新生鼠海马、皮层神经元原代培养
实验材料
1. 实验动物
新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂
Hibernate A
Neurobasal A
B27 serum-free supplements
Papin （木瓜蛋白酶）
DNAase I
OptiPrep Density Gradient Medium
Poly-L-lysine （多聚赖氨酸）
L-glutamine （L-谷氨酰胺）
Penicillin （青霉素）
Streptomycin （链霉素）
D-Hank’s solution
dd H2O
3. 溶液配制
1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。（可配成25×）
2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法
1. 包被培养皿
使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
2. 组织剥离
取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。
3. 消化和分散
用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，
用1mL移液枪吹打细胞（慢吸快吹）10次，静置2 min，小心吸取上部细胞悬液，再加入2 mL HABG，200 μL DNAase I，吹打10次，静置2 min，小心吸取上部细胞悬液，必要可再重复一次。将细胞悬液过400目细胞筛网，然后小心加至离心介质上，每管约6 mL。1900 rpm离心15 min。离心后细胞留在介质和终止液交接部，血细胞被离至管底。吸掉上部终止液后，小心吸取细胞至另一离心管，加入8~10 mL Neurobasal A/B27将细胞重悬，1100 rpm离心5 min，弃上清，加入2 mL Neurobasal A/B27将细胞重悬，此时若有无法吹散的絮状物弃掉，或将离心管静置片刻，待其沉淀后吸取上边细胞悬液至另一离心管，加入8~10 mL Neurobasal A/B27将细胞重悬，1100 rpm离心5 min，弃上清，加入2~3 mL Neurobasal A/B27重悬。
4. 计数和接种
取少量细胞悬液以苔盼蓝染液观察存活率并计数。1×106/孔的密度接种在多聚赖氨酸包被的6孔板中，置于37 °C，5% CO2培养箱。
5. 洗板和换液
细胞种下6小时后应贴壁良好，十字摇板10~15次，吸出种植液，用37°C 预热的D-Hank’s液洗板3次，每次摇板10~15次。镜检碎片基本洗净后，每孔加入2mL 含双抗、谷氨酰胺的Neurobasal A/B27置于37 °C，5% CO2培养箱。以后每3天换半液。
5. 神经元的形态学观察
分散培养的大鼠海马神经元，在接种1 h后即可贴壁，细胞呈单个圆形或椭圆形。2~3 d后细胞明显增大，突起长出并延伸。6~7 d时神经元在相差显微镜下可见具有明显的光晕。此时神经元呈三角形或多边形，边界清晰，胞体明亮，胞
核和核仁清晰可见。在培养过程中神经元之间的纤维联系逐渐丰富，并形成网络。随着培养时间的延长，海马神经元逐渐退化变性，表现为神经元胞体光晕消失，胞体皱缩，突起萎缩，有的出现空泡，直至脱落，造成神经元的数量逐渐减少。
注意事项：
1．分离组织要迅速，尽量减少操作时间。因用Optiprep介质离心时可分离血细胞，分离组织时可不必过细的剔除血点。
2．用于分离组织的液体不能偏碱，会明显影响细胞状态。
3．消化后的组织会释放DNA，导致组织粘稠无法吹开，DNAase可以有效缓解此现象，若发现在上述DNAase量下仍有粘稠，可适当增加
DNAase量。粘稠的物质在过筛时无法筛掉，种板后会很快黏至板底，
洗板时无法洗掉，其周围很大面积内没有细胞，严重影响实验成败。
4．种板时细胞密度至少在1×106/孔（6孔板），过稀细胞无法生长。
5．细胞贴壁6小时后及时洗板，时间长后碎片不易洗掉，影响细胞生长。
原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。
新生鼠海马、皮层神经元原代培养 实验材料 1. 实验动物 新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。 2. 试剂 Hibernate A Neurobasal A B27 serum-free supplements Papin （木瓜蛋白酶） DNAase I OptiPrep Density Gradient Medium Poly-L-lysine （多聚赖氨酸） L-glutamine （L-谷氨酰胺） Penicillin （青霉素） Streptomycin （链霉素） D-Hank’s solution dd H2O 3. 溶液配制 1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。（可配成25×） 2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。 3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。可一次配好，-20°C保存，每次取用。 4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。现用现配，37°C保存备用。 5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。 5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。现用现配，37°C保存备用。 4．实验方法 1. 包被培养皿 使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。 2. 组织剥离 取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。 3. 消化和分散 用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，
氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，
D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染
［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大
小鼠海马神经元细胞 小鼠海马神经元细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠海马神经元细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠海马神经元细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠海马神经元细胞产品简介： 产品名称：小鼠海马神经元细胞(Mouse hippocampal neuron cells)组织来源：小鼠海马组织区 产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶 小鼠海马神经元细胞简介： 海马椎体神经元是海马区的主要成分，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节、是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用(细胞因子)的有效细胞模型,其在神经生物学,发育生物学体外实验研究中已被广泛应用。 本公司生产的小鼠海马神经元细胞采用胰酶消化制备而来，细胞总量约为 5×105 个/瓶，细胞纯度可达 80%以上，且不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。
昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.
小鼠海马神经元的培养 一、实验材料： 1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。 2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水溶解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。 3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml10x平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES 3.9g, NaHCO30.84g， 青霉素104U, 链霉素100mg， H2O800ml。 以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm 直径的滤菌器过滤，4℃保存。 4、DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM培
养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min灭活）1%的青/链霉素. 5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2% 的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。 7、台盼蓝(typan blue)溶液终浓度为0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷终浓度为8-10μmol/L。 9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。 二、实验步骤： 1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。 2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。 3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。 4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖）,在孵箱中消化5-7min。 5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。
海马神经元培养 （1）材料 ①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d ②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103) L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺 Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸 B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504) ③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸 ④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025) ⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175) ⑥trypsin 胰酶 ⑦NaHCO 3 ⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠 ⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝 ⑩巴氏吸管，前端用火抛光 刻度吸管 离心管 闪烁瓶 玻璃培养皿：小：3套 大：2套 冰袋、纱布 手术器械、筛网 培养瓶或培养板
（2）步骤 ①准备 a．配制试剂 i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中） 配制硼酸缓冲液（pH8.4） A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 4.5mlA液+ 5.5mlB液 5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。 ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制 不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水 NaHCO3：0.175g加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.2-7.4 纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 iii）1M NaOH溶液配制 NAOH：4g 溶于100ml纯水 iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA D-Hank’s溶液10ml EDTA 20mg 溶解后 D-Hank’s溶液80ml 胰酶125mg 溶解后 1M NaOH溶液调节pH至7.2 D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.4 纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液
基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制 发表时间：2019-03-07T16:26:29.280Z 来源：《心理医生》2019年第4期作者：王赫霆 [导读] 研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响 （哈尔滨市第十一中学黑龙江哈尔滨 150000） 【摘要】目的：研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响。方法：正常大鼠随机分为空白组、模型组。采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，分中药治疗组（高、中、低剂量），对照组，各组15只，于第0、7、14、21、28天观察行为学指标（体重、糖水消耗实验、敞箱得分、大鼠活动延迟时间）。28天取大鼠海马组织，观察CA1、CA2、CA3、CA4区形态学变化及HE染色后脑组织的病理改变(Figure)。结果：相同时间点组间比较第7、14、21、28天行为学指标空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。抑郁大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩,深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩,深染。治疗组大鼠 海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。结论：宁神灵可能通过作用于大鼠海马神经元细胞，引起相关蛋白及递质的改变，具有抗抑郁作用。 【关键词】宁神灵；抑郁症；慢性不可预知刺激；行为学；海马神经元 【中图分类号】R749.05 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2019）04-0045-02 抑郁症是一种以显著而持久的情绪失常为特征的综合征，该病具有高患病率、高致残率、高自杀率的特点。据世界卫生组织进行的全球疾病负担调查估计，到2020年由抑郁症造成功能残疾的人数将仅次于心血管疾病，上升至所有病种的第2位，并将占到全球因精神因素致残患者的1/3，因此，抑郁症已成为亟待解决的最重要的精神障碍[1]。近年来，关于抑郁症发病机制的研究很多，大多集中在神经递质、基因和社会因素等方面，但对于抑郁症发生和发展的分子生物学机制仍尚不明确[2]。 1.材料与方法 1.1 实验材料 健康雄性大鼠75只，正常大鼠随机分为空白组、模型组，采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，模型组分中药高（宁神灵5.04g/kg）、中（宁神灵2.52g/kg）、低剂量组（宁神灵1.26g/kg）、对照组。 1.2 研究方法 1.2.1行为学指标观察 （1）体重测定 实验过程中每周称量一次体重观察各组大鼠体重变化及增长情况以判断抑郁状态与体重变化的关系。 （2）糖水消耗实验 根据文献所有大鼠首先受训饮用1%的蔗糖水在开始的48小时内将蔗糖水放入笼中以代替自来水接着禁食禁水24小时通过称饮水瓶重量测量大鼠在1小时内蔗糖水的饮用量此后每间隔一周均进行禁水禁食及1小时蔗糖水测试，此过程贯穿于整个实验。 （3）敞箱得分实验 将大鼠置于高40cm，直径80cm周壁为黑色底面被分成面积相等的25块方格组成的旷场里，60W灯泡照明观测每只大鼠3min内水平活动和垂直活动得分。7:30～12:00之间在安静的房间内进行此项试验观察将大鼠置于敞箱中间观察大鼠穿越方格数（四爪均进入的方格可记数，为水平活动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动次数（理毛次数）、粪便次数。彻底清洁敞箱后再进行下一只大鼠的观察。每只大鼠测试3分钟。分别在造模前、给药前及给药后进行敞箱实验。 1.2.2标本采集 （1）HE染色 取大鼠脑组织，在4%甲醛溶液中固定24-48小时，用模具测量并用刀片切取海马区，石蜡包埋，进行切片和HE染色。使用光学显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。 （2）电镜显微结构观察 解剖获取大鼠脑组织，将脑组织迅速放入3%戊二醛固定液在4℃条件下固定过夜。用模具测量并用刀片切取海马区作为标本进行俄酸包埋，使用电子显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。 2.结果 本实验表明相同时间点组间比较第7、14、21、28天大鼠体重指数：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；糖水消耗实验：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；敞箱得分：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；大鼠活动延长时间：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标、高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。脑组织HE染色后，显微镜拍照观察脑组织的病理改变（Figure）。结果显示，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩，深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩，深染。治疗组大鼠海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。 3.讨论 抑郁症患者常伴有一些生物性节律改变，如睡眠障碍、食欲不振、便秘、身体乏力、精力减退、性功能障碍等，这些生理症状应用西药抗抑郁药很难解决，甚至一些西药还会加重上述障碍，在上市销售明确用于抑郁症治疗的天然药物及中药复方制剂中，不是治疗单一，就是疗效不显著，而且用药一段时间极易出现病情反复的现象，同时症状更加严重。传统中药在复杂的抗抑郁治疗方面具有明显的优势，很多研究都表明祖国传统的经方名方对于抑郁症的治疗能够达到很好的疗效[3]。研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤复方具有较强的抗焦虑、抗抑郁作用，其作用机制可能与增加了脑内单胺类神经递质的含量密切相关[4]。宁神灵冲剂由二组药组成，一组舒肝郁、平肝火、清痰热，另一组扶心阳固心气。收敛神气之浮越，合之调节心、肝二脏之功能，使之趋于平衡，神志之病，脏腑辨证在于此二脏，二脏平和，消除各种精神神经症状。与西药作用迥然不同，它针对神经抑制和兴奋过程失调而组方，通过双向调节大脑皮层兴奋和抑制神经的过程，消除
小鼠海马区神经元的培养 徐医麻醉 2011-09-02 09:33:05 回复转载到 小鼠海马区神经元的培养 实验材料： 1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。 2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水荣分解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2 孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。 3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取 100ml 10x 平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES 3.9g, NaHCO3 0.84g， 青霉素 104 U, 链霉素 100mg， H2O 800ml。 以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm直径的滤菌器过滤，4℃保存。 4、DMEM 培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min 灭活）1% 的青/链霉素. 5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。 7、台盼蓝(typan blue )溶液终浓度为0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷终浓度为8-10 μmol/L。 9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。 实验步骤： 1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。 2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS？）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。 3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。 4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖），在孵箱中消化5-7min。 5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。最好用培养基洗2-3
研究海马神经元谷氨酸损伤 摘要：目的：本研究通过观察体外培养的大鼠胚胎海马神经元在谷氨酸损伤后，细胞活力变化及细胞损伤的方式，初步探讨谷氨酸对神经元的损伤机制。方法：通过MTT，观察不同浓度( μM、125 μM、250 μM、500 μM)的谷氨酸损伤后不同时间（6 h、12 h、18 h、24 h)海马神经元活力的变化。经相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响。通过TUNEL、Hoechst染色比较正常培养组和损伤组的凋亡率，分析谷氨酸对海马神经元的损伤作用。结果：MTT 结果显示，谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，在所观察的剂量范围内，随着谷氨酸浓度的增加，作用逐步增强，至500 μM达峰值，随着损伤后孵育时间的延长，海马神经元活力逐渐下降。TUNEL和Hoechst染色结果也显示，125 μM谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性，主要引起海马神经元的凋亡。结论：谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,且这种作用呈现剂量相关性。中等剂量（125 μM）谷氨酸损伤主要引起海马神经元的凋亡。关键词：谷氨酸海马神经元 TUNEL 脑卒中以高死亡率和高致残率严重威胁着人类的健康和社会劳动能力。在脑缺血过程中，各种神经递质发生一系列变化，如脑内氨基酸类神经递质大量增加，特别是缺血中心区域。兴奋性氨基酸如谷氨酸(glutamate, Glu)和天冬氨酸(aspartic, Asp )的过量释放是缺血性脑损伤的重要病理机制。据报道谷氨酸受体拮抗剂对脑缺血损伤有很好的保护作用。同样，抑制性氨基酸对脑缺血有保护作用，可拮抗兴奋性氨基酸的毒性。很多学者认为，兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的平衡失调是缺血性脑损伤的原因之一。 海马是边缘系统的重要组成部分，在学习、记忆、情绪反应及植物性神经功能等方面有重要作用，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一，在结构上具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布等特点。海马是神经元高度集中的部位，锥体神经元是海马区的主要成分，体外培养的海马神经元，对许多致病因素和化学损害较为敏感，因此在研究神经系统疾病的病理机制及治疗方法中均以海马作为病理模型，如缺血/缺氧、癫痫、衰老和兴奋性毒素等均可引海马的特异性损害。在脑缺血模型中，海马神经元最早出现较严重的损害，并且海马缺血性损害和兴奋性神经毒有关，这可能和海马神经元含有高密度的谷氨酸能受体有关。 本研究采用胎鼠海马神经元的无血清体外培养，获得高纯度的神经元。通过高分子量神经丝蛋白（neurofilament high molecular weight，NF-H）和神