生物工程下游技术期末作业
青霉素的分离提纯方法的发展与比较
摘要：本文主要介绍了青霉素的分离提纯方法的发展以及比较，包括传统的方法，如吸附法，沉淀法，溶剂萃取法等，也包括现代发展的高新技术，如反胶团萃取法，乳状液膜法，中空纤维更新液膜法以及其它的高效提取方法。
Abstract：This paper describes the development of penicillin G and the comparison of methods of separation and purification , including traditional methods, such as adsorption, precipitation, solvent extraction, but also includes modern high-tech development, such as reverse micelles extraction, emulsion liquid membrane hollow fiber renewal liquid membrane extraction and other efficient methods.
正文：
1、青霉素简介
1、1基本性质：青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。
分子式为：
1、2发展历程：早在唐朝时，长安城的裁缝会把长有绿毛的糨糊涂在被剪刀划破的手指上来帮助伤口愈合，就是因为绿毛产生的物质（青霉素素菌）有杀菌的作用，也就是人们最早使用青霉素。
近代，1928年英国细菌学家弗莱明首先发现了世界上第一种抗生素—青霉素，1941年前后英国牛津大学病
理学家霍华德·弗洛里与生物化学家钱恩实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，弗莱明、弗洛里、钱恩三人共同获得1945年诺贝尔奖。目前所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成。由于不同种类的抗生素的化学成分不一，因此它们对微生物的作用机理也很不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。[1]
1、3化学性质：青霉素可以与金属或有机碱结合成盐,常有钠盐、钾盐、普鲁卡因盐和节星盐。青霉素盐的化学名称是(25,SR,6R)一3,3一二甲基一6一(2一苯乙酞氨基)7一氧代一4-硫杂一1一氮杂双环[3.2.0]庚烷一2一甲酸钠(钾)盐"青霉素的钠盐!钾盐均为白色结晶粉末;无臭或微有特异性臭,有引湿性;遇酸碱或氧化剂迅速失效,在水中极易溶解乙醇中微溶。[2]
1、4分类：青霉素用于临床是40年代初，人们对青霉素进行大量研究后又
发现一些青霉素，当人们又对青霉素进行化学改造，得到了一些有效的半合成青霉素，70年代又从微生物代谢物中发现了一些母核与青霉素相似也含有β－内酰胺环，而不具有四氢噻唑环结构的青霉素类，可分为三代：第一代青霉素指天然青霉素，如青霉素G（苄青霉素）；第二代青霉素是指以青霉素母核－6－氨基青霉烷酸（6－APA），改变侧链而得到半合成青霉素，如甲氧苯青霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素；第三代青霉素是母核结构带有与青霉素相同的β－内酰胺环，但不具有四氢噻唑环，如硫霉素、奴卡霉素。
按其特点可分为：青霉素G类、青霉素V类、耐酶青霉素、氨苄西林类、美西林及其酯匹西林、甲氧西林类。1本文主要针对青霉素G的分离提纯方法进行综述。
2、青霉素G分离提纯方法比较
2、1传统的分离提纯方法
青霉素的大规模生产采用的是生物发酵法,其分离提纯包括过滤、提取、共沸结晶等工序。传统的青霉素发酵液提取工艺主要有吸附法、沉淀法、溶剂萃取法、离子交换和树脂吸附法,目前在青霉素提取中普遍采用的是溶剂萃取法。
2、1、1吸附法
吸附法系利用吸附剂与抗生素之间的分子间吸引力而将抗生素吸附在吸附剂上。吸附剂有活性炭、三氧化二铝、白土、大孔吸附剂等，其中以活性炭应用得最早。有研究表明在较低的pH值下,青霉素v可以吸附到中性的芳香族吸附剂上,并且随着pH值的降低,青霉素v的吸附量增加,而在较高的pH值下,青霉素V 易溶于水,几乎无法利用青霉素V被吸附的特点来吸附提取，由于青霉素V是热敏性物质,且稳定性差,吸附法由于操作周期较长而造成青霉素的损失,所以只进行了实验室规模的研究。
2、1、2沉淀法
沉淀法是分离抗生素的最简单而经济的方法,浓缩倍数高。它是利用抗生素能和某些无机、有机离子或分子形成复合物而沉淀,此外也可利用本身的等电点沉淀析出，然后将沉淀物在适宜的条件下,再进行分离精制而得到提纯的目的。青霉素生产可以通过加入无毒的弱酸或部分有机强酸到青霉素发酵滤液或盐溶液中调节pH值获得酸性相对较弱的酸离解常数常选择在(1.3一6.6)×10一5的一元脂肪酸,如乙酸、丙酸等,或二元脂肪酸,如丁二酸等，强酸的离解常数至少为1.7x l0-1如硫酸、盐酸、磷酸、柠檬酸等，酸化过程中强酸的存在可以使青霉素沉淀完全，为了获得较高的收率,通常先加入弱酸,然后缓慢加入强酸或部分强酸与弱酸同时加入,大部分青霉素沉淀后,加入剩余的强酸。
利用沉淀法直接从发酵液中回收分离和提纯青霉素优点很多,如节省或不用溶媒,收率高;操作费用降低;设备简单,工艺路线短;对经基青霉素酸化后存在于液相中等但是在青霉素酸化过程易形成豁性的油状物,过滤处理存在一定的问题。
2、1、3溶剂萃取法
溶媒萃取法(液一液萃取法):当抗生素以不同的化学状态存在于(游离酸或游离碱状态)与水不溶性的溶媒中,有不同的溶解度,利用分配系数不同而达到浓缩和提纯的目的。在较低的pH值时,大部分青霉素G以未解离酸分子形式存在,在水中溶解度较低但易溶于有机溶剂,因此可用溶剂萃取技术提取青霉素。溶剂萃取分物理萃取和反应萃取两大类"目前在青霉素提取过程中普遍采用的是碳一
键合氧给予体类型的萃取剂,即碳氢化合物和取代的碳氢化合物溶剂,在pH值为2.0左右进行萃取青霉素,萃取收率服从分配定律,称为物理萃取。
工业上一般采用醋酸丁醋为萃取剂,在pH值1.8一2.2时进行萃取生产，青霉素在一定酸性条件下呈游离酸状态,在醋酸丁醋中的溶解度远大于在水中的溶解度,青霉素从水相转入醋相,水溶性杂质留在水相"把互不相溶的醋相与水相分开后就实现了水溶性杂质与青霉素的分离"工业上的提炼流程如下:
2、1、4离子交换和树脂吸附法
青霉素G的生产采用生物合成法,其分离提纯过程包括过滤!提取!共沸结晶等一系列分离和纯化过程。近年来,随着青霉素扩产,产量激增,造成供过于求的状况,为了提高行业竞争力,科技工作者围绕完善现有萃取过程和进行新技术开发两个方面进行了大量研究工作，青霉素提纯工艺的进展主要集中在改进工艺、方法、设备几方面，离子交换法系利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力,有选择性的将抗生素吸附上去,然后用较少量的洗脱剂将它洗下来,从而达到浓缩和提纯的目的。
目前,离子交换和树脂吸附技术主要用于从青霉素提取，结晶后得到的废液中回收青霉素以及在青霉素水解生产6~ARA过程中去除苯乙酸以降低其浓度，离子交换和树脂吸附技术用于青霉素提纯,收率偏低,解吸困难,并且其规模与产量很难适应青霉素的大规模生产。[3]
2、2新型青霉素G提取方法
2、2、1双水相萃取
双水相分配技术是近年来发展起来的提取和纯化生物活性物质的新型分离方法之一，一般而言,双水相系统是指把两种聚合物或一种聚合物与一种盐的水溶液混合在一起,由于聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性而形成互不相溶的两相。
近年来, 一种新型绿色溶剂——离子液体的出现引起各国学者的广泛关注. 离子液体是指在由离子组成的室温时呈液态的液体, 一般由有机阳离子和无机阴离子组成. 改变阴阳离子组成, 可以合成不同性质的离子液体, 被称为“设计者溶剂”.。离子液体几乎没有蒸气压, 不挥发.，离子液体分为疏水性和亲水性两种类型, 研究表明, 疏水性离子液体萃取红霉素得到很好的效果。
刘庆芬[4]等以亲水性离子液体[Bmim]BF4和 NaH2PO4·2O 水溶液形成的双水相体系为研究象,考察了影响双水相形成的因素以及青霉素 G 的萃取特性.特别考察了 NaH2PO4浓度、青霉素浓度以及[Bmim]-BF4的浓度对双水相的形成和
萃取率的影响, 同时考察了萃取体系 pH 值变化以及乳化现象。结果发现：(1) 离子液体双水相可以有效萃取青霉素, 轻相中青霉素萃取率可达 93.7%. 萃取率受成相盐浓度、初始青霉素浓度以及离子液体浓度的影响. 萃取的最佳参数为NaH2PO4·2H2O 36%~38%(质量分数)、青霉素浓度50000 u/mL、离子液体40%~45%(体积分数).。离子液体双水相萃取青霉素是一项高效分离青霉素的新技术。(2) 离子液体双水相体系萃取青霉素的 pH 值在4~5 之间, 为弱酸性, 青霉素降解率降低, 萃取收率提高.。萃取过程不发生乳化现象, 有利于两相分离。
2、2、2反萃取法
2、2、2、1连续反萃取
连续反萃取是根据BA中青霉素含量把碳酸氢钾水溶液按一定比例加入到混合罐,进行充分混合反应,而后用离心机进行分离,得到RK。连续反萃取BA和碳酸钾是连续加入,混合液不断进入离心机进行分离,整个过程是连续性操作,由于BA效价是变化的,所以碳酸钾水溶液的加入量要随时进行调整,以控制PH值。在生产过程中造成PH值大范围的波动,影响收率和产品质量。为了减小PH值的波动,通常采用低浓度的碳酸氢钾水溶液进行反萃取。得到的RK效价偏低,通常在60万、1/ml以下。
2、2、2、2间歇反萃取
间歇反萃取是在混合罐中一次性加入一定量的BA,经计算加入适量的碳酸氢钾水溶液,进行充分混合,使之完全反应,再静止分层。此时萃取液是在重力作用下分层的,分离后得到RK。在这个过程中,首先测定混合罐中的BA效价,再依照公式进行计算,得出加入碳酸氢钾水溶液的量,所以能准确地控制PH值。由于PH值易于控制,可以提高碳酸氢钾溶液的浓度,以达到提高RK效价的目的。RK 效价可以提高到80万u/ml左右。
梁玉等[5]通过对这两种工艺的研究比较得到如下的数据表格，表明间歇反萃取方法分离提纯青霉素G的效力更好。
2、2、3反胶团萃取
反胶团是一种新型生物活性物质的分离方法,最初应用于具有鲜明等电点的氨基酸、蛋白质类物质的分离。吴子生[6]等在室温和pHS一8的条件下进行了青霉素G的反胶团相转移提取研究,提取率在90%以上"离子强度及pH对青霉素萃取率，反萃取率的影响不大,但是离子强度对蛋白质的萃取率影响很大,因此可利用这些特点将杂蛋白除去。
2、2、4超临界流体萃取
超临界流体萃取是新型的提取技术,它以超临界条件下的气体作为萃取剂,从液体或固体中萃取出某些成分并进行分离，与一般液体萃取相比,S死的萃取速率和范围更为扩大,选择适宜的溶剂如CO2,可在较低温度或无氧环境下操作,分离、精制热敏性物质和易氧化物质;SFE还具有良好的渗透性和溶解性,能从固体或粘稠的原料中快速提取有效成分;无溶剂污染,且回收溶剂无相变过程,能耗低;兼有萃取和蒸馏的双重功效。[2]
但由于超临界流体萃取法中青霉素的溶解度较低,利用超临界流体从发酵液中提取抗生素还有待进一步研究。
2、2、5膜分离技术
邵文尧[7]等在对膜技术的研究中发现膜通量、加水及洗涤效果、滤液质量及过滤收率、清洗及系统运行的稳定性对于膜过滤的效率有很大影响。
而运用膜过滤滤技术与其它过滤方法相比具有以下优越性:过滤时无须添加絮凝剂,节省了大量絮凝剂成本的支出;过滤收率高,损失较少;滤液质量高,澄清透亮,不乳化;由于采用菌丝体与大部分蛋白一步截留过滤法,操作工艺流程简化,操作成本降低;系统实行系统封闭过滤,且可实现全自动控制,滤液不受人为污染,排渣无须手动,操作劳动强度减轻;由于系统独特的结构设计、系统设计及配套的清洗方案,使系统的稳定性、效率、抗污染能力及适用于高粘度料液过滤的能力较其它过滤方法具有显著的优越性。
2、2、5、1微滤和超滤
青霉素G生产的第一步就是从发酵液中提取菌丝体,传统的提纯工艺采用过滤和昂贵的离心设备,这些工艺不但能耗高,由于分离过程中产品残留在菌丝体滤饼层,不能达到100%的回收率,需要后续的深度洗脱、微滤和超滤技术目前己应用于发酵液中青霉素的提纯。
2、2、5、2中空纤维更新液膜萃取技术
中空纤维膜萃取器是指萃取器中包含一束具有微孔的中空纤维,两种液相分别在纤维的内侧(管程)和外侧(壳程)流动,两相界面固定于纤维壁的微孔中并调节适当的压力维持其稳定。纤维膜壁既做为防止乳化的屏障又起到两相通过膜孔进行传质的支撑体的作用，中空纤维膜萃取技术能够克服液膜萃取稳定性差的缺点,同时由于其非分散性使得该萃取过程不会产生乳化现象,由于没有混合,也不存在分相的问题,且传质效率较高,用于萃取性分离过程时,其过程设计及放大比传统的分散型装置简单。
高磊[8]等以有机磷类萃取剂为载体，对中空纤维更新液膜萃取溶液中青霉素G 的过程进行研究。采用依靠中性络合萃取的 TBP 对青霉素 G 有较好的萃取性能，可作为有机液膜相的载体；水溶性性小、有破乳和协萃作用的异辛醇可作为液膜相添加剂。确定了TBP-异辛醇-煤油为体系的中空纤维更新液膜萃取青霉素G 的工艺过程。
研究结果表明，管程混合流体中有机相在水相中的含量对过程传质性能的影响较小；由于随着中空纤维膜器管程流体流速的增大，两相的接触时间减小，液膜过程的传质通量下降，料液相中青霉素G 的去除率降低；而随着壳程流速的增大，壳程内料液侧水相过界层变薄，水相边界层内的传质阻力减小，过程的传质通量增大，料液侧青霉素G 的去除率增大。
2、2、5、3液膜技术
液膜萃取技术用于青霉素提取可实现萃取/反萃取过程祸合,是当前青霉素分离领域的另一个研究热点，其技术原理都是在料液相和反萃相之间引入一层与
料液相和反萃相不相混溶的萃取相液膜,利用这一液膜实现分隔两相并对溶质分子进行选择性传递的作用，溶质分子在浓差推动力的作用下,从料液相主体扩散迁移到料液相与液膜相的界面,进入液膜相;在液膜内经扩散到达液膜与反萃相的界面,再进入反萃相。
该方法也被称为同级萃取一反萃过程,在这一过程中,促使溶质分子跨过液膜进行传质的推动力是料液相与反萃相之间的浓度或pH值差。用于青霉素提取的液膜萃取技术主要是乳化液膜(ELM)、支撑液膜(SLM)两大类。
与传统的液一液萃取相比,液膜萃取具有如下优点:(1)能提供比较大的相界面积,渗透速率高,两相接触时间短;(2)可以连续再生,溶剂使用量很少;(3)在萃取和转移过程中,溶剂的损失很少;(4)只要两水相间的pH梯度能够维持,溶质就可能逆浓度梯度转移"图[11]展示了利用乳化液膜过程反应萃取青霉素G的作用机理。
吴汉奇[9]等采用W/O型乳状液膜提取模拟发酵液中的青霉素,考察膜相添加剂、表面活性剂、载体、解析剂碳酸钠浓度、搅拌速度对青霉素传质和液膜溶胀的影响。以span80为表面活性剂、三辛胺为流动载体、液体石蜡为膜相添加剂、煤油为膜溶剂组成的乳状液膜体系。
结果表明：青霉素提取率随表面活性剂和载体浓度的增加而明显增加。但表面活性剂浓度增加使液膜易产生再乳化，而再乳化和搅拌是夹带溶胀产生的主要原因；水的渗透（渗透溶胀）随载体和内相碳酸钠浓度升高而增加。液膜溶胀是影响液膜技术工业化应用的关键因素之一。适宜的液膜配方和操作条件，有利于控制液膜溶胀，增加青霉素的提取率。在本研究中，青霉素的提取率最高可达91.5%液膜溶胀率为16%。
但是张瑞华[10]等对于乳状液膜法分离青霉素G的研究发现乳状膜的选择性差、稳定性低以及回收得率低的问题还需要进一步研究去解决。
3、总结
通过对青霉素的各种分离提纯方法分析比较我们可以发现现在的技术手段越
来越多，越来越先进，也越来越科学化，但是同样我们应该认识到现在主要的工厂提纯方法还是传统的溶剂萃取法，所以在研究新技术的同时，我们也应该尽可能的对于优良的传统技术进行优化与改造。
4.参考文献：
茶叶中茶多酚的提取分离纯化重庆大学课程论文 学生姓名：何英 学号：20161902017t 专业：生物学 学科门类：理学 重庆大学生物工程学院 二O一六年十月
摘要 茶叶中含有600多种化学成分，组分极为复杂。茶叶中的无机矿物质有27种，大多数都是人体健康所必须物质。茶叶中的有机物茶多酚与儿茶素类物质、咖啡碱、茶多糖等决定了茶叶色泽、香气、滋味、营养及保健功效。本文总结了茶多酚为主要内容物的提取纯化及性质为主要内容，对比不同方法的优异，按要求选择一条合适的工艺路线。溶剂浸提法工艺简单、技术成熟。离子沉淀法选择性强、纯度较高但是损失大、收率低、安全性低。树脂吸附法虽工艺简单、纯度高、能耗低但是溶剂用量大、成本高。超临界流体萃取法纯度高但是设备要求高、成本高，不适合大剂量的提取茶多酚。超声波浸提法高效、节时、提取率高但噪音污染，不适合长期使用。微波浸提法高效、节能、节时、提取率高但具有微波辐射。膜分离法工艺简单，环境污染小但纯度低。所以根据不同的要求、设备、成本需要选择不同的方法。 关键词：茶叶，茶多酚，提取方法
1绪论 茶叶起源于我国，后流传于世界。至今，地球上引种茶树的国家已经达到了60多个，近年来世界茶叶种植面积总数达290万公顷[1]。我国是产茶大国，进入21世纪以来，我国的茶产量稳居世界第一[2]。科学研究和临床医学实验表明，茶叶有降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、抗辐射等诸多保健作用，这与茶叶中的有效功能成分密不可分。茶叶中的有效成分包括茶多酚、茶多糖、咖啡碱、茶氨酸、茶蛋白等。所以，用中低档茶叶为原料，提取分离有效成分，大力发展茶叶深加工技术，不仅可以开辟中低档茶叶市场、充分利用茶叶资源，也将成为我国茶叶行业发展的新方向。 茶多酚作为茶叶中最主要的功能性成分，使其成为目前天然产物研究的热点，由于具有多种生理活性和功能，在医疗保健、食品行业、日用品等领域都得到了广泛的应用。因此，优化提取工艺，分离提纯茶多酚具有十分重要的经济和社会效益。目前，国内茶多酚生产企业基本上采用的是溶剂法制备茶多酚，该方法生产周期长，温度高，所制备的茶多酚含量和活性低，且由于在生产过程中使用氯仿等有机溶剂，不仅操作不安全，产品还存在有毒溶剂残留问题，其品质难以满足国内外市场的需求，造成茶多酚产品销售困难，大量积压，同时溶剂法对环境的污染较大，不符合绿色化生产发展的方向。因此，需要选择一条合理，绿色，创新的生产工艺，提高茶多酚产品的质量，实现资源、环境、经济、社会一体化发展。
青梅素的提炼工艺过程 青霉素提纯工艺流程简图： 青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。 1.预处理 发酵液结束后，目标产物存在于发酵液中，而且浓度较低，如抗生素只有10－30Kg/m3，含有大量杂质，它们影响后续工艺的有效提取，因此必须对其进行的预处理，目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。是进行分离纯化的一个工序。 2.过滤 发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10 ℃以下，过滤收率一般90%左右。 （1）菌丝体粗长10μm，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。 （2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。 3.萃取 青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。选择对
青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择1.8-2.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择 6.8-7.4。发酵滤液与乙酸丁酯的体积比为1.5-2.1，即一次浓缩倍数为1.5-2.1。为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。发酵液与溶剂比例为3－4。几次萃取后，浓缩10倍，浓度几乎达到结晶要求。萃取总收率在85％左右。 所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.0~3.0，加入醋酸丁酯，用量为滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶液调pH7.0~8.0。在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。 萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应在低温下进行（10 ℃以下）。萃取罐冷冻盐水冷却。 4.脱色 萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。 5.结晶 萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。然后采用重结晶方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于KOH溶液，调pH 至中性，加无水丁醇，在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。 直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液，得到青霉素钾盐。 共沸蒸馏结晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃取，pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇，16－26℃，0.67-1.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。
酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。
青霉素生产工艺 摘要：青霉素是一种重要的抗生素，在目前的制药工业中占有举足轻重的地位，生产规模非常大。通过数十年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病，增强了人类治疗传染性疾病的能力。研究和优化其生产工艺对人类健康有重要意义。 关键词;青霉素；生产工艺 抗生素在目前的制药工业中仍占有举足轻重的地位，尤其是下游半合成抗生素的发展，进一步刺激了上游的工业发酵。一些抗生素的工业生产规模非常大，如β-内酰胺类的青霉素、头孢菌素C，大环内酯类的红霉素、利福霉素，氨基环醇类的链霉素、庆大霉素。其它的一些抗生素，如林可霉素、四环素、金霉素、万古霉素等，单个发酵罐容积越来越大，100 m3的发酵罐被普遍采用，200 m3甚至更大容积的发酵罐经常可见报道。 抗生素的工业生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。种子和发酵培养基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有机酸等，主要为菌体生长代谢提供能源，为合成菌体细胞和目的产物提供碳元素。有机氮源多用玉米浆、黄豆饼粉、麸质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等，硫酸铵、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸铵则是常用的无机氮源。另外，培养基中还得添加无机盐、微量元素以及消沫剂，部分抗生素还得加入特殊前体，如青霉素的前体是苯乙酸，大环内酯类抗生素的前体是丙酸盐。发酵过程普遍补加一种碳源、氮源物质，如葡萄糖和硫酸铵。pH值通过流加氨水进行调节，很多抗生素在发酵中后期流加前体，对提高产量非常有益。抗生素发酵绝大多数为好氧培养，必须连续通入大量无菌空气，全过程大功率搅拌。发酵液的预处理，一般加絮凝剂沉淀蛋白，过滤去除菌丝体，发酵滤液的提取常用溶媒萃取法、离子交换树脂法、沉淀法、吸附法等提纯浓缩，然后结晶干燥得纯品。现在来介绍一下青霉素的生产工艺。 一、青霉素概述 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。最初青霉素的生产菌是音符型青霉菌，生产能力只有几十个单位，不能满足工业需要。随后找到了适合于深层培养的橄榄型青霉菌，即产黄青霉（P. chrosogenum），生产能力为100U/ml。经过X、紫外线诱变，生产能力达到1000－1500U/ml。随后经过诱变，得到不产生色素的变种，目前生产能力可达66000－70000U/ml。青霉素是抗生素工业的首要产品。中国为青霉素（penicillin）生产大国，国内生产的青霉素，已占世界产量的近70%，国内较大规模的生产企业有华药、哈医药、石药、鲁抗，单个发酵罐规模均在100 m3以上，发酵单位在70000 U/ml左右，而世界青霉素工业发酵水平达100000 U/ml以上。 青霉素应用 临床应用：40多年，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。 二、发酵条件下的生长过程
常用的分离纯化手段 分离 发布日期:2012-8-1有效日期至:2013-1-28查看联系方式 发布单位: 杭州哲博化工科技有限公司分析检测中心查看该会员所有的供求信息查看该会员所有的产品信息 常用的分离纯化手段 资深专家团队---专业检测机构---精准分析服务----先进仪器设备--雄厚技术实力赵老师18 96 8197 425 哲博检测中心，浙大国家大学科技园提供【各种精细化工和高分子材料性能检测，成分分析，配方还原，工艺失效分析】【名校科研院所博士领衔、专业分析专家】 关键词：分离纯化配方分析成分分析 1. 化学分离法 蒸馏与分馏 分离沸点与挥发度相差较大组分的有效方法。有常压蒸馏，减压蒸馏，水蒸气蒸馏。适用于混合液体及液固的分离。 萃取 利用物质在不同溶剂中溶解度的不同和分配系数的差异，使物质达到相互分离的方法。适用于液固，液液的分离。 提取 利用不同的溶剂，从固体样品的基体中，使某种组分得到分离和浓缩。主要利用索氏提取器。如高聚物与填料，高聚物材料中微量助剂的提取与浓缩处理。缺点：①易引起热不稳定的组分变质②溶剂中的杂质也被浓缩③溶剂用量大 结晶与沉淀（溶解沉淀法） 利用样品中各组分在溶剂中的溶解度差异，使某些组分从浓溶液中生成结晶分离出来，是纯化物质的一种有效的方法。适用与高聚物的分离。 过滤与膜分离 过滤是分离液-固非均一体系常用的分离方法。适用于>1μm的颗粒。 膜分离适用于分离< 1μm的胶体颗粒。分为固体高分子膜，阳离子膜，阴离子膜。 灰化，酸化，微波消解—用于无机物的分离。 2. 色谱分离法： 柱色谱法—分离有机化合物的有效手段。分为： 硅胶填充柱—适用于分离大多数弱极性，中等极性和较强极性的化合物。 氧化铝填充柱—适用于分离非极性，弱极性化合物 聚酰胺填充柱—可用于染料，表面活性剂的分离。 阳离子交换柱—分离阳离子，适用于阳离子表面活性剂。 阴离子交换柱—分离阴离子，适用于阴离子表面活性剂。 凝胶色谱法 分为： 凝胶过滤色谱（GFC）—用于分离水溶性大分子。 凝胶渗透色谱（GPC）—用于有机溶剂中可溶的高聚物分子量分布分析及分离。 薄层色谱法—适用于有机化合物的分离。 纸色谱法—主要用于强极性和水溶性化合物，如氨基酸，糖类，有机酸及盐等的分离，亦可用于多种金属阳离子，阴离子的分离与鉴定。 气相色谱法—热稳定好，易挥发的中，小分子量的有机化合物的分离。
天然产物分离 覆盖:2000到2007年中期： 自1990年代以来,天然产物研究的兴趣大大增加。以下几个突出的发展领域的分离方法,光谱技术,和敏感的生物,自然产物研究获得了新的关注提供新颖的化学实体。这个更新审查处理样品制备和净化,最近提取技术用于天然产物分离、液固和液-液分离技术,以及多步骤的色谱操作。它涵盖了NPR以来发表的论文审查的例子“现代分离方法”马斯顿和Hostettmann 1主要强调开发和自2000年以来的研究方法。 1 介绍 天然产品预计将发挥重要作用的新药的主要来源在未来几年,因为（1)自己无与伦比的结构多样性,(2)他们中许多人的尺寸相对较小(< 2000 Da),(3)“药物样”的特性,即被吸收的能力和metabol-ised。2隔离来自高等植物的天然产品,因此海洋生物和微生物仍然迫切需要,要求先进的方法分离和隔离程序。考虑,一个植物可能包含成千上万的选民,分离和isola-tion过程冗长而乏味的。隔离的天然产物通常结合了各种分离技术,取决于溶解性、波动性和稳定的化合物分离成为可能。不同的分离步骤的选择是非常重要的和分离的分析规模优化参数是值得的。 马斯顿和hostett曼1描述分离的方法有离心薄层色谱（第七所），超压层色谱法（OPLC），闪光色谱（FC），液相色谱[低压液相色谱法（LPLC），高压液相色谱（MPLC），高压液相色谱法（HPLC）]，和[逆流色谱液滴逆流色谱（DCCC），旋转室逆流色谱（RLCC），离心分配色谱法（CPC）]。最近文献的评价表明，第七所，OPLC，RLCC，和DCCC 2000以来很少使用。俱乐部还经常使用但主要为多级分离过程的一部分。主要分离技术是近年来液相色谱等色谱、半制备高效液相色谱方法，以及党，主要为高速逆流色谱（HSCCC）或高性能离心分配色谱（HPCPC）。多步色谱操作大多被应用，例如结合FC预净化和半制备hplcfor最终净化 2 纯化样品的制备 几个样品的制备，预净化和清理的步骤是天然产物分离和/或分析之前使用。低极性溶剂提取率较最初的脂溶性成分，而乙醇溶剂中获得更大的频谱的非极性和极性物质。如果有更多的极性用溶剂提取步骤，随后第一溶剂分区允许更精细的划分为不同极性部位。提取方法（见3节）因此，作为预纯化步骤选择性地去除干扰成分和/或分离出的活性化合物。其他预纯化的方法是过滤，沉淀，去除叶绿素，蜡和单宁，固相萃取（SPE）采用预包装盒和各种包装材料，正常和反相硅胶或其他合适的包装材料，如氧化铝，硅藻土短柱，琥珀建兴树脂和Sephadex LH-20。预包装盒上操作–SPE固相萃取液的原理可用于两种模式之一：a）干扰矩阵元素的样品保持在墨盒而感兴趣的成分洗脱；b）感兴趣的部分被保留而干扰矩阵元素洗脱。在后者的的情况下，浓度可以达到效果。所需的化合物，然后从盒洗脱溶剂的改变 3 用于分离和提取分离技术 在天然产物分离分析的第一步是提取分离的化合物从细胞基质。并从固体溶质的萃取回收可以视为一五个阶段：（一）从矩阵的活性位点的复合解吸；（ii）扩散在矩阵本身；（iii）在萃取分析物的增溶作用；（iv）在萃取剂的化合物的扩散；（五）所提取的溶质集合。理想的情况下，提取过程中应详尽相对于成分被分析或孤立的，快速的，简单的，廉价的，和–至少常规分析–适合自动化。在植物和海洋次生代谢产物的兴趣日益增加，有必要拓展和
中药资源功能成分利用技术课程论文 姓名：王林 学号：SX20180417 年级：2018级 专业：药用植物资源工程 任课老师：陆英老师 指导老师：程辟老师
天然产物分离提取技术研究进展 随着我国加入WTO，仿制药品必将逐渐受到限制，这将给我国医药行业带来巨大冲击和严峻挑战。我国拥有13亿人口，药品市场潜力股与供给量与日俱增。因此，探索与开发出具有自主知识产权的新药物责任重大。我国自古以来依靠中草药繁衍生息。因此，从天然产物方面着手，研究与开发新药物，将拥有广泛的市场前景与经济效益。天然药物大多来自植物、动物、矿物和微生物，并以植物来源为主。天然药物之所以能够防病治病。其物质基础是其中所含的有效成分。我国地域辽阔，天然产物资源丰富，种类繁多，为新药的开发提供了广阔的资源和得天独厚的条件[1]。 天然产物活性成分包括有黄酮、多酚、萜类等几百种，其分子主要特点有：相对分子质量较低，从几百到几千，具有一定的极性，可溶于许多有机溶剂中。天然活性成分的提取是中药现代化的重要组成部分，但目前中国中药主要是传统的中药丸、散等药剂，经济效益低。而以天然产物为主的保健食品和药物目前具有相当的市场。但由于对中药中真正有效的成分并不了解，或由于分离纯化困难，很难达到和国际接轨的要求。在天然产物分离纯化上有所突破，开发高效的天然产物分离方法对彻底改变中国天然产物开发层次低，生产方式粗放，技术落后有重要作用，对中国中药现代化及改造和提升传统中药行业有重要意义，而且纯化后的天然产物本身可形成新的经济增长点。 天然产物是药物研发中极具潜力的原料资源，分离纯化天然产物
中具有独特生物活性的物质是中药研究的重要基础工作。天然产物有效成分复杂、含量低、难于富集。用传统的分离方法不仅步骤繁琐，能源及材料消耗大，而且产率及纯度不高，尤其难以分离结构和性质相似的组分。随着中药现代化的发展，高新技术不断在天然药物中推广应用。现将近年天然产物提取分离纯化新技术的进展作一概述。 膜分离技术以选择性透过膜为分离递质。当膜两侧存在某种推动力(如压力差、浓度差、电位差等)时，原料侧组分选择性的透过膜，以达至分离、提纯目的。膜分离技术具有过程简单、无相变、分离系数大、节能、高效、无二次污染、可常温连续操作、直接放大等优点。是一项高新技术。膜分离技术在中药领域中的应用将推动中药现代化发展进程。同时还能提高我国中药的附加值，有利于中药出口。可以展望，膜分技术必将在21世纪推动中药制药工业的迅速发展，为社会带来巨大的经济效益和社会效益。 高效毛细管电泳法是近年来迅速发展的一种新型分离分析技术，以高质电场为驱动力以毛细管为分离通道依据样品中各组分之问的迁移速度和分配行为上的差异而实现的类液相分离技术。该技术用于分析中草药，具有以下优势：分离模式多，适合于中草药中存在的各类物质的分析；简化对样品前处理的要求；分析时间一般比HPLC短；由于柱效高，有可能使同一个分离条件适合多种样品中多组分的分析；HPCE所采用的毛细管柱易于全面清洗，不必担心柱污染而报废：所用的化学试剂少、价廉、分析成本低，特别适合于我国国情。 超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
天然产物提取分离新技术 ■常温超高压技术 高压生物化学研究已经证明：压力达到一定值，蛋白质、多糖（淀粉、纤维素）等有机大分子会发生变性，但生物碱、低聚糖、甾、萜、苷、挥发油、维生素等小分子物质则不发生任何变化。 在高压生物化学的研究中还证明了：高压灭菌的机理是，压力作用于微生物，使细胞壁变性、破裂，细胞内容物外泄，从而使微生物致死。在肉、鱼、水果、蔬菜的高压加工中也证实了细胞的这种变化。 超高压提取就是利用了超高压对生物材料的这种作用实现有效成分提取的。植物细胞壁上有很多微孔，因此我们可以把植物细胞壁看作是由许多微孔组成的薄膜。当植物细胞处于溶剂中时，溶剂将通过这些微孔进入细胞内部。 1.升压时： 通过渗透作用，溶剂进入细胞内部；由于我们施加的压力非常大，因此通量很大，细胞内部在短时间内就会充满溶剂。 细胞内部充满溶剂后，细胞壁两侧压力平衡。 2.保压时： 细胞内容物与进入细胞内部的溶剂接触，经过一段时间，有效成分溶于这些溶剂中。 3.泄压时： 细胞外部的压力减小为零，细胞内部的压力仍然保持平衡时的压力，此时压力差与施加压力时方向相反。由于我们施加的是超高压，因此这种反方向的压力差仍然是很大的。 4.在反方向压力作用下，细胞壁变形；如果变形超过了其反向变形极限，细胞壁破坏；于是，溶解了有效成分的溶剂泄出，与其它溶剂汇合。 5.如果在反方向压力作用下细胞壁的变形仍然没有超过其反向变形极限，细胞内部已经溶解了有效成分的溶剂将通过渗透作用排出，与其它溶剂汇合。由于反方向压力差非常大，因此溶解了有效成分的溶剂快速且完全地泄出。
常温超高压提取技术可以使用多种溶剂，包括水、不同浓度的醇和其它有机溶剂，可以从不同的天然产物中提取不同性质（如生物碱、黄酮、皂甙、多糖、挥发油）的有效成分。 ■超声波提取技术 超声波是一种高频率的机械波。超声场主要通过超声空化向体系提供能量。频率范围在15-60kHz的超声，常被用于过程强化和引发化学反应，超声波在天然产物有效成分提取等方面已有了一定作用。其原理主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放，超声波使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的回流提取、索氏提取发比较，具有提取速度快、时间短、收率高、无需加热等优点。已被许多天然产物分析过程选为供试样处理的手段。 ■微波辅助提取技术 微波是一种非电离的电磁辐射。微波辅助提取（Microwave Assisted Extract ion，MAE）是利用微波能来提高萃取率的新发展起来的技术。被提取的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，可以保证能量的快速传递和充分利用，易于溶出和释放。微波辅助提取（以下简称微波提取）的研究表明，微波辐射诱导萃取技术具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分收率高的特点，已被成功应用在药材的浸出、中药活性成分的提取方面。它的原理是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰撞、挤压，这样有利于有效成分的浸出，提取过程中，药材不凝聚，不糊化，克服了热水提取易凝聚、易糊化的缺点。 微波萃取技术有一定的局限性，只适宜于对热稳定的产物。 ■酶法提取技术 天然植物的细胞壁由纤维素构成，其中的有效成分往往是包裹在细胞壁内。酶法就是利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等（主要是纤维素酶），破坏植物的细胞壁，以利于有效成分最大限度溶出的一种方法。酶反应可以较温和的将植物组织分解，从而大幅度提高提取效率。 ■分子蒸馏技术
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 纯化方案是由几种纯化方法组成的，一般选择的依据是从抽提液中有效成分和
总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。 萃取分离法 溶剂萃取法原理： 利用物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同而进行的分离 设法使一种溶解于液相的物质传递到另一液相的操作 pH影响分配系数-表观分配系数 双水相萃取原理：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程 反胶束萃取原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。 超临界萃取原理：当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：流体的密度接近于液体的密度,粘度接近于气体；在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感； 固相析出分离法 盐析法原理： 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。 破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。 破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。 有机溶剂沉淀法原理： 1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。 等电点沉淀法原理： Pl时分子表面静电荷未零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。 成盐沉淀法原理： 1.金属离子沉淀 所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。 蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。 分离沉淀→复合物分解→除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA） 2.有机酸类复合盐 含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。 亲和沉淀法原理：
几类类天然产物的提取分离方法
几类类天然产物的提取分离方法 本人总结了一些分离方法，以抛砖引玉！ 总述 1)提取前文献查阅综述和药材生药鉴定2)提取方法 ①粉碎成粗粉 ②有机溶剂法和水提法③水蒸气蒸馏法④升华法 3)分离纯化法 ①根据物质溶解度的不同进行分离 a.温度不同,溶解度不同 b.改变溶液的极性去杂 c.酸碱法 d.沉淀法 ②根据物质分配比不同极性分离 a.液-液萃取法 b.反流分布法 c.液滴逆流层析法 d.高速逆流层析法 e.GC法 f.LC法:LC分配层析载体主要有---硅胶,硅藻土,纤维素等;有正反相之分;压力有低、中、高之分;载量有分析、制备之分。 ③根据物质吸附性不同极性分离 a.※极性吸附剂（如SiO2,Al2O3...)极性强，吸附力大 ※非极性吸附剂(如活性炭－对非极性化合物的吸附力强(洗脱时洗脱力随洗脱剂的极性降低而增大)。 b.化合物的极性大小依化合物的官能团的极性大小 而定; 溶剂的极性大小可按其介电常数大小排列 （极性渐大> ）: 己烷苯无水乙醚CHCl3 AcOEt 乙醇甲醇水e 1.88 2.29 4.47 5.20 6.11 26.0 31.2 81.0 c.氢键力吸附聚酰胺吸附层析--洗脱剂的洗脱力由小到大为: 水> 甲醇> 丙酮> NaOH液> 甲酰胺> 尿素水液 ④根据物质分子的大小进行分离 如葡萄糖凝胶(Sephadex G and LH-20...)过泸法等 ⑤根据物质解离程度不同的分离法离子交换法： 强酸：-SO3H 强碱：-N+(CH3)3Cl- 弱酸：-CO2H 弱碱：-NH2(NH,N) 一、糖及苷类的提取和分离 1 溶剂处理法 2 铅盐沉淀法 3 大孔树脂处理法 4 柱色谱分离法 二醌类化合物的提取和分离 一提取方法: 一般选用甲醇或乙醇为溶剂，可同时将游离态和成苷的蒽醌类化合物从药材中提取出来，浓缩后再依次用有机溶剂提取（多用索氏提取法），可根据极性大小不同进行初步分离（如将苷和苷元分开）。
项目三：青霉素的生产 一、实验相关知识 1、青霉素又被称为青霉素G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、 青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称,由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。 2、1929年英国学者弗莱明首先在抗生素中发现了青霉素，英国谢菲尔德大学病 理学家弗洛里实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，与英国生物化学家钱恩共获1945年诺贝尔奖。青霉素分为天然的和半合成的，天然的青霉素是通过菌种发酵得到的。 3、理化性质： （1）溶解度：青霉素本身是一种游离酸，易溶于有机溶剂，但在水溶液中溶解度很小。 （2）吸湿性：青霉素的吸湿性与其内在质量有关；纯度越高，吸湿性越小，也就易于存放。 （3）稳定性：青霉素的水溶液是一种不稳定的化合物，而晶体状态比较稳定。（4）酸碱性：青霉素的分子结构中有一个酸性基团（羧基），无碱性基团。4、常见的化学反应： （1）青霉素的碱性水解 （2）青霉素的酸性水解（完全水解和不完全水解） （3）青霉素的裂解 5、青霉素应用的注意事项： ①应用青霉素前应做皮试 ②青霉素不可与同类抗生素联用，不可与磺胺和四环素联合用药， 不可与氨基糖苷类混合输液。 ③宜短期使用，切忌长期大量给药，以免血药浓度持续升高，导致 致敏物质的形成与堆积，造成过敏反应。 ④通常静脉给药，宜慢不宜快，以每分钟不超过60滴的速度静脉滴 注，以免血药浓度增高过快而增加分解过敏可能。 ⑤青霉素的副作用中，过敏性休克是致命的，常引起人们的注意，而表 现为脑病及周围神经损害的神经毒性作用易被忽略。必须打消以往认为青霉素只要不过敏，就很少有中毒的观念，千万不要大剂量滥用青霉素（包括其它抗生素），必须用时，尽量少用静脉输注，老年人、小儿尤应慎用；此外，还须注意，青霉素与氨苄青霉素合用时，更易引起青霉素脑病的发生。 二、生产原理 （1）青霉素是产黄青霉菌株在一定的培养条件下发酵产生的。生产上一般将孢子悬液接入种子罐经二级扩大培养后，移入发酵罐进行发酵，所制的的含有一定
和泰The lab Pure water technology 水纯化方法简介 1.微孔过滤法 微孔过滤法包括三种类型：深层过滤(depth)、筛网过滤(screen)及表面过滤(surface)。深层滤膜是以编织纤维或压缩材料制成的基质，利用随机性吸附或是捕捉方式来滞留颗粒。筛网滤膜基本上是具有一致性的结构，就像筛子一般，将大于孔径的颗粒，都滞留在表面上(这种滤膜的孔径大小是非常精确的)，而表面过滤则是多层结构，当溶液通过滤膜时，较滤膜内部孔隙大的颗粒将被滞留下来，并主要堆积在滤膜表面上。 由于上述三种滤膜的功能不同，因此对滤膜之间的分辨非常重要。由于深层过滤是一种较为经济的方式，可去除98%以上的悬浮固体，同时保护下游的纯化单元不会败坏或堵塞，因此通常被作为预过滤处理。表面过滤可去除%以上的悬浮固体，所以也可作为预过滤处理或澄清用。微孔薄膜(筛网滤膜)一般被置于纯化系统中的最终使用点，以去除最后残留的微量树脂碎片、碳屑、胶质颗粒和微生物。例如：μm微孔滤膜，其可滤过所有的细菌，通常用于将静脉注射用的液体、血清及抗生素进行除菌用。 2.活性碳吸附法 有机物可能是阳离子、阴离子或非离子性的物质，离子交换树脂可去除原水中一些可溶性的有机酸和有机碱(阴离子和阳离子)，但有些非离子性的有机物却会被树脂包覆，这过程称为树脂的“污染阻塞”现象，不但会减少树脂的寿命，而且降低其交换能力。为保护离子交换树脂，可将活性碳过滤器安装在离子交换树脂之前，以去除非离子性的有机物。 活性碳的吸附过程是利用活性碳过滤器的孔隙大小及有机物通过孔隙时的渗透率来达到的。吸附率和有机物的分子量及其分子大小有关，某些颗粒状的活性碳较能有效的去除氯胺。活性碳也能去除水中的自由氯，以保护纯水系统内其他对氧化剂敏感的纯化单元。 活性碳通常与其他的处理方法组合应用。在设计纯水系统时，活性碳与其他相关纯化单位的相关配置，是一项极为重要的项目。 3.反渗透法 反渗透(RO)法是可达到90%~99%杂质去除率中最经济的方法。RO膜的滤孔结构较UF膜还要致密，RO膜可去除所有的颗粒、细菌以及分子量大于300的有机物(包括热源)。
第三章天然药物化学成分的常用分离纯化方法§1．概述 一、研究分离纯化技术的重要性 （一）制备工艺研究的重点 原料经提取加工所得的提取物通常是一个成分复杂的混合物，只有经过进一步地分离纯化，才能得到纯度较高的化学成分。 提取 检识除去部分或全部杂质 提取物目标成分 （杂质＋化学成分）（纯度提高） （二）检测分析研究的重点 天然产物工作中，无论原料或终产品，经常会是混合物；这些含有杂质成分的样品，检测分析之前，一般都需要做前处理，以便除掉干扰分析的杂质，否则，检测分析工作常常难以进行。 要除掉待测样品中的杂质，同样需要分离纯化技术： 待测样品供试样品检测分析 分离纯化 除掉干扰检测 分析的杂质组分 由上述可见，分离纯化同样也是检测分析的研究重点 二、研究分离纯化方法的基本思路 动、植物原料的提取物的化学组成经常是很复杂的，往往含有几十、几百甚至近千种成分（包括微量成分）。 要从众多成分中分离纯化某种化学成分，其难度可想而知，究竟应当如何着手呢？ 其实我们只要抓住一个重要的基本思路，就可以使许多看似困难的分离工作，变得比较容易，这个思路就是： 寻找差异、利用差异 决定分离难易的关键：不在于成分多少, 而在于差异大小。 只要存在显著差异，从上千种成分中分离出某种成分也未必困难；反之，如果差异微小，即便是两种成分的分离，也会相当棘手。 学习和研究分离纯化技术，重在把握思路，切忌生搬硬套，死记硬背，应当重视培养“善于寻找差异和利用差异”的良好习惯。 尽管天然产物中成分众多，然而只要细心研究，总能发现被分离成分之间的某些差异。在分离纯化工作中可以利用的差异是很多的，其中最常利用的有四类差异： 溶解度（或分配系数）、酸碱性（或解离度）、吸附性、分子量 以下，我们便对此进行研究探讨。 前处理
青霉素 （一）青霉素的前世今生 提起抗生素来，我想青霉素类药物最为人们熟悉，就连医学教材《药理学》抗生素类药物内容中，青霉素也首当其冲。当“青霉素”这个名字为大家所熟悉时，青霉素的发现者却随着时光的流逝，不经意间被置于记忆的角落。尽管随着时光流逝，记忆飘落，青霉素背后的故事依然闪烁着迷人的光辉。1928年9月15日，弗莱明揭开了青霉素的面纱…… 亚历山大·弗莱明，这个名字随着历史沉淀，已经鲜为人知。1881年，弗莱明出身于农民家庭，家境贫寒，因为父亲的去世，家庭经济越发拮据。不过，弗莱明在求学路上却有奇缘。弗莱明的父亲生前曾无意救了偶然跌落于粪池里的少年丘吉尔（即二战时期著名的英国首相）一命，丘吉尔的父亲为了答谢弗莱明父亲，提出愿意资助弗莱明求学。后来，弗莱明来到伦敦，考上了圣玛丽医学院。在那里，弗莱明跟随大名鼎鼎的皇家学会教授、伤寒菌及疫苗研究专家阿尔莫罗斯·赖特进行相关研究，开始了他为之付出一生的事业——细菌学研究。1928年这年的7月下旬，弗莱明将众多未经清洗的细菌培养基摞在一起，搁在阴暗的位置，就去休假了。而来源不明的青霉菌孢子就那么落入培养基，发生了意想不到的反应。9月3日，弗莱明回到实验室，顺手拿起顶层一个培养基，竟然发现培养基边缘有一部分细菌被溶解了。当年的气温记录显示，在7月28日至8月10日，伦敦有十分难得的凉爽天气，适合青霉菌先行生长，并产生
青霉素。而8月10日以后，气温回升，葡萄球菌刚“冒头”，就被青霉菌制造的青霉素杀死了。1929年6月，弗莱明发表了关于青霉素的论文，最终获得了诺贝尔奖医学奖。 虽然弗莱明奇迹般地邂逅了青霉素，但他并未真正明白它的药用价值。使青霉素大放异彩的，是以弗洛里和钱恩为主要成员的牛津小组，他们分离纯化青霉素，推动青霉素的研究，使它成为药物，并首先用于二战战场。1941次年，美国有20多家公司开始大量生产青霉素。青霉素从硝烟滚滚的战场，迅速走向平凡大众，拯救了无数生命[1]。 （二）庐山真面目 青霉素类代表药：按抗菌谱和耐药性划分 窄谱苄青霉素（注射），抗菌作用很强，低浓度抑菌，高浓度 杀菌。苯氧甲青霉素，抗菌强度与苄青霉素相同，因为能 抵御胃酸，所以可以口服。 耐酶甲氧西林（注射）、氯唑西林和氟氯西林（注射或口服均 可）。抗菌作用不及苄青霉素，主要用于耐苄青霉素的金 黄色葡萄球菌。 广谱氨苄西林和阿莫西林。疗效与苄青霉素相当，但对耐药的 金黄色葡萄球菌无效，特点是均可口服。而羧苄西林和哌 拉西林则只能注射，主要用于抗铜绿假单胞菌。