1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取上清液，然
后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；
140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进
行抗凝。此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g 离心10分钟。将上清液以无菌PBS以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g 保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。
3、
为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。
外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录）2A）冷冻离心机50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯
瓶（见表3.22）0.1）
注意：所有离心均应在4℃下进行。
1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g，4℃下离心30分钟。
2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。在12,000×g，4℃下离心45分钟。
3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表
3.22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时。
4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。
5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。
6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。
7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。
8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储存长达1年。精品文档word文档可以编辑！谢谢下载！
外泌体提取详细步骤及方法 1、差速离心 差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤，包括低速离心去除细胞和凋亡碎片；更高速离心以消除更大的囊泡；最后高速离心沉淀外泌体： 300×g离心10分钟，取上清。 2000×g离心10分钟，取上清。 10，000×g离心30分钟，取上清。100，000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100，000×g离心90分钟。 2、密度梯度离心 该方法将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒分离，例如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体。因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体。但是，合适的离心时间非常重要，否则如果它们具有相似的密度，则仍可在外泌体中发现污染颗粒。 3、尺寸排阻色谱 尺寸排阻色谱（Size-exclusion chromatography，SEC）是基于大小而非分子量实现分离大分子。该技术应用填充多孔聚合物微球的柱子，分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。此外，可以将不同的洗脱溶液应用于该方法。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，这可能会改变囊泡的结构。目前，SEC是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。不过，该方法耗时较长，不适合大量样本处理。 4、过滤 超滤膜也可用于分离外泌体。根据外泌体的大小，从蛋白质和其他大分子中分离外泌体。最常见的过滤膜具有0.8μm、0.45μm或0.22μm的孔径，可用于收集大于800nm、400nm或200nm的外泌体，也有设计成微柱多孔硅纤毛结构以分离40-100nm外泌体：不过，该方法由于过滤膜的粘附，可能会损失外泌体，并且过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。 5、基于聚合物的沉淀技术 基于聚合物的沉淀技术通常包括将样本与含聚合物的沉淀溶液混合，在4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇（PEG）。用
1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10 min，吸取 上清液，然后2 000×g离心10 min；吸取上清液后，10 000×g 高速离心30 min，吸取上清液；140000×g超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000×g 再次离心90 min，100 μL PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于-80℃备用。 2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小 时而不进行抗凝。此后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS 以1：1的比例稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS，通过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。 3、 为了从体液（例如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只需通过常规方法收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储存长达5天，直至进行外泌体纯化。 外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该方案已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。
基本方案1中指出的所有预处理也适用于该方案。材料液体（例如，血浆：通过Ficoll离心与血细胞分离;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录） 2A）冷冻离心机 50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心机和固定角度或摆动式转子（见表 3.22.1）适用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22） 0.1） 注意：所有离心均应在4℃下进行。 1.用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g，4℃下离心30分钟。 2.将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3注释）。在12,000×g，4℃下离心45分钟。 3.小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据处理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时。 4.将沉淀重悬于1ml PBS中，并将其在其中一个管中汇集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。 5.通过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。 6.在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 7.将沉淀重悬于1ml PBS中，然后用PBS填充管。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。 8.将沉淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储存长达1年。
外泌体分离提纯草案 By 朱旭峰 一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清） 1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比 1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma） 1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地 细胞和残渣。超速离心于120,000_g (Sorvall WXULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃.2 小时 1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g (Sorvall WXULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃.2 小时 1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中 1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL 的样品置于卡上，用Direct Detect?(Millipore) 2材料 a)细胞培养液 b)蛋白酶抑制（Sigma） c)过滤筛(Millipore) d)冷的PBS e)低粘附的管 f)Direct Detect?(Millipore) 二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆） 1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂 (Sigma) 1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃ 1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来去 除较大的囊泡、 1.4此阶段的样品可以 1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃ 1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).， 1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬 1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏 2.材料
提取锂的方法总结 矿石提锂的方法主要有硫酸法、硫酸盐法、石灰烧结法、氯化焙烧法，纯碱压煮法等，现综述如下： （一）、硫酸法 硫酸法从锂辉石中提取碳酸锂是当前比较成熟的矿石提锂工艺，其工艺流程如图1-1所示。此方法先将天然锂辉石在950-1100℃焙烧，使其由单斜晶系的α-锂辉石转变成四方晶系的β-锂辉石，由于晶型转变，矿物的物理化学性质也随着晶体结构的变化而产生明显变化，化学活性增加,能与酸碱发生各种反应。然后将硫酸与β-锂辉石在250-300℃下焙烧，通过硫酸化焙烧发生置换反应，即可生成可溶性硫酸锂和不溶性脉石，反应方程式如下： β-Li2O·Al2O3·4SiO2+H2SO4=Li2SO4+H2O·Al2O3·4SiO2 以上即为硫酸法从锂辉石中提取碳酸锂的工艺原理。 由文献：田千秋，陈白珍，陈亚，马立文，石西昌.锂辉石硫酸焙烧及浸出工艺研究. 稀有金属，2011，35(1)：118-123.得到具体操作步骤如下： ①焙烧，称取一定质量的锂辉石放于回转窑中1000-1100℃焙烧30min； ②冷却磨细，将其磨细到200目以下； ③酸化焙烧，硫酸（93%-98%）用量为理论用量的140%，焙烧温度250℃，焙烧时间为30min； ④水浸，将酸化熟料用去离子水进行搅拌浸出，浸出最佳条件为：常
温反应15min，液固比为； ⑤分离，浸出结束后加入C aCO3迅速中和至pH 左右，使部分铁铝进入渣中，过滤得到浸出液；浸出液通过净化后即可用于碳酸锂的提取。 图1-1 （二）硫酸盐法 硫酸盐法是用硫酸钾与天然锂辉石烧结，使矿石中的锂转变为硫
酸锂，通过熟料溶出即可使锂从矿石中进入溶液。在处理锂辉石时，烧结过程中不仅伴随着α-锂辉石的晶型转变，同时也存在着离子交换反应。实际上，该反应是α-锂辉石先转换成结构较疏松且易于反应的β-锂辉石,然后发生离子交换反应的。在加热烧结过程中，总的化学反应是： α-Li2O·Al2O3·4SiO2+K2SO4=Li2SO4+K2O·Al2O3·4SiO2 该反应是可逆的，为了使反应更加充分地向右进行，在工艺上需加入过量的K2SO4，然而由于K2SO4价格贵，故常常采用以Na2SO4部分替代K2SO4。但如果全部用Na2SO4代替K2SO4，可能生成“锂辉石玻璃”严重影响后续浸出工序，所以只能以Na2SO4部分替代K2SO4。硫酸盐法不仅可以处理硅酸盐矿，而且也可以处理憐酸盐矿。 此方法的优点是它具有通用性，几乎能分解所有的含锂矿石。缺点是若不用Na2SO4替代部分K2SO4，即消耗大量的钾盐，最终导致生产成本较高、产品也常被钾污染。 由文献：张婉思，王远明，李擎.硫酸盐法从锂云母中制取碳酸锂的工艺路线研究. 化学世界，2010，34-36.得到具体操作步骤如下：①焙烧，焙烧阶段的优化条件为：温度940℃，时间120 min，配比 锂云母：K2SO4：Na2SO4：CaO=20：：:； ②浸出，第一步：水浸。将焙烧产物按液固比3：1溶于水中，搅拌 半小时，然后静置抽滤。对滤渣进行三级浸取，将滤液合并； 第二步：酸浸。由于水浸使得80%的Li、80%的Na、30%的钾进入溶液中，需要进一步酸浸，以提高Li的浸出率，浸出操作同上，
外泌体，带来革命变革的小不点（三）——外泌体捕获分离 外泌体天然存在于体液中，在包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中广泛分布，而且，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；但是，想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。今天，小优专题给您带来的就是外泌体研究的最关键步骤——外泌体捕获与分离这一部分的技术讲解与解决方案。 外泌体分离的传统方法为差速超速离心法和密度梯度超速离心法等，差速超速离心法是目前外泌体提取最常用的方法。简单来说是将细胞培养液或体液等样本依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，质量不好，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。另一种常用的外泌体分离方法为密度梯度离心法，将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法。用于密度梯度离心法的介质要求对细胞无毒，在高浓度时粘度不高且易将pH调至中性。实验中常用蔗糖密度梯度离心法，在离心法的基础上，预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100 000 g离心16 h，外泌体会沉降到等密度区(1.10~1.18 g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。而且，这两种传统方法都需要用到超速离心机，设备昂贵，耗时长，一次最多只能做6个样品，效率低，并且需要大量的样品才能得到足够多的外泌体。 接下来小优就为您带来优宁维为您提供的高效外泌体捕获与分离技术，帮您远离枯燥乏味的超速离心，快速高效制备高质量的外泌体。话不多说，亮技术，上产品：首先闪亮登场的是简单的一步法分离外泌体，实验原理如下图： 一步法分离外泌体原理示意图 该技术的优势有节省时间，小体积样本适用（可从100 μl血浆中分离出足量外泌体），无需超速离心和其他预富集方式，试剂方便储存于运输（4℃保存）等。 除了一步法分离外泌体的技术外，小优还为您提供免疫捕获法，包括免疫微球产品与免疫预制板产品。首先我们来看免疫微球捕获分离外泌体的技术原理：
细胞培养基上清提取外泌体 外泌体产生细胞（Exosome源细胞）的选取： 293T细胞：常用于基因改造外泌体； Mouse immature dendritic cells（imDCs）：小鼠未成熟的树突细胞，常用于小鼠in vivo 体内反应使用，产生的外泌体引起的免疫反应极小； Mouse lymphoma cell line（EL-4）：小鼠淋巴细胞； 各类癌细胞系：常用于研究各个癌产生的外泌体本身特性研究: …… 不同实验的需求不同， Exosome源细胞的细胞选择不同，例如：需要基因改造就选择较容易感染的293T，体内实验就要避免机体的免疫反应，要充分了解实验要求和各个细胞系背景。 Exosome源细胞用量： 以293T为例，2个15cm盘=4.5个10cm 盘=4*107 cells，最终的Exosome 20ul/20ul 可用于体内原位癌3*104/1ul注射给药，15ul/50ul 可用于105 受体细胞培养加药。 P S: 王红阳方法1ug Exosome=5*106 cells，原位癌注射用量5ug，105细胞培养用量1ug。我约莫算了一下，差不多。楼上的方法不要定量，更简单方便，以楼上为主。 以293T细胞为例制备Exosome： 1.2盘10cm 盘在60-70%进行病毒感染，1盘感染GFP（control病毒），1盘感染plv-cs 2.0-myc-PD1，病毒感染后16-18h后换液； 2.36-48h后进行传代：准备10盘10cm盘，每盘加入15ml Exosome-free的10%血清的DMEM，放入37°C培养箱备用。取出2感染好的2盘细胞，迅速用5ml PBS/遍洗涤3遍，加入1ml胰酶，摇匀使每个细胞都孵育胰酶，37°C静置消化1min，加入4ml Exosome-free 的10%血清的DMEM静置，获得5ml细胞悬液，加入到准备好的10盘10cm盘中，获得5盘GFP、5盘plv-cs2.0-myc-PD1稳转293T 细胞系，37°C培养48h； 3.取4根灭菌处理过的50ml管，收集细胞培养基，分装成37.5ml GFP、plv-cs2.0-myc-PD1各两管，进行三步法离心： ?4°C离心200-300g，5min去细胞，分别小心吸取上清34ml入新的灭菌50ml 管； ?4°C离心12,000-16,000g，45min去碎片，分别吸取31ml上清入新的灭菌50ml 管，0.22um滤膜（Millipore）过滤，最后62ml左右汇入一管Beckman快速密 封管Beckman Quick seal tubes； ?Beckman 70Ti 转子4°C超离100,000-110,000g，90-120min，弃上清，用50ul PBS重悬exoxome。 3’.收取上清，进行三步法离心：200-300g 5min去细胞；12,000-16,000g 45min去碎片，0.22um滤膜过滤，用100kDa的超滤管（Millipore）将上清浓缩至200ul，加入15ml PBS 浓缩至50ul。 4.取 1、3、5、15ul/50ul 的Exosome 加入105受体细胞中，培养48h，观察或检测目的基因、药物的摄入情况。（GFP观察荧光，RNA用RT-PCR，蛋白用WB）。
如何分离纯化、鉴定外泌体 外泌体相关研究逐渐从小众走向大众，受到越来越多的关注，涌现了一大批的外泌体课题。但大家还是感觉外泌体研究好难啊！为什么呢？首要原因就在于该领域里还木有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法。今天就来给大家聊一聊如何搞定外泌体研究中的第一步。 一、分离 超速离心法: 超速离心法是外泌体分离最常见的技术之一。据不完全统计，约有1/2的研究者会选择该种方式分离外泌体。该方法由几个离心步骤组成，可分步去除细胞、细胞碎片和大囊泡，沉淀外泌体（如图所示）。但该种方法用于血浆和血清等粘性生物液体时效率较低，且重复离心操作有可能对外泌体造成损害，从而降低其质量。 如将超速离心配合蔗糖溶液进行梯度密度离心可得到纯度更高的外泌体，是公认可以得到最高纯度的分离方法。但此法对离心时间非常敏感，一般需要8-30h，产率较低，同样不适用于血浆和血清等粘性生物液体中外泌体的分离，因此难以广泛普及。 聚合物沉淀法: 第二大主流的外泌体分离技术就是基于聚合物的沉淀法了，最常见的聚合物是聚乙二醇（PEG）。通常将含有聚合物的沉淀溶液与生物体液混合，4℃温育，低速离心，沉淀外泌体（如图所示）。目前已有成熟的PEG-base商业试剂盒，比如图中的ExoQuick?（System Biosciences）。这类试剂盒使用容易和快速，不需要额外的设备，且随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。沉淀法的主要缺点是分离物中会有少量的聚合物存在。不过大家不用担心，一般来说这些物质不会干扰下游分析，使用商业试剂盒提取外泌体也受到越来越多杂志的认可。
二、鉴定 外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。如果大家看过外泌体研究相关的文献，就肯定对一张图印象深刻。 不错，想发外泌体文章，光找到高效率的分离方法还不够，要过的第二关就是证明你分离得到的就是外泌体。鉴定方式不外乎就是下面这三种：1. 形态学（电镜）；2. 粒子大小（径粒分析）；以及3. 标志蛋白（WB）。综合来说，透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等，属于鉴定方法中的金标准，其他两种方式则常常作为辅助使用。
外泌体是大多数细胞分泌的40 - 150nm的膜泡，存在于细胞培养基、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水等生物液体中。越来越多的证据表明，这些囊泡充当细胞信使，将信息 传递给身体内的细胞和组织。外泌体包含细胞特异性蛋白、脂质和RNA，它们被运输到其他细胞，并改变其他细胞的功能或生理作用。这些外泌体可能在介导对感染性病原体和肿瘤的 适应性免疫反应、组织修复、神经通讯和病原蛋白转移方面发挥作用。 如何提取各种样本类型中的外泌体呢？艾美捷科技作为专业的生命科学领域解决方案供应商，为您推荐Norgen Biotek品牌的外泌体提取试剂盒： 1.血浆/血清外泌体提取试剂盒：（Plasma/Serum Exosome Purification Midi Kit；57500）。 使用血浆/血清外泌体提取试剂盒从1 mL和10 mL血浆中纯化的完整外泌体，使用NanoSight?LM10仪器观察如下图：
【血浆/血清外泌体提取试剂盒-各品牌横向对比】
Norgen的试剂盒分离出55 nm外泌体，回收率为每毫升血浆9.64 x 1013颗粒。另外与其他两种竞争对手相比，从1mL血浆中纯化的外泌体覆盖50nm-150nm的更宽尺寸范围，血浆浓度更高。 2.尿液外泌体提取试剂盒（Urine Exosome Purification Midi Kit；57800）： 图4使用尿液外泌体提取试剂盒从10 mL尿液中纯化的完整外泌体与使用超速离心发相比，使用NanoSight?LM10仪器观察如下图：
经过Norgen的试剂盒纯化的外泌体大小从65nm到195nm，总回收率为7.63×108个颗粒/ mL。【尿液外泌体提取试剂盒-各品牌横向对比】
广东化工 https://www.doczj.com/doc/484270708.html, 2019年第2期第46卷总第388期 -23 - 大鼠血清外泌体不同提取方法的比较 罗哲斯，钟成勇，秦转，李艳文，毛建文* *［收稿日期］2018-11-28 ［基金项目］广东省高等学校“千百十工程”人才培养项目(2015cxqx214) ［作者简介］罗哲斯(1992-),女，广东清远人，硕士研究生，主要研究方向为分子药理学。 *为通讯作者：毛建文，男，湖南人，博士，教授，主要从事离子通道蛋白与疾病及外泌体功能的研究。 (广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006) ［摘 要］目的：比较大鼠血清外泌体的不同提取方法，优化PEG 聚沉法。方法：分别采用差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法及优化 后的PEG 聚沉法提取分离血清外泌体。通过Western Blotting 检测外泌体标记蛋白：透射电镜观察形态。结果：Western Blotting 检测出外泌体 的标记蛋白：电镜下观察到差速超速离心法和优化后的PEG 聚沉法提取的外泌体粒径在100 nm 左右，呈双层膜结构，试剂盒法和PEG 聚沉法 提取的外泌体形态大小不一，杂质偏多。结论：优化后的PEG 聚沉法能成功提取血清外泌体，此方法操作简便、耗时短、成本低，是可靠且有 效的外泌体提取方法。 ［关键词］血清；外泌体；PEG ；差速超速离心；试剂盒［中图分类号］TQ ［文献标识码］A ［文章编号］1007-1865(2019)02-0023-02 Comparison and Optimization of Different Methods for the Extraction of Rat Serum-derived Exosomes Luo Zhesi, Zhong Chengyong, Qin Zhuan, Li Yanwen, Mao Jianwen * (School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou 510006, China) Abstract: Objective: To compare different extraction methods of rat serum-derived exosomes and optimize PEG coagulation to obtain more efficient and practical extraction techniques. Methods: Serum exosomes were extracted and separated by differential ultracentrifugation method, kit method, PEG coagulation method and optimized PEG coagulation method. The exosomal marker proteins were detected by Western blotting; the morphology was observed by transmission electron microscope.Results: The expression of exosome labeled protein HSP70, CD63 and TSG101 in exosomes protein obtained by all four extraction methods could detected by Western blotting. The exosomes extracted by differential ultracentrifugation method and optimized PEG coagulation method show a particle size of about 100 nm and a double-layer membrane structure under transmission electron microscope. The exosomes extracted by the kit method and PEG coagulation method were impurities and not uniform in size. Conclusion: The optimized PEG coagulation method was successfully used to extract and separate rat serum-derived exosomes. Compared with the existing methods, this method has the advantages of easy operation, short time-consuming, low-cost and effective. Keywords: Serum ； exosomes ； PEG ； differential ultracentrifugation ； Exo Quick 1前言 外泌体是指包含了多种mRNA 、miRNA 和蛋白质的微小囊 泡，直径在30?150nm 之间，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构。 1987年，Johnstone 将其命名为"exosome"⑴。其主要来源于细 胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜 融合后释放到胞外基质中［2】。Tucci M 等人研究发现，转移性黑素 瘤患者的血清中能提取到黑色素瘤细胞分泌的外泌体，并检测岀 所患转移性黑色素瘤是否对化疗药物敏感⑶。与此类似,Repiska G 等人发现，从孕妇血清中提取的外泌体能检测到胎儿的DNA 【4】。 由此可见，血清外泌体能够参与到病理生理过程中。 目前我们对血清外泌体的研究尚处于初级阶段，要想实现最 终的临床上的指导应用，还有许多亟待解决的难题。其中，从成 分复杂的血清中获得结构完整，形态大小均一，并保留其生物学 特性的外泌体，是目前的一个重难点⑸。现阶段外泌体的提取方 法主要有：超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、过滤离心和 试剂盒提取法等。本文就将差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚 沉法和优化后的PEG 聚沉法用于血清外泌体的提取并进行比较， 期望获得简便快捷和性价比高的提取方式。 2实验材料与方法 2.1试剂及仪器 PEG 6000(E125BA0029)购自生工生物工程股份有限公司； Total Exosome Isolation (00520032)购自 Invitrogen 公司；CD63 抗 体(BA1584)和TSG101抗体(PB0550)购自武汉博士德生物工程有 限公司，HSP70抗体(AH728)购自上海碧云天生物技术有限公司； L-100XP 低温超速离心机购自美国Beckman 公司；透射电镜 (H7650)购自日本Hitachi 公司。2.2实验方法 2.2.1差速超速离心法提取外泌体 取1 mL 大鼠血清，加入19 mL PBS, 300 g, 4 °C 离心10 min 。 取上清转移到新的离心管中，2000 g, 4 °C 离心10 mine 取上清 转移至新的离心管，10000 g, 4 °C 离心30 min ；取上清置于超离 管中，100000 g, 4 °C 离心70 min,去上清，加入20 mL PBS 重 悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。2.2.2试剂盒法提取外泌体 按照Total Exosome Isolation (00520032)试剂盒说明书进行提 取。 2.2.3 PEG 聚沉法提取外泌体 16 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 超纯水配制成 8%PEG 6000(2X)溶液；10 g PEG 6000+5.844 g NaCl+100 mL 痼纯水配制 成 5%PEG6000(2X)溶液。 取ImL 大鼠血清,2000g,4 °C 离心30 min 。取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。去除上清，用PBS 重悬后加入5%PEG6000(2X), 4匸静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h,底部沉淀即外泌体。 2.2.4 PEG 聚沉法经超速离心法优化提取外泌体 取1 mL 大鼠血清，2000 g,4 °C 离心30 min 。取上清于1.5 mL 离心管，按1 ： 1的比例，在血清中加入8%PEG6000(2X), 4 °C 静置孵育30 min 后，10000 g, 4 °C 离心1 h 。去除上清，用20 mL PBS 重悬，100000 g, 4 °C 离心70 min,底部沉淀即外泌体。 2.2.5提取外泌体总蛋白及免疫印迹 裂解上述外泌体并提取其总蛋白，以等样蛋白浓度跑10%丙 烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭 2 h, 4 °C 孵育HSP70、CD63和TSG101 —抗过夜，加入相应二 抗室温孵育lh 后，于蛋白成像系统中进行曝光成像，拍摄图片。 2.2.6形态学分析 取上述外泌体于铜网上，负染后在透射电镜下观察其形态。 3结果 3.1外泌体标记蛋白HSP70、CD63、TSG101表达的检测 差速超速离心法、试剂盒法、PEG 聚沉法、经超速离心法优 化的PEG 聚沉法所提的外泌体中均检测到外泌体标记蛋白 HSP70、CD63和TSG101的表达，四种方法没有明显差别，见图 lo
外泌体提取方法比较Prepared on 21 November 2021
外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小 体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹 水、羊水等体液中。 外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关[1][2]。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。 外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离： 1、超速离心法（差速离心） 超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量[3]。 2、密度梯度离心 在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。 3、超滤离心[4] 由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。 4、磁珠免疫法 外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白）[5]，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。 5、PEG-base沉淀法 聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。 6、试剂盒提取 近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。有些试剂盒操作简便，不用超速离心，同时可获得高纯度和高回收率的外泌体——如，可分
干货！脑浆组织如何提取外泌体 外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约30 ~ 150 nm的膜性囊泡。几乎所有的细胞都会产生外泌体，被分泌出的外泌体会进入各种体液，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。 越来越多的研究表明神经系统中的生理功能和病理功能与外泌体密切相关，例如：参与神经发育和神经元活动，参与神经退行性疾病调控等。 本文中整理了一种可以从脑浆组织中分离和提取外泌体的操作步骤，供大家参考！ 相关试剂： 1，Hibernate E Solution （BrainBits, Springfield） 2，木瓜蛋白酶papain（Worthington） 3，Umibio Exosome Isolation Kit 4，PBS 相关设备： 1，匀浆器 2，网状过滤器40-μm 3，注射器过滤器0.2μm 4，高速离心机 5，涡旋振荡器 操作步骤： 一）脑浆液化处理： 1，将新鲜或先前冷冻的小鼠半脑切开，加入Hibernate E溶液(3 mL /半脑)； 2，加入20单位/ mL的木瓜蛋白酶，在37℃水浴15分钟； 3，加入等体积预冷Hibernate E后，轻轻匀浆；匀浆过程中在冰上进行； 4，脑匀浆通过40-μm网状过滤器过滤； 5，滤液再通过0.2-μm过滤器过滤，收集滤液； 二）液化脑浆预处理； 1，离心去碎片：将液化脑浆液转移至离心管中，于4℃以3000 g离心10 min，去除滤液中的碎片；离心后上清液转移到新的离心管中； 2，离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000 g离心20 min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中； 三）脑浆外泌体的提取； 通过Umibio Exosome Isolation Kit提取外泌体颗粒。 1，上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS
外泌体提取的具体步骤及方法 外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。现已证实可以分泌外泌体的细胞有：肥大细胞、淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、间充质干细胞等。 外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。 1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。 所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。 外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方
面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。 外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离： 1. 超速离心法（差速离心） 超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受?欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。 2. 密度梯度离心
外泌体的分离鉴定 ［摘要］外泌体，细胞间物质信息的传递者，在细胞生物学以及分子生物学领域中，扮演着越来越重要的角色。然而目前对于外泌体的分离鉴定还存在一定的困难，因此本文对外泌体的分离鉴定方法进行综述，为外泌体的进一步研究提供更有效的方法。 近年来，越来越多的证据表明外泌体对于细胞生物学以及医学研究方面具有重要的价值，而由于外泌体的体积结构方面的因素，其分离纯化还存在很大的困难，目前比较常用的分离方法有差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。 1. 差速离心法 陈绍倩［1］等人以白血病细胞系K562细胞为材料，采用多步离心的方法成功地提取到了的外泌体。此种实验方法操作不是很复杂，实验设备要求相对简单，拥有超速离心机和细胞培养设备即可，是一种比较简便的提取外泌体的方法，基本可以满足实验研究的要求。但分离纯度不是很高，并且经过多次离心对外泌体的理化性质造成一定的影响。 2. 密度梯度离心法 像所有的脂质小囊泡一样，外泌体悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围从 1.13g/ml 到1.210g/ml ，将细胞混悬液或匀
浆置于蔗糖介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，从而将外泌体从混杂的物质如蛋白聚集物或细胞凋亡的核小体碎片等中分离出来[2] 。崔焱[3] 等人根据其这一特性，从大量培养的肿瘤细胞上清中分离纯化外泌体，并对此进行了电镜鉴定; 在得到大量较高纯度的外泌体的基础上，将其加入含有白细胞介素-2（1L-2 ）的淋巴细胞培养体系中，观察其对淋巴细胞增殖的影响。 3. 超滤离心法 王伟[4] 等人以树突状细胞为实验材料，基于对外泌体物理 特性，大小以及密度的了解，将超滤离心分离外泌体的方法与传统的分级离心法进行了比较，通过实验证明超滤离心法耗时少，产量和纯度都得到了很大程度的提高，是一种比较高效的制备外泌体的方法。 4. 免疫磁珠法 将具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗体，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与磁珠结合而不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。Richard Wubbolts[5] 等人在对外泌体进行蛋白质组学和生化分析的过程中，将外泌体的标志性蛋白―抗MHCII 抗体包被于磁珠表面，通过抗原抗体特异性识别的特性有效的将外泌体分离出来。 无论采用哪种方法进行分离，如果想对其进行系统的研究都必
??外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。 外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种 疾病的发生和进程密切相关[1][2]。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药 物的天然载体用于临床治疗。 外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取 分离： 1、超速离心法（差速离心） 超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离 到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可 能对囊泡造成损害，从而降低其质量[3]。 2、密度梯度离心 在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通 过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。 3、超滤离心[4] 由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。 4、磁珠免疫法 外泌体表面有其特异性标记物（如CD63、CD9蛋白）[5]，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体 囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外 泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。 5、PEG-base沉淀法
QIAGEN外泌体提取快速操作规程 Part I: 囊泡分离 开始前提示 本操作规程用于从0.1至1 ml血清或血浆中纯化外泌体或其他细胞外囊泡。本规程从细胞外囊泡分离总RNA（包括小RNA）（Part II）。 如有必要，加热重溶RWT缓冲液中的所有组分。 除了分离步骤（步骤11）之外，其他操作应该在室温（15-25°C）快速进行。 RWT缓冲液和RPE缓冲液原液中在使用前应加入96-100%的乙醇（添加体积见瓶签）。 miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control (cat.no.219610) 必须单独完成。如何准备工作液的建议见exo RNeasy Serum/Plasma手册。 规程中RNA纯化部分（步骤7之后）与QIAGEN MaXtract High Density Tubes（cat.no.129056）一致。 1. 建议只用预过滤的血浆，不包含大于0.8的颗粒。或者于4°C以16,000 g将样品离心10分钟。 2. 加1份体积XBP缓冲液至1份体积样品中。轻轻颠倒离心管5次立即混匀，将混合液置于室 温。 3. 样品/XBP缓冲液的混合液加至exoEasy离心柱上并以500 g离心1分钟。弃去流穿液并将离 心柱置于相同的收集管中。 提示：如果有液体残留在膜上，以5,000 g再离心1分钟以确保所有液体穿过膜。 4. 加入3.5 ml XWP缓冲液并以5,000 g离心5分钟去除离心柱中的残余体积。弃去收集管中的 所有流穿液。 提示：可能的话，降低操作步骤中5000 g的离心力至3000 g以减少损失。 5. 将离心柱移至一个新的收集管中。 6. 加700 μl QIAzol到膜上。以5,000 g离心5分钟，收集溶解样并完全转移至一个2 ml管中。 继续Part II从步骤7开始。