸数据库中与该序列最相似的序列，该程序运算量很大，比对速度也最慢。 7. 在序列相似性较差的比对中，blastn 参数如何设定更可能找到相似序列？ 降低Expect threshold，降低Word size。 8. 在NCBI数据库中refseq_rna 和refseq_genomic 分布代表什么数据库，有什么特点？refseq_rna为参考rna数据库，refseq_genomic 为参考基因组数据库，参考数据库都是经过人工审核的数据库，具有较高的可信性。 9.什么是FASTA格式？ 文件第一行以大于号开头，随后为任意文字说明，第二行为序列信息，使用核酸或氨基酸序列符号。 10. 在BlastP程序中PAM模型和BLOSUM模型分别用于哪种搜索。 PAM模型可用于寻找蛋白质的进化起源，而BLOSUM模型则用于发现蛋白质的保守域。 11. Blast结果中的E-value是什么？ 12. 如何进行电子克隆？电子克隆时需要注意哪些事项？ 13. 构建进化树有哪些常用的方法，哪些适合于远缘序列进化树构建？ MEGA5 工具栏中的Phylogeny提供5种常用系统进化树的构建方法： Maximum Likelihood, ML最大似然法 Neighbor-Joining，NJ 临位连接法 Minimum-Evolution，ME 最小进化法
蛋白质与蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）研究方法概述目前检验蛋白质之间相互作用的实验方法主要有：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）、噬菌体展示技术（Phage display）、串联亲和纯化-质谱（Tandem affinity purification-mass spectrometry, TAP-MS）以及GST pull-down。其原理与适用范围如下： （1）酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 实验原理：双杂交系统的建立基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与，转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。在酵母双杂交系统中，“诱饵”蛋白X（也就是已知的蛋白）克隆至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；待测试蛋白Y克隆至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。一旦X与Y蛋白间有相互作用，则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近，恢复行使功能，激活报告重 组体中基因的表达。 图解： 说明：其中，UAS即upstream activating sequence，上游激活序列。 适用范围：已知一种蛋白X，在体内（in vivo）筛选与其相互作用的蛋白，但前体是需预备一批可能与已知蛋白X相互作用的蛋白Y。 （2）噬菌体展示技术（Phage display） 实验原理：将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体。 图解： 适用范围：已知一种蛋白，在体内（in vivo）筛选与其相互作用的蛋白。不过正好与酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）反过来，先准备一个展示库，然后用已知蛋白X去筛选。 （3）串联亲和纯化—质谱（Tandem affinity purification-mass spectrometry, TAP-MS） 实验原理：在靶蛋白质一端嵌入一个特殊的蛋白质标签(TAP tag)，不破坏靶蛋白质调控序列，且靶蛋白质表达量与体内水平相当；经过两步连续的亲和纯化获得接近自然条件的特定蛋白质复合体，后用质谱技术或Edman降解法进行蛋白质鉴定。 图解：