复旦大学
博士学位论文
Endothelin-1在前列腺癌骨转移中的作用及其机制研究
姓名：武睿毅
申请学位级别：博士
专业：外科学
指导教师：王国民;殷莲华
20050410
堑竺盔兰塑！鲨塞第一部分１６．兔抗ＦＡＫ多克隆抗体，小鼠抗酪氨酸磷酸化单克隆抗体（ＰＹ９９），兔抗ｐ－ａｃｆｉｎ多克隆抗
体，ＰｒｏｔｅｉｎＧＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ．．均为ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。
１７．预染的蛋白ＭＢｒ＇ｋｅｒ：ＭＢＩＦｅｍｌｅｎｔａｓ公司。
１８．蛋白酶抑制剂ＣｏｃｋｔａｉｌＴａｂｌｅｔｓ：Ｒｏｃｈｅ公司。片剂４℃保存，使用时每片溶解于１．５ｍｌ去
离子蒸馏水后，．２００ｃ保４９。
：有ａｐｒｏｆｉ．ｎｉｎ，ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ．１ｅｕｐｅｐｍｐｅｐｓｔｍａ等２１种成分。
１９，ＰＢＳ液：ＮａＣＩ８９，ＫＣｌ０．２９，Ｎａ２ＨＰ０４’１２Ｈ２０１．５４９，ＫＨｚＰ０４
０．１９１９，去离子蒸馏水溶解后，定容至１０００ｍｌ。
’２０．ＲＩＰＡ细胞裂解液：含５０ｍｍｏｌ／Ｌ埘ｓ＿ＨＣ】（ｐＨｚ４），１０岫ｎ＇ｎｏｔ／ＬＮａＣｌ，１％ＮＰ－４０，０．２５％
ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｌｅ。用时每１００ｐ／加入１５山蛋白酶抑制剂。
２１．３０％丙烯酰胺（Ａｃｒ）：称脚ｏｇ，甲叉双丙烯酰胺（Ｂｉｓ）０．８９，加去离子蒸馏水至１００ｍｌ，
３７℃水浴助溶，过滤后置棕色瓶中，４℃贮存。
２２．１０％ＳＤＳ（十二烷基磺酸钠）：１０９电泳级ＳＤＳ，加入去离子蒸馏水９０ｍｌ，加热至６８℃
助溶，加入浓盐酸调节ｐＨ７．２，最后用去离子蒸赡水定容至１００ｍｌ。
２３．１．５ｍｏｌ／ＬｐＨ８．８Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液：称取陆１８．趣，加入５０ｍｌ去离子蒸馏水，用浓盐酸调
ｐＨ８．８，最后用去离子蒸馏水定容至１００ｍｌ。
１．０ｍｏｌ／ＬｐＨ６．８Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液：称取１№１２．１９，加入５０ｍｌ去离子蒸馏水，用浓盐酸调
ｐＨ６．８，最后用去离子蒸馏水定容至１００ｍｌ。
１０％过硫酸铵（ＡＰ）：ｌｇ过硫酸铵＋ｌｏｒｌｌｌ去离子蒸馏水，４℃密封保存。
ＴＥＭＥＤ（四甲基乙二胺）
ｌｘＳＤＳ电泳ｔ样缓冲液：１０％ＳＤＳ１０ｍｌ＋溴酚蓝００５ｍｇ＋甘油５ｍｌ＋ｌＭｐＨ６．８Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ
２．５ｍｌ，最后去离子蒸馏水定容至５０ｍｌ。临用前按总体积的５％加Ｂ＿巯基乙醇。
５×Ｔｒｉｓ．甘氨酸电泳缓冲液（ｐＨ８．３）：称Ｔｒｉｓ７．５５９，甘氨酸４７９，加入１０％ＳＤＳ２５ｍｌ，加
去离子蒸馏水使其溶解后，定容至５００ｍｌ。用前ｌ：５以去离子蒸馏水稀释。
转移缓冲液：称确搴４．６４９，甘氨酸２．３２９．纯甲醇１２０ｒｎｌ，加去离子蒸馏水６８０ｍｌ，总体
积８００ｍｌ。每次用前现配。
ＰＢＳＴ洗膜液：１ＬＰＢＳ液内加入Ｏ．５ｍｌＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．５。
１％明胶：称取明胶０．２９，加入去离子水２０ｍｌ，３７。Ｃ助溶。
ｌｍｏｌ／Ｌ氯化锌：称取氯化锌１．３７９，溶于ｌ０ｍｌ去离子蒸馏水中。
洗涤液（０．０５ＭＴｆｉｓ）．．Ｔｆｉｓ６．０６９加去离子蒸馏水溶解，调ｐＨ７．５，最后用去离子蒸馏水定
容至１０００ｍｌ。
反应液（底物缓冲液）：称取氯化钙０．５５５９，氯化钠５．８５９，ｌｍｍｏｌ／Ｌ氯化锌０．５ｍｌ，溶于
０．０５ＭＴｒｉｓ５００ｒｎｌ。
２．５％ＴｆｉｔｏｒｖＸ１００：取１２．５ｍｌＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，加＾底物缓冲液５００ｍｌ充分溶解。
染色液：称取考马斯亮蓝Ｒ２５０ｌｇ，加甲醇２５０ｍｌ，冰乙酸５０ｍｌ，过滤后备用。
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