食品微生物之檢驗方法－肉毒桿菌之檢驗
101年5月16日署授食字第1011901882號公告第一部份：肉毒桿菌及其毒素之檢驗
1. 適用範圍：本方法適用於食品中肉毒桿菌及其毒素之檢驗。
2. 實驗室生物安全措施：
2.1. 生物危害標幟應懸掛於實驗室入口處，並管制人員進入，以及將該實驗區之人數維持至最低需求。
2.2. 備有治療用肉毒桿菌抗毒素之醫療院所緊急連絡電話號碼應張貼在明顯處。
2.3. 實驗操作應在生物安全操作櫃進行。
2.4. 應有洗眼用噴水器及腳踏或自動式洗手設備。
2.5. 絕不可以用口吸取任何檢體，應以機械式吸管輔助器操作。
2.6. 工作前、後應以1%次氯酸溶液擦拭工作檯。
2.7. 實驗後，工作人員應將所使用過之器材及廢棄物，立即滅菌處理。
3. 檢驗方法：檢體經前處理後，經增菌，續以選擇性培養基培養，配合肉毒桿菌毒素檢測與型別鑑定之方法。
3.1. 工作環境：工作平檯須寬敞、潔淨、光線良好，操作平檯光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵
及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
3.2. 器具及材料：
3.2.1. 生物安全操作櫃（Biological safety cabinet, BSC）：第二等級（class II）（含）以上者。
3.2.2. 高壓滅菌釜。
3.2.3. 乾熱滅菌器。
3.2.
4. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。
3.2.5. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1℃以內者。
3.2.6. 天平：可稱量到2000 g 者，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g 者，靈敏度為5 mg。
3.2.7. 旋渦混合器（Vortex mixer）。
3.2.8. 加熱板（Hot plate）。
3.2.9. 顯微鏡：能放大至1000倍之一般光學顯微鏡。
3.2.10.吸管輔助器（Pipette aid）。
3.2.11.微量吸管（Micropipette）：10 μL、20 μL、200 μL及1000 μL。
3.2.12.酸鹼度測定儀（pH meter）。
3.2.13.水浴：能維持水溫溫差在± 0.2℃以內者。
3.2.1
4.培養皿：已滅菌，內徑約90 mm ，深度約15 mm ，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。
3.2.15.吸管尖頭（Tip）：可滅菌。10 μL、20 μL、200 μL及1000 μL。
3.2.16.吸管（Pipette）：已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
3.2.17.容器：附螺旋蓋之玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃溼熱滅菌20分鐘以上之三角錐瓶、玻璃瓶或廣口瓶，
125 mL、250 mL、500 mL及 2 L。
3.2.18.附螺旋蓋試管：10 × 100 mm ，13 × 100 mm ，15 × 150 mm 試管，或其他適用者。
3.2.19.載玻片及蓋玻片：適用於染色及鏡檢用。
3.2.20.接種針及接種環（直徑約3 mm）：鎳鉻合金，鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
3.2.21.厭氧瓶（Anaerobic jar）。
3.2.22.氣體包：適合厭氧菌培養者。使用時，反應30分鐘後，厭氧瓶內空氣組成為氧氣含量低於1%，二氧化碳含量介於9
～13%。
3.2.23.離心管及微量離心管：已滅菌，15 mL、50 mL、0.2 mL、2.0 mL。
3.2.2
4.注射筒：1 mL、3 mL，附25號，5/8吋注射針。
3.2.25.小鼠：雄性，體重16～24 g。
3.2.26.小鼠用籠子、飼料、飲水瓶等。
3.2.27.藥勺、剪刀、鑷子、開罐器、缽及杵臼：可滅菌。
3.2.28.無菌濾膜：孔徑0.2 μm 及0.45 μm之親水性醋酸纖維濾膜。
3.2.29.試藥：碘、碘化鉀、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、次氯酸鈉（sodium hypochlorite）、氫氧化鈉、葡萄糖（glucose）、葡萄
糖（dextrose）、鹽酸、95%乙醇、無水乙醇、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4, anhydrous）、磷酸二氫鉀、硫甘醇鈉（sodium thioglycollate）、結晶紫（crystal violet）、草酸銨（ammonium oxalate）及沙黃O（safranin O）均採用化學試藥級；明膠（gelatin）、胰蛋白酶、牛心（beef heart）、蛋白腖（proteose peptone）、胰化酪蛋白（trypticase）、蛋白腖（peptone）、
酵母抽出物（yeast extract）及洋菜（agar）均採微生物級。
3.2.30.試劑：
3.2.30 .1. 碘酒溶液（Alcoholic iodine solution）：
稱取碘10 g 及碘化鉀10 g ，溶於70%乙醇溶液500 m L中，攪拌溶解置於密閉容器避光保存。
3.2.30 .2. 明膠－磷酸鹽緩衝溶液（Gel-phosphate buffer）：
稱取明膠 2 g 及磷酸氫二鈉 4 g ，溶於蒸餾水 1 L ，微加熱至溶解，以121℃滅菌20分鐘，最終pH值為6.2。
3.2.30.3. 革蘭氏染色液（Gram stain solution）（註1）：
3.2.30 .3.1. 哈克氏（Hucker’s）結晶紫液（初染劑）：
溶液A：取結晶紫 2 g 溶於95%乙醇20 mL。
溶液B：取草酸銨0.8 g 溶於蒸餾水80 mL。
將溶液A與溶液B混合，靜置24小時後以濾紙過濾，取濾液作為初染劑。
3.2.30 .3.2. 革蘭氏碘液（媒染劑）：
取碘化鉀 2 g 及碘 1 g 置於研缽中，經研磨5-10秒鐘後，加蒸餾水 1 m L研磨，次加蒸餾水 5 m L研磨，再加蒸餾水10 mL，研磨至碘化鉀和碘完全溶於蒸餾水中，將此溶液注入褐色瓶中，再以適量蒸餾水洗
滌研缽及杵後，併入洗液，加蒸餾水至300 mL，供作媒染劑。
3.2.30 .3.3. 哈克氏複染劑（複染劑）：
取沙黃O 2.5 g，溶於95%乙醇100 mL，供作複染原液。使用時，取原液10 m L加蒸餾水90 mL，作為複染劑。
註1：革蘭氏染色液因放久可能失效，購置成品時，需注意其保存期限；自行配製者，應檢查其染色效果。
3.2.30 .
4. 0.85%生理食鹽水：
稱取氯化鈉8.5 g，溶於蒸餾水1000 mL，以121℃滅菌15分鐘。
3.2.30.5. 1N氫氧化鈉溶液：
稱取氫氧化鈉 4 g ，加蒸餾水溶解使成100 mL。
3.2.30.6. 1N鹽酸溶液：
量取鹽酸89 mL，加蒸餾水使成1000 mL。
3.2.30.7. 70%乙醇溶液：
取95%乙醇737 mL，加蒸餾水使成1000 mL。
3.2.30.8. 胰蛋白酶溶液：
稱取胰蛋白酶（1:250）0.5 g，加蒸餾水10 m L溶解，可冷藏存放1週。配製時應戴口罩。
3.2.30.9. 1%次氯酸鈉溶液：
依次氯酸鈉溶液濃度進行稀釋，量取6%次氯酸鈉溶液50 mL，加蒸餾水使成300 mL，或量取12%次氯酸鈉溶液25 mL，加蒸餾水使成300 mL。
3.2.30.10.50%蛋黃液：
雞蛋洗淨，浸入70%乙醇溶液中1小時，以無菌針筒無菌操作取出蛋黃，加入等量0.85%無菌生理食鹽水，混勻，儲存於4℃備用。
3.2.31.A-F型單價肉毒桿菌抗毒素（Monovalent botulinal antitoxins）與A-F型多價肉毒桿菌抗毒素（Polyvalent botulinal
antitoxins）：
冷凍乾燥之抗毒素以無菌0.85%生理食鹽水依標示復水，置於4℃冰箱貯存備用。絕不可以使用甘油溶液稀釋抗毒素原液。
3.2.32.培養基：
3.2.32.1. 肉質培養液（Cooked meat medium, CMM）
稱取脫水肉質培養基 1.25 g ，置入20 ? 150 m m試管中，加入蒸餾水10 mL（或稱取12.5 g ，加入蒸餾水100 mL），充分混合，放置約15分鐘使之完全溼潤，於121℃滅菌20分鐘，最終pH值為7.2±0.2。臨用前，以蒸氣或沸水加熱去除液體中之溶氧，冷卻後使用。
3.2.32.2. 胰化酪蛋白－蛋白腖－葡萄糖－酵母抽出物培養液
（Trypticase-peptone-glucose-yeast extract broth, TPGY）
使完全溶解後，分裝15 m L至20 ? 150 m m試管中，於121℃滅菌10分鐘。最終pH值為7.0 ± 0.2。配製後之培養液應於4℃中保存。臨用前以蒸氣或沸水加熱去除液體中之溶氧，冷卻後使用。
3.2.32.3. 厭氧蛋黃培養基（Anaerobic egg yolk agar, AEYA）
使完全溶解後，於121℃滅菌15分鐘，最終pH值為7.0 ± 0.2。冷卻至48～50℃，添加50%蛋黃液80 m L 充分混合，避免產生氣泡。每一培養皿注入約15～20 mL，凝固後，確認表面乾燥後使用，使用前應確認培養基
未受污染。
3.2.32.
4. 胰化酪蛋白－蛋白腖－葡萄糖－酵母抽出物－胰蛋白酶培養液
（Trypticase-peptone-glucose-yeast extract broth with trypsin, TPGYT）
培養液用胰蛋白酶溶液之配製：將胰蛋白酶 1.5 g 加入蒸餾水100 m L中，攪拌使完全懸著，靜置使顆粒沉澱，以0.45 μm 無菌濾膜過濾上清液，備用。
TPGYT之配製：依 3.2.32 .2.節配製TPGY培養液。使用前以蒸氣或沸水加熱10分鐘，去除液體中之溶氧，冷卻，取胰蛋白酶溶液1 mL，加至TPGY培養液15 mL，或取胰蛋白酶溶液6.7 mL，加至TPGY培養液100 mL，
混勻。
3.3. 檢體之處理：
將檢體冷藏於冰箱中，直至檢驗時方取出。除非有快速膨罐及爆裂之慮，未開封之罐頭食品不需冷藏。將檢體分為三部份，一部份依3.4.節進行肉毒桿菌檢測，一部份依3.6.節檢測肉毒桿菌毒素，其餘部份則保存於冰箱中。
3.3.1. 固態及液態食品：
以無菌操作將固態或僅含微量液體之食品，置入已滅菌研缽中，加入等量的明膠－磷酸鹽緩衝溶液，用已滅菌之研杵研磨後（或用已滅菌的鑷子夾取小塊檢體），接種於不同培養液中；液態食品則用無菌吸管，接種於不同培
養液中。接種完後，將剩餘檢體以無菌操作移入無菌之檢體保存袋（罐）中，冷藏備用。
3.3.2. 罐頭食品：
3.3.2 .1. 罐頭前處理：檢查檢體之外觀及氣味，記錄任何產品分解之事證，及所見之狀況。取6瓶非膨罐（non-swollen cans）
的待測罐頭於35℃培養14天，觀察是否有膨罐情形，當發生膨罐或送驗罐頭檢體已膨罐，則直接進行分析。
無膨罐情形發生時，培養14天後進行分析。
3.3.2 .2. 罐頭開封：開封前將罐頭置於冰箱中或以冰水冷卻罐身。洗淨罐身，以碘酒溶液浸泡開封處30分鐘，並以無菌
操作擦除殘留的碘，不可使用火燄燒烤膨罐。開罐器使用前須經過火焰燒烤至幾乎接近紅色或使用無菌開罐器。
溫和搖勻罐內容物，在無菌環境下開啟罐頭，開罐範圍大小需足供罐內取樣。
3.3.2 .3. 罐內取樣：自罐中心挖取或吸取內容物。接種完後，將剩餘檢體以無菌操作移入無菌之檢體保存袋（罐）中，
冷藏備用。
3.4. 肉毒桿菌檢測：
3.4.1. 增菌培養：
接種前將增菌用培養液以蒸氣或沸水加熱10～15分鐘，去除溶氧，快速冷卻並避免振盪。取二支裝有CMM培養液之試管，分別接種入檢體l～2 g或l～2 mL，於35℃培養。依前述方法將檢體同時接種於另二支含TPGY培養液試管，於28℃培養。當懷疑檢體中有非蛋白水解性B型、E型或F型產毒性肉毒桿菌時，接種檢體至TPGYT培養液中增菌。將檢體沿管壁緩緩接種至試管中，厭氧培養5日後，觀察增菌培養液，包括混濁度、氣體產生及粒狀培養基分解情形，並注意氣味。培養5日後，仍無明顯之細菌增長現象時，則再繼續培養10日，供作檢液。
3.4.2. 分離培養：
3.4.2.1. 前處理：
吸取 3.4.1 .節各試管檢液1或 2 m L至已滅菌附螺旋蓋試管中，添加等量經0.2 μm無菌濾膜過濾之無水乙醇，充分混合，在室溫下放置1小時。若欲直接自檢體中分離肉毒桿菌，則取1～2 mL或1～2 g保留之檢體，
加入等量經0.2 μm 無菌濾膜過濾之無水乙醇於附螺旋蓋試管中，充分混合，於室溫下放置1小時。或吸取3.4.1.
節檢液1或2 mL，於80℃加熱10～15分鐘，以破壞營養細胞（註2）。
註2：絕對不可以加熱方式處理非蛋白水解型肉毒桿菌。
3.4.2.2. 劃線培養：
以接種環取1或2環經 3.4.2 .1.節處理之檢液，劃線接種於AEYA培養基上。必要時，適當稀釋3.4.2.1.節處理之檢液以獲得良好分離的單一菌落。在厭氧環境，35℃下培養48小時（註3），觀察菌落型態。可疑肉毒桿菌
者，其菌落凸起或扁平、平滑或粗糙，菌落常呈現擴散而周緣輪廓不規則狀。在AEYA培養基上，以斜角度檢
視培養基時，菌落常呈現珍珠光澤。珍珠光澤區域常常跨越過菌落周緣之不規則狀輪廓，而呈現向外擴散之趨
勢。除了珍珠光澤區域外，C型、D型及E型肉毒桿菌之菌落，其外常圍繞著一約2～4 mm寬之黃色沈澱環。A
型及B型肉毒桿菌，通常菌落周圍之沈澱環較小(註4)。
註3：採用厭氧瓶或是厭氧性氣體產生系統，以維持一厭氧環境，亦可使用其它相似之系統以維持厭氧環境。
註4：為數甚多之梭狀桿菌屬細菌（Clostridium spp.）菌落形態與肉毒桿菌相似，但不會產生肉毒桿菌毒素。
3.5. 鑑定試驗：
3.5.1. 選取約10個生長良好之可疑菌落，各別接種至已滅菌CMM培養液，於35℃厭氧培養5日。接種可疑E型肉毒桿
菌至已滅菌TPGY培養液，於28℃厭氧培養5日。5日後，依3.6.1.4.節處理，以進行毒性試驗。
3.5.2. 將可能含毒素之培養液，以二重複再次劃線於AEYA培養基。其中一個培養皿於厭氧下35℃培養，另一培養皿置
於有氧環境下35℃培養。典型之肉毒桿菌菌落，僅在厭氧環境下生長（註5）。將經分離純化之肉毒桿菌，以芽胞狀態貯存於冰箱中，或是凍結乾燥保存。
註5：當無法由含肉毒桿菌毒素培養液中分離到肉毒桿菌時，表示肉毒桿菌在混合菌叢中相對之分離比例甚低，可經由系列性連續增菌培養步驟提高菌量，以分離到單一菌落。
3.5.3. 革蘭氏染色（Gram stain）：以無菌接種針自AEYA培養基中挑取可疑菌株，依下列步驟進行革蘭氏染色後鏡檢。
(1) 鉤取菌體，於載玻片上製成薄抹片，風乾或微熱固定。
(2) 初染：將已固定之抹片，用哈克氏結晶紫液染1分鐘後水洗，水洗時間應不超過5秒鐘。
(3) 媒染：加革蘭氏碘液作用1分鐘，水洗。
(4) 脫色：以95%乙醇洗至不再有紫色褪出時，再水洗，此步驟需時甚短，僅數秒即可，惟視抹片之厚薄而定。
(5) 複染：用哈克氏複染劑複染30秒鐘，水洗。
(6) 風乾。
(7) 鏡檢：呈現深紫色者為革蘭氏陽性菌，呈現淡紅色者為革蘭氏陰性菌。肉毒桿菌為革蘭氏陽性菌。
3.5.
4. 生化試驗：可參考使用經確效認可之市售生化檢測套組。
3.6. 肉毒桿菌毒素之檢測與型別鑑定：
3.6.1. 檢體之處理（註6）：
3.6.1.1. 含液體之食品：
取含液體之檢體25～50 g，於低溫下離心，取上清液供作肉毒桿菌毒性試驗用檢液。
3.6.1.2. 固態食品：
取經預冷（prechilled）處理之研缽及研杵，稱取固態檢體25～50 g，加入等量已滅菌之明膠－磷酸鹽緩衝溶
液，當檢體浸軟後研磨，於低溫下離心，取上清液供作毒性試驗用檢液。
3.6.1.3. 可疑容器檢體：
取已滅菌之明膠－磷酸鹽緩衝溶液數mL，清洗盛裝檢體之容器；儘可能減少明膠－磷酸鹽緩衝溶液之用量，以防止毒素被稀釋至檢測極限之下，必要時，清洗液於低溫下離心，取上清液供作毒性試驗用檢液。
3.6.1.
4. 增菌培養液：
取前述 3.5.1 .節TPGY增菌培養液10 mL，於低溫離心，取上清液，測定pH值，若超過pH 6.5，則以1N鹽酸溶液調整至pH 6.0～6.2，供作毒性試驗用檢液。
註6：(1) 檢體應置於密封且具有安全杯之離心機內離心。
(2) 供毒性試驗的上清液應經0.45 m無菌濾膜過濾，以避免或減低試驗小鼠非專一性死亡。
3.6.2. 毒性確認：
3.6.2 .1. 胰蛋白酶處理：
為檢測非蛋白水解型毒素，取經 3.6.1 .節處理過之部分檢液或TPGY增菌培養液，在檢測毒素前先以胰蛋白酶處理（註7）。將檢液以1N氫氧化鈉溶液或1N鹽酸溶液，調整pH值至6.2後，吸取 1.8 m L注入試管中，添加胰蛋白酶溶液0.2 m L，在35～37℃放置1小時，時時搖動之，作為胰蛋白酶處理組檢液。
註7： TPGYT培養液中含有胰蛋白酶，其增菌培養液不必再以胰蛋白酶處理，否則可能使存於其中已活化毒素被分解。
3.6.2 .2. 毒性試驗：
3.6.2 .2.1. 以明膠－磷酸鹽緩衝溶液將未經胰蛋白酶處理（未處理組）及經胰蛋白酶處理之檢液（胰蛋白酶處理組）
分別稀釋成5、10及100倍的稀釋檢液，備用。另取未處理組檢液1.5 mL，於100℃加熱10分鐘（熱處理
組）後，稀釋成5、10及100倍稀釋檢液，備用。
3.6.2 .2.2. 所有檢液包括未處理組、胰蛋白酶處理組及熱處理組之原液及各稀釋檢液，各取0.5 mL注射至小鼠腹腔，
均行二重複試驗（註8）。48小時內定時觀察試驗小鼠有無肉毒桿菌毒素中毒症狀及死亡，並作成紀錄。典型
之肉毒桿菌毒素中毒症狀，在投予檢液24小時內，引起小鼠皮毛豎立，繼而呼吸困難、四肢軟弱，終至呼
吸麻痺，呼吸衰竭死亡（註9）。經過48小時觀察，若僅有接受熱處理組檢液之小鼠存活，其餘試驗小鼠均死
亡，則須以更高稀釋倍數之檢液，重複此一毒性試驗。此毒性試驗中必須要有致小鼠死亡之稀釋倍數及不
會致死小鼠之稀釋倍數，以計算試驗終點或最小致死量（minimum lethal dose, MLD），以預估毒素含量。能
殺死所有接種小鼠之最高稀釋倍數謂之最小致死量，以計算出每mL或g檢液中含肉毒桿菌毒素的最小致死
量數值。
註8：熱會破壞肉毒桿菌毒素，因此檢液經100℃加熱10分鐘後，應不會引發小鼠死亡。
註9：沒有肉毒桿菌毒素中毒症狀之小鼠死亡，表示檢液中不含有肉毒桿菌毒素，小鼠之死亡可能肇因於其它化學物
質或外力（trauma）。
3.6.2 .3. 毒素型別鑑定：
3.6.2 .3.1. 將A、B、E及F型抗毒素原液，以無菌0.85%生理食鹽水稀釋至每mL含有2個國際單位。
3.6.2 .3.2. 取經3.6.2.2.節試驗，可推算出較高最小致死量之未處理組或胰蛋白酶處理組檢液（註10），進行毒性試驗用檢
液製備，其中至少需包括最小致死量之10、100及1000稀釋倍數。未處理組之毒性檢液，依照3.6.2.2.節進
行製備。
3.6.2 .3.3. 取3.6.2.3.1.節各型單價肉毒桿菌抗毒素0.5 mL分別注射至小鼠腹腔，經30分鐘至1小時後，再腹腔注射檢
液0.5 mL，每一稀釋檢液均行二重複試驗。每一稀釋之毒性試驗用檢液，亦注射至二隻未經任何抗毒素保
護的小鼠，以作為對照組。使用A、B、E及F四型單價抗毒素，每一抗毒素計使用6隻小鼠，四種抗毒素，
共24隻小鼠，外加三種稀釋對照組檢液，共6隻小鼠，合計使用30隻小鼠。觀察小鼠48小時，並記錄肉
毒桿菌毒素中毒症狀及死亡。當試驗結果顯示毒素未被中和時，則使用單價抗毒素測定C型及D型毒素，
與多價抗毒素重新測定A型至F型毒素。
註10：由於胰蛋白酶之持續作用會破壞肉毒桿菌毒素，當進行毒素型別鑑定時，檢液必須採用胰蛋白酶新鮮處理者。
3.6.2.3.
4. 肉毒桿菌A、B、E及F型毒素基因型別之鑑定，依第二部分：肉毒桿菌毒素基因之PCR檢測。
3.7. 肉毒桿菌毒素分析須知：
3.7.1. 試驗初期24小時，是觀察小鼠症狀和死亡之關鍵時刻，98～99%之試驗動物於24小時內死亡。典型之肉毒桿菌中毒
症狀和死亡，可能在投予含肉毒桿菌毒素之檢液後4到6小時內出現。
3.7.2. 當小鼠死亡發生在腹腔注射24小時之後，除非有非常明確之典型肉毒桿菌中毒症狀，否則僅屬疑似個案。
3.7.3. 當注射2或5倍之稀釋檢液的小鼠死亡，但不見任何注射更高稀釋倍數檢液的小鼠死亡，則僅屬疑似個案，小鼠死
亡可能是由於不明原因所致。
3.7.
4. 可用不易脫落之染料塗佈在小鼠尾部，以供識別投予不同稀釋倍數檢液之用。
3.7.5. 注射肉毒桿菌毒素的小鼠，在出現症狀之前可能變得較為過度活動（hyperactive）。
3.7.6. 注射檢液後可立即供應小鼠食物及飲水，其並不會影響試驗之正確性。
3.7.7. 復水後之抗毒素可冷藏保存6個月效期，冷凍保存則可維持更長的效期。
3.7.8. TPGY培養液具有相當之穩定性，可冷藏保存2～3週。
3.7.9. 使用CMM培養基應旋緊試管蓋，因為肉毒桿菌毒素可能吸著於培養基之肉粒上。
3.7.10.注射單價肉毒桿菌抗毒素之小鼠，再注射檢液可免於中毒和死亡，即可確認檢體中含有肉毒桿菌毒素，及該毒素型
別。
3.7.11.小鼠若無法受到一種單價肉毒桿菌抗毒素保護，仍然有死亡發生時，可能是由於檢體中的肉毒桿菌毒素含量太高，
或是檢體中可能存有一種以上之肉毒桿菌毒素，亦有可能由其他不明原因所引起。此時必須對含毒性之檢液進行高倍率稀釋，且以多價肉毒桿菌抗毒素取代單價肉毒桿菌抗毒素。某些耐熱之毒性物貿，可能引起加熱組及未加熱組試驗小鼠死亡。這些耐熱之毒性物質，可能遮掩肉毒桿菌毒素之毒性。
3.8. 可參考使用經確效認可之市售培養基及分生檢驗套組，惟檢驗結果有爭議時，應以傳統方法為主。
第二部份：肉毒桿菌毒素基因之PCR檢測
1. 適用範圍：本檢驗方法適用於肉毒桿菌菌株及食品檢體增菌液中肉毒桿菌毒素基因A型、B型、E型與F型之鑑別。
2. 檢驗方法：檢體之增菌液或分離純化後之菌株，經DNA萃取後，以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）及即時聚
合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）鑑別毒素基因之方法。
2.1. 工作環境：工作平台需寬敞、潔淨、光線良好。檢體前處理、檢體DNA抽取、PCR試劑配製及PCR等實驗過程皆需有
區隔空間，避免交叉污染。PCR試劑之配製應於生物安全操作櫃內進行。
2.2. 裝置（註1）
2.2.1 . 生物安全操作櫃（Biological safety cabinet, BSC）：第二等級（class II）（含）以上者。
2.2.2 . 聚合酶鏈反應器：GeneAmp? PCR System 9700，或同級品。
2.2.
3. 即時聚合酶鏈反應器（註2）：ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System或Roche LightCycler，或同級品。
2.2.4. 真空乾燥裝置：供DNA乾燥用。
2.2.5. 高壓滅菌釜。
2.2.6. 無菌操作台。
2.2.7. 加熱振盪器：具55℃溫控及振盪功能。
2.2.8 . 微量冷凍離心機（Micro refrigerated centrifuge）：可達20000 × g，並具4℃溫控功能。
2.2.9. 離心機：供各式微量離心管離心用。
2.2.10.分光光度計：具波長260 nm、280 nm。
2.2.11.冷凍設備：具冷藏及凍結功能。
2.2.12.旋渦混合器（Vortex mixer）。
2.2.1
3.電泳槽：供DNA電泳用。
2.2.14.照相裝置：供拍攝電泳膠片用。
2.2.15.紫外燈箱：具波長302 nm、365 nm紫外燈。
2.2.16.酸鹼度測定儀（pH meter）。
2.2.17.水浴裝置：溫差±1℃以內者。
2.2.18.天平：最大稱重量為2000 g ，靈敏度為0.1 g ；最大稱重量為100 g ，靈敏度為1 mg。
註1：本方法所使用或提及之產品品牌不代表為同類產品中最好者；反之，未使用或提及之產品品牌亦不代表為同類產品中較差者。
註2：確認試驗用。
2.3. 試藥
2.3.1 . D NA抽取用試藥：適用於革蘭氏陽性細菌DNA抽取之市售套組。
2.3.2. PCR用（註3）
2.3.2.1. 鑑別試驗用引子
2.3.2.1.1. A型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌A型毒素基因）
引子F：Type A-F, 5'- GTGATACAACCAGATGGTAGTTAT AG-3'
引子R：Type A-R, 5'-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAAC TTT-3'
PCR增幅產物大小983 bp
2.3.2.1.2. B型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌B型毒素基因）
引子F：Type B-F, 5'-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCC AG-3'
引子R：Type B-R, 5'-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3'
PCR增幅產物大小492 bp
2.3.2.1.3. E型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌E型毒素基因）
引子F：Type E-F, 5'-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3'
引子R：Type E-R, 5'-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3'
PCR增幅產物大小410 bp
2.3.2.1.4. F型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌F型毒素基因）
引子F：Type F-F, 5'-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGT GCT-3'
引子R：Type F-R, 5'-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3'
PCR增幅產物大小1137 bp
2.3.2.1.5. 梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium cluster I）通用引子（標的基因：16S ribosomal RNA，供作內部對照基因）
引子F：CL-F, 5'- TACCHRAGGAGGAAGCCAC-3'
引子R：CL-R, 5'- GTTCTTCCTAATCTCTACGCAT-3'
PCR增幅產物大小約232 bp。
2.3.2.2. 確認試驗用引子及探針
2.3.2.2.1. A型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌A型毒素基因）
引子F：CbA-F, 5'-GGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATC-3'
引子R：CbA-R, 5'-GCTAATGTTACTGCTGGATCTGTAG-3'
探針P：CbA-P, 5'-（FAM）-TCTTTTAGGTGCAGGCAAATTT- (BHQ1)-3'
PCR增幅產物大小75 bp
2.3.2.2.2. B型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌B型毒素基因）
引子F：CbB-F, 5'- AGTAATCCAGGAGAAGTGGAGCGA-3'
引子R：CbB-R, 5'- CRAAGCCTTCCCTTGATGCAAA-3'
探針P：CbB-P, 5'-(FAM)-CGCAAATTTAATAATATTTGGA
CCTGGGCC-(BHQ1)-3'
PCR增幅產物大小136 bp
2.3.2.2.3. E型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌E型毒素基因）
引子F：CbE-F, 5'-CTATCCAAAATGATGCTTATATACCAAA-3'
引子R：CbE-R, 5'- GGCACTTTCTGTGCATCTAAATA-3'
探針P：CbE-P, 5'-(FAM)-ATGATTCTAATGGAACAAGTGAT
ATAGAACAACATGATGT-(BHQ1)-3'
PCR增幅產物大小115 bp
2.3.2.2.4. F型毒素基因肉毒桿菌（標的基因：肉毒桿菌F型毒素基因）
引子F：CbF-F, 5'-GCAATATAGGATTACTAGGTTTTCATTC-3'
引子R：CbF-R, 5'-GAAATAAAACTCCAAAAGCATCCATT -3'
探針P：CbF-P, 5'-(FAM)-TTGGTTGCTAGTAGTTGGTATTAT
AACAA-(BHQ1)-3'
PCR增幅產物大小112 bp
2.3.2.2.5. 梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium cluster I）通用引子與探針（標的基因：16S ribosomal RNA，供作內部對照基因）
引子F：CL-F, 5'- TACCHRAGGAGGAAGCCAC-3'
引子R：CL-R, 5'- GTTCTTCCTAATCTCTACGCAT-3'
探針P：U 16C spp, 5'-(FAM)- GTGCCAGCAGCCGCGGTAATA
CG-(BHQ1)-3'
PCR增幅產物大小約232 bp。
註3：1.合成之引子及探針，拆封後，以無菌去離子水稀釋成適當濃度，分裝後置於-20℃貯存備用，另探針需避光保存，探針5'端採用6-carboxy-fluorescein（FAM）標記，3'端採用Black Hole Quencher 1（BHQ1）
標記。
2.引子序列中，R為混合鹼基代碼（A/G），表示同時含A及G；H為混合鹼基代碼（A/C/T），表示同
時含A、C及T。
2.3.2.3. 去氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP）溶液
含去氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate, dATP），去氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate, dCTP），去氧鳥糞嘌呤苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate, dGTP）及去氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate, dTTP）各2.5 mM之溶液。
2.3.2.4. 聚合酶
Taq DNA polymerase（2 U/μL），內附10倍PCR緩衝溶液及25 m M 氯化鎂溶液，或同級品。
2.3.2.5. TaqMan Universal PCR Master Mix（確認試驗用，適用於ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System）
本試劑內含real-time PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等，使用時添加引子、探針及待測檢體DNA。
2.3.2.6. LightCycler? FastStart DNA Master HybProbe（確認試驗用，適用於Roche LightCycler）
本試劑內含real-time PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等，且內附25 mM氯化鎂溶液，使用時添加引子、探針及待測檢體DNA。
2.3.3. 電泳用：溴化乙錠（ethidium bromide）、瓊膠（agarose）、溴酚藍（bromophenol blue）、二甲苯藍（xylene cyanol FF）、乙
二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, Na2-EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane, Tris）、氫氧化鈉及硼酸採試藥級。瓊膠（agarose）及甘油採分子生物分析級試藥。DNA分子量標記物質（DNA molecular weight marker）：100 bp DNA ladder marker。
2.3.4. 對照用物質：A型、B型、E型與F型毒素基因肉毒桿菌、參考質體或其DNA。
2.4. 器具及材料（註4）
2.4.1. 微量吸管（Micropipette）：10 μL、20 μL、100 μL、200 μL及1000 μL。
2.4.2. 吸管尖頭（Tip）：可滅菌。10 μL、20 μL、200 μL及1000 μL。
2.4.
3. 電泳膠片製作盤。
2.4.4. 離心管：200 μL、600 μL、 1.5 m L及2 mL。
2.4.5. PCR反應管：200 μL及500 μL。
2.4.6. PCR玻璃毛細管：Roche LightCycler專用。
2.4.7 . P CR反應盤：具96個反應孔，適用於ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System。
2.4.8. 玻璃或塑膠瓶：50 mL、100 mL、250 mL、500 mL、1000 m L及2000 mL。
註4：使用之塑膠或玻璃器皿均為無DNase污染。
2.5. 試劑之配製
2.5.1. 0.5M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液
稱取乙二胺四乙酸二鈉186.1 g ，加去離子水800 m L溶解，再加入氫氧化鈉20 g 以調整pH值至8.0，並加去
離子水使成1000 mL。
2.5.2. 0.5倍TBE（Tris-borate-EDTA）緩衝溶液
稱取三羥甲基氨基甲烷54 g 及硼酸27.5 g ，加入0.5M EDTA溶液20 mL，再加水溶解使成1000 mL，供作5倍TBE 緩衝溶液，或使用市售5倍TBE緩衝溶液。臨用時以去離子水將5倍TBE緩衝溶液稀釋為0.5倍，作為0.5倍TBE緩衝溶液。
2.5.
3. 1.5%膠片
稱取瓊膠 1.5 g ，加入0.5倍TBE緩衝溶液100 mL，加熱攪拌至瓊膠完全溶解，適當冷卻後，倒入電泳膠片製作盤，並置入適當之尺梳，待膠片凝固後，即可使用。
2.5.4. 6倍載入膠片緩衝溶液（6 × gel loading buffer）
稱取溴酚藍25 g 及二甲苯藍0.25 g ，加入甘油30 mL，再加入無菌去離子水使成100 mL，並置於4℃冰箱貯存備用。
2.5.5. 膠片染液
稱取溴化乙錠0.1 g ，加水10 m L溶解，供作原液（10 mg/mL），使用前以水稀釋成1 μg/mL。溴化乙錠為致癌物質，配製時應注意安全。
2.5.6. PCR溶液（註5）
2.5.6.1. 鑑別試驗用
（A型、B型、E型與F型毒素基因肉毒桿菌）
2.5.6.2. ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System確認試驗用
（A型、E型與F型毒素基因肉毒桿菌）
2.5.6.
3. ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System確認試驗用
（B型毒素基因肉毒桿菌）
2.5.6.4. Roche LightCycler確認試驗用
（A型、B型、E型與F型毒素基因肉毒桿菌）
註5： PCR溶液應置於冰浴中配製。
2.6. 檢體DNA溶液之製備
2.6.1. 檢體增菌液之DNA溶液製備
自第一部份 3.4.1 .節增菌液中吸取菌液1 mL，置入已滅菌之 1.5 m L離心管中，以14000 × g離心2分鐘，去除上清液。
2.6.1 .1. 直接煮沸法
將沉澱物加入無菌去離子水1 mL，震盪混合均勻，以14000 × g離心2分鐘，去除上清液。再將沉澱物加入無菌去離子水1 mL，震盪混合均勻，置入加熱振盪器中煮沸10分鐘，取出離心管，待冷卻後以14000 × g離心2
分鐘，吸取上清液至另一已滅菌 1.5 m L離心管，作為檢體DNA原液，置於-20℃冷凍保存。
2.6.1.2. 抽取DNA法
採用適用於革蘭氏陽性細菌DNA抽取之市售套組，並依套組操作說明步驟抽取DNA。抽取之DNA溶液收集至已滅菌之 1.5 m L離心管，作為檢體DNA原液，置於-20℃冷凍保存。
2.6.2. 肉毒桿菌分離菌株之DNA溶液製備
自培養基上鈎取一接種環的菌量，置入含有無菌去離子水 1 m L之已滅菌 1.5 m L離心管中，震盪混合均勻，置入加熱振盪器中煮沸10分鐘，取出離心管，待冷卻後以14000 × g離心2分鐘，吸取上清液至另一已滅菌 1.5 m L離心管，作為檢體DNA原液，置於-20℃冷凍保存。亦可依 2.6.1 .2.節進行檢體DNA原液之製備。
2.6.
3. DNA濃度測定及純度判斷
取適量之檢體DNA原液，以無菌去離子水做適當倍數之稀釋，分別測定260 nm及280 nm之吸光值（O.D.）。
以波長260 nm吸光值乘50 ng/μL及稀釋倍數，即為檢體DNA原液濃度。DNA溶液純度則以O.D.260/O.D.280 比值作判斷，其比值應介於1.7～2.0。
2.7. 鑑別試驗（註6）
2.7.1. PCR操作步驟
以無菌去離子水適當稀釋檢體DNA原液、引子備用。取PCR反應管，依照 2.5.6 .1.節配製PCR溶液，依序加入無菌去離子水、10倍PCR緩衝溶液、25 mM氯化鎂溶液、dNTP、引子、Taq DNA polymerase及檢體DNA溶液，混合均勻後，將反應管置於離心機瞬間離心，使混合液聚積於反應管之底部。移入PCR反應器，並參照2.7.2.節設定反應條件，進行反應，結束後，取出PCR增幅產物，進行電泳分析。
2.7.2. PCR條件
步驟溫度時間
1. 最初變性95℃ 5 min
2. 變性94℃ 1 min
3. 黏接60℃ 1 min
4. 延展72℃ 1 min
步驟2至步驟4，共進行30個循環反應。
5. 最終延展72℃10 min
2.7.
3. 膠片電泳分析
取適量之6倍載入膠片緩衝溶液，分別與無菌去離子水（空白組）及PCR增幅產物混合均勻，注入1.5%膠片孔中，以50或100伏特電壓進行電泳。同時另取DNA分子量標記物質進行電泳，作為PCR增幅產物大小之判別與計算依據。電泳後之膠片置入膠片染液中進行染色約15分鐘，置入水中漂洗及褪染，再以紫外光照射觀察是否有明顯之DNA螢光帶，並判讀結果。同時另測試正反應及負反應對照組。
2.7.4. 鑑別
檢體DNA需同時進行內部對照基因及四型肉毒桿菌毒素基因正反應對照組（A型、B型、E型與F型）之PCR 測試。檢體DNA之PCR增幅產物電泳結果，與正反應對照組及DNA分子量標記物質之電泳結果進行相互比對，當檢體DNA與正反應對照組DNA均出現PCR增幅產物，經由DNA分子量標記物質估算PCR增幅產物大小分別為983 bp（A型）；492 bp（B型）；410 bp（E型）；1137 bp（F型）者，即判定該檢體含有肉毒桿菌A型、B型、E型或F型毒素基因。
註6：1. PCR鑑別試驗結果之判讀係以PCR增幅產物大小判定，當測試結果判讀困難時，應進行確認試驗。
2. 本PCR定性反應條件係採GeneAmp? PCR System 9700設定之，當使用其他機型時，應自行探討反應條件。
2.8. 確認試驗：本實驗視需要而操作之。
2.8.1. Real-time PCR操作步驟
2.8.1.1. Real-time PCR－ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System
以無菌去離子水適當稀釋檢體DNA原液、引子及探針備用。取已滅菌之1.5 mL離心管，依照 2.5.6 .2.節與
2.5.6.
3.節配製PCR溶液，依序加入TaqMan Universal PCR Master Mix、稀釋過之引子及探針，混合均勻後，分裝
20 μL入PCR反應盤的反應孔中，各別加入檢體DNA溶液5 μL，再將PCR反應盤置於離心機中，以200 × g瞬
間離心，移入real-time PCR反應器，依下列條件進行反應。同時另製作正反應及負反應對照組。
步驟溫度時間
1. 熱活化50°C 2 min
2. 最初變性95°C 10 min
3. 變性95°C 15 sec
4. 黏接、延展60°C 1 min
步驟3至步驟4，共進行45個循環反應。
設定PCR模式：9600 Emulation
設定反應體積：25 μL
2.8.1.2. Real-time PCR-Roche LightCycler
以無菌去離子水適當稀釋檢體DNA原液、引子及探針備用。取PCR反應管，依照 2.5.6 .4.節配製PCR溶液，
依序加入LightCycler? FastStart DNA Master HybProbe、25 m M氯化鎂溶液、稀釋過之引子及探針，混合均勻後，分
裝15 μL於玻璃毛細管中，各別加入檢體DNA溶液5 μL，再將毛細管置於離心機中，以800 × g 瞬間離心，移
入real-time PCR反應器，依下列條件進行反應。同時另製作正反應及負反應對照組。
步驟溫度時間
1. 最初變性95°C 10 min
2. 變性95°C 5 sec
3. 黏接60°C25 sec
4. 延展72°C 8 sec
步驟2至步驟4，共進行45個循環反應。
5. 冷卻40°C 45 sec
2.8.2. Real-time PCR螢光分析
檢體DNA經real-time PCR反應後，直接從real-time PCR反應器上之螢幕觀察探針所產生之螢光增幅曲線，即可判讀反應結果。同時另測試正反應及負反應對照組。
2.8.
3. 確認
檢體DNA需同時進行內部對照基因及四型肉毒桿菌毒素基因之real-time PCR測試。檢體DNA之PCR增幅產物螢光分析圖與正反應對照組螢光分析圖進行相互比對，當檢體DNA與正反應對照組之PCR螢光分析圖，均出現經由探針所產生之螢光增幅曲線，即可視所使用之肉毒桿菌毒素基因real-time PCR探針種類（A型、B型、E型與F型），確認該PCR增幅產物為肉毒桿菌A型、B型、E型或F型毒素基因之基因片段，可確認該檢體中含有A型、B型、E 型或F型肉毒桿菌。
附註：第二部份肉毒桿菌毒素基因之PCR檢測可視需要執行。
檢驗流程圖
生物梅里埃微生物快速检验建议方案 一、致病菌检验现状 常见细菌性食物中毒的病原微生物有：1、致病性大肠杆菌（特别是出血性大肠杆菌O157：H7）；2、沙门氏菌属；3、致病性弧菌（包括：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）；4、金黄色葡萄球菌及其肠毒素；5、近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李司特菌、空肠弯曲菌等。 因此，包括上述致病菌在内的致病微生物的快速检验，对早日弄清食物中毒的病因，控制疫情，提高卫生防疫水平非常重要。 致病菌常规检验方法大致是： 其中，增菌是不可缺少的步骤。 1、如果在增菌后能够利用自动化仪器对标本进行快速筛检，就可以尽快发 现在那些标本中可能存在致病菌，可能存在那些致病菌，从而可大大缩 小检验范围，集中人力检验可疑标本和可疑致病菌。 2、由于大多数细菌目前没有血清试剂，而传统生化鉴定试验周期长，操作 繁琐，试剂质量无法保证，严重影响了致病菌确认工作。 3、选择性分离培养的培养基上挑选可疑菌落需要经验，存在漏检的可能。 4、葡萄球菌肠毒素热稳定性很高，加工后的食物虽然检不出，金黄色葡萄 球菌，但仍有可能存在葡萄球菌肠毒素，而肠毒素的常规检验方法需要 做动物实验，难度大，周期长。 鉴于上述原因，我们提出应用“全自动荧光免疫分析仪+API鉴定系统” 的快速检验方案如下：
二、致病菌快速检验系统建议方案 （一）检验流程 本系统能达到的效果 1、葡萄球菌肠毒素：从标本处理到上机检测只需1小时。 2、大肠杆菌O157、沙门氏菌、李司特菌、空肠弯曲菌的检验：在增 菌后1小时内即可完成筛检试验，从而缩小检验范围、明确检验 对象、提高总体检验速度。 3、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等最常 见肠道致病菌的生化鉴定时间缩短到4小时。 4、包括：革兰氏阴性杆菌（108种）、非肠道革兰氏阴性杆菌（64 种）、葡萄球菌（22种）、链球菌（47种）、酵母样真菌（43种）、 厌氧菌（67种）、棒状杆菌（33种）、李司特菌（6种）、奈瑟氏 及嗜血杆菌（10种）、弯曲菌（18种）、芽孢杆菌（24种）、乳酸 菌（52种）、肠杆菌分型（111种）在内的五百多种细菌可以得到 快速、准确的鉴定。
附件 食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗 1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。 2 檢驗方法〆 2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換 氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 2.2 器具及材料〆 2.2.1 乾熱滅菌器。 2.2.2 高壓滅菌釜。 2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。 2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。 2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。 2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL 之刻度。 2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。 2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅 菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。 2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其 他缺點。 2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍 或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。 2.2.11 pH測定儀。 2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。 2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。 2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
食品微生物检验技术课程文献综述 题目: 常见致病菌导致的食物中毒及其检测姓名: 木日西提江 学院: 新疆农业大学食品科学与药学学院专业: 食品科学 班级: 071班 学号: 074031156 指导教师: 王伟 2010年12 月7 日
常见致病菌导致的食物中毒及其检测 摘要:食品安全与食源性疾病已成为一个全球性的重大公共卫生问题，而食物中毒作为最典型的一大类食源性疾病更得到了世界各国政府的广泛关注与重视。凡是导致机体正常生理功能破坏，引发机体病理改变甚至死亡的物质被称为毒物。毒物随食物或毒物被当作食物进入人体引起的中毒被称为食物中毒。本文以常见致病菌导致的食物中毒为出发点，对常见食物中毒分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性三大类，叙述其中毒原理及常见症状，描述食物中毒的发病原理，发病症状，检验方法（包括快速检验）。并详细描述微生物的快速检测。 关键字致病菌沙门氏菌检验快速检验 正文 食物中毒是指吃了不洁或有毒食物而导致的疾病。通常在吃了有问题的食物1至72小时内发病，病情严重者可以致命。食物中毒一般分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性（包括细菌性和真菌性食物中毒）。 一、化学性食物中毒 化学性食物中毒是指误食有毒化学物质，如鼠药、农药、亚硝酸盐等，或食入被其污染的食物而引起的中毒。发病率和病死率均比较高。中毒症状急性中毒有心悸，面颈、四肢肌肉颤动，有手抖甚至不能站立，头晕，乏力，原有心律失常的患者更容易发生反应，心动过速，室性早搏，心电图示S-T段压低与T波倒置。其中常见的化学性食物中毒有： （一）毒鼠强中毒：毒鼠强毒性极大，对人致死量5—12毫克。一般在误食10－30分钟后出现中毒症状。轻度中毒表现头痛、头晕、乏力、恶心、呕吐、口唇麻木、酒醉感。重度中毒表现突然晕倒，癫痫样大发作，发作时全身抽搐、口吐白沫、小便失禁、意识丧失。 （二）亚硝酸盐中毒：俗称“工业用盐”。摄入亚硝酸盐0.2-0.5克就可以引起食物中毒，3克可导致死亡。发病急，中毒表现为口唇、舌尖、指尖青紫等缺氧症状，重者眼结膜、面部及全身皮肤青紫。自觉症状有头晕、头痛、无力、心率快等。急救处理：催吐、洗胃和导泻以消除毒物；应用氧化型亚甲蓝（美蓝）、
食品微生物检验技术复 习题 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
名词解释 样品（sample）是指从某一总体中抽出的一部分。 食品采样（sampling）是指从较大批量食品中抽取能较好地代表其总体样品的方法。 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。 V-P试验：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 生理生化试验：微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 硫化氢（H2S）试验：有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 增殖培养基: 在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。 外源性污染：食品在生产加工、运输、贮藏、销售食品过程中不遵守操作规程或不按卫生要求使食品发生污染称为外源性污染，也称为第二次污染． 环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。 微生物性食物中毒：食用被微生物或微生物毒素污染的食品而引起的中毒称为微生物性食物中毒。 无菌接种操作：培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具在无菌条件下接种含菌材料于培养基上，这过程叫做无菌接种操作。 菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。 细菌总数：指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。 大肠菌群：系指一群在37度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。 淀粉水解试验：某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 糖酵解试验：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。甲基红（Methyl Red）试验：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至以下，使甲基红指示剂变红。 靛基质（Imdole）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。尿素酶（Urease）试验：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。氧化酶（Oxidase）试验：氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验：试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。选择培养基:在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。鉴别培养基: 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。 无菌技术:指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。玻片凝集法：是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。试管凝集法：是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。 沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。大肠菌群MPN：大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。 大肠菌群值：大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。内源性污染：凡由动物体在生活过程中，由于本身带染的微生物而造成食品的污染者，称为内源性污染，也称第一次污染．食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程．
食品微生物检验的内容及检测技术 食品安全检验过程的主要内容 食品微生物的检验。食物在生产过程中以及放置过程中会受到环境中微生物的损坏或影响，在部分研究中，将食品中细菌数量对食品的损坏程度作为食品安全检测的首要内容。在食品微生物的检验过程中，我们主要对人体有害微生物进行检验，其中在食品安全检验过程中，因为食品中有多种微生物共存现象，所以在检验前，微生物检验员要把不同的菌体进行分离，这样才能更加清楚的了解各种微生物的数量及菌体的分布情况，包括生产型食品微生物，如醋酸杆菌，酵母菌等和使食物变质的微生物，如霉菌、细菌等和食源性病原微生物如溶血性大肠杆菌，肉毒杆菌等。对食品原辅料微生物的控制和产成品微生物的检验是保证食品安全的重 要途径。 针对食品致病菌的相关检验。不同的致病菌会对人们的身体健康有不同程度的危害，像我们在生活中经常吃到的大米，有些不法商家将发霉的大米加工后再次放入市场进行二次销售，虽然经加工后，在外表上和普通大米没啥两样，但这种大米中含有黄曲霉这一致病菌，据可靠信息表明，黄曲霉的危害性十分巨大，如果人们长时间吃这样的大米，出现
癌症的风险要比常人高出很多倍，由此可见，食品中致病菌的检验是保证我们能吃到放心食品十分关键的微生物检测技术，所以我们在致病菌的检验上对不同种类的致病菌进行定量严格检验。如乳制品和肉制品的致病菌主要是黄曲霉菌和大肠杆菌，而蛋制品中则容易出现染沙门菌、大肠菌群、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，罐头食品容易出现肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌。
食品微生物检验中的主要特点 对食品检测要求相对较高。在食品微生物的一系列检验中，由于食品中涉及的微生物种类较多，因此加大了食品微生物检验的难度。国家标准或行业标准对不同食品中微生物的含量特别是致病菌的含量有明确的要求。在食品的运输过程中，食品致病菌以及其他微生物对相应的食品有一定的污染，随着微生物种类的增多，检测人员需要对食品受致病菌影响的程度、食品保质期以及其他相关的标准进行测量，难度会随着微生物种类的增多而复杂。所以在微生物检验上我们对每一阶段的食品安全检测都要重视，在各个微生物的测量上，相关的检测技术要求就有所提高。 食品微生物检验效率。随着食品市场的商品流通提高，人们对食品需求不断增加，而食品安全问题却在日益严重，为了保障人们在能够及时满足食品种类和数量要求的同时，进一步促进食品安全的保障措施落实，必须加强食品安全的检验效率。当前的食品生产企业主要是采用大规模的流水线式生产方式，为了提高产出效率，在食品安全的微生物检验工作上往往会出现漏洞和懈怠。食品微生物检验效率的高低以及检验效果的好坏主要受到该企业的检验手段熟练程度以及检验设备精确程度的影响。特别是散货产品，食品微生物的检验效率关系到出厂产品的新鲜度，如果检验效率过低，投放入市场的食品很有可能会提前出现变质等现象。因
《食品微生物检验技术》期末考试卷 适用班级：考试方式：闭卷 班级学号姓名 一、名词解释： 1.细菌：是一类细胞细而短（细胞直径约0.5μm，长度约0.5～5μm）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。 2.菌落：固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落（colony）。 3.放线菌：是一类呈菌丝状生长、主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。 4.菌丝体：许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 5.生长因子：通常是指那些微生物生长所必需而且需要量很小的，但微生物自身不能合成的，必须在培养基中加入的有机营养物。 6.培养基：根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质称为培养基。 7.消毒：是指利用某些理化方法杀死物体表面或内部所有对人体或动植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。 8.菌株：又称品系（在病毒中则称毒株或株），表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。 9.诱变育种：是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，再从中筛选出少数符合育种目的的突变株。 10.干酪：是在乳中（也可用脱脂奶油或稀奶油）加入适量的乳酸菌发酵剂和凝乳酶，使蛋白质（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，将凝块压成块状而制成的产品。
11.食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程 12.发酵乳制品：是指良好的原料乳经过杀菌作用接种特定的微生物（主要是乳酸菌）进行发酵，产生具有特殊风味的食品，称为发酵乳制品。 13.栅栏技术：已知的防腐方法根据其防腐原理归结为高温处理，低温冷藏或冻结，降低水分活性，酸化，降低氧化还原值和添加防腐剂等几种，即可归结为少数几个因子。把这些起控制作用的因子，称作栅栏因子。栅栏因子共同防腐作用的内在统一，称作栅栏技术。 14.食物中毒：是指人体因食用了含有害微生物、微生物毒素或化学性有害物质的食物而出现的非传染性的中毒。 15.双歧因子：一种能促进双歧杆菌生长，不被人体吸收利用的天然或人工合成的物质。 二、填空题： 1.原核微生物中常见的类群有细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、螺旋体、衣原体、立克次体等。 2.肽聚糖是原核微生物细胞壁所特有的成分，是由N- 乙酰葡萄糖胺（NAG）、N- 乙酰胞壁酸（NAM）和短肽聚合而成的网状结构的大分子化合物。 3.放线菌的菌丝由于形态与功能不同分成三类：基内菌丝、气生菌丝、孢子丝。 4.在自然界中霉菌主要是形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖，无性孢子有孢子囊孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子和芽孢子。有性孢子常见的有卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子。 5.微生物生长所需的营养物质应该包含组成细胞的各种化学元素。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可分成碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类。 6.配制培养基的基本原则：根据不同微生物对营养的要求、根据营养物质的浓度及配比、适当的pH 、培养基中原料的选择。 7.高压蒸汽灭菌法一般采用0.1 MPa 的压力、121摄氏度处理20min。 8.目前根据发酵乳制品的生产过程、发酵剂的种类、产品的特征及其他特性的不同大致
食品微生物检验方法（FDA与ISO对比） 内容提要： ●菌落总数检测 ●大肠菌群及大肠杆菌检测 ●金黄色葡萄球菌检测 ●沙门氏菌检测 ●单核细胞增生李斯特氏菌检测 菌落总数测定——菌落总数的概念 ●菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。 菌落总数测定——卫生学意义 ●判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 ●及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。 ●通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 FDA BAM 菌落总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 ℃48 ±2h 菌落计数 FDA BAM 菌落计数方法 ●选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d ●所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。EAPC：estimated aerobic plate count ●所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。 ●所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml （g）为＞65*100* 1/d。 ●无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。 ●最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
食品微生物检验技能试题一 一、有两管菌种，一管为金黄葡萄球菌，一管为大肠杆菌，但标签已脱落，请通过染色实验将其分开。（40分） 1、涂片、干燥、固定（10分） 2、染色（15分） 3、镜检（10分） 4、报告（5分） 二、酱油中细菌总数的测定（60分） 1、实验准备（20分） 2、样品稀释与培养（20分） 3、菌落计数方法（10分） 4、菌落计数的报告（10分 答案要点 一、菌种区分 1、涂片、干燥、固定 （1）取两块洁净载玻片，分别在载玻片中央滴一滴生理盐水，用无菌操作分别挑取菌种于载玻片的水滴中，调匀涂成薄膜，直径1.5cm左右。 （2）干燥室温干燥或用电吹风吹干。 （3）固定涂片面上，在酒精灯上过火三次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则，形态会破坏。 2、染色 （1）初染加草酸铵结晶紫染色液染色1分钟，用水冲洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上的水甩干净，在载玻片下衬以白色背景，滴加95%的酒精脱色，直洗至流出的酒精刚刚不出现紫色为止（0.5分钟），立即用水冲净酒精。 （4）复染用番红染液染1-2分钟，水洗。 3、镜检干燥后，置显微镜下观察。 4、报告球状、染成紫色者为金黄葡萄球菌，杆状、染成红色者为大肠杆菌。
二、酱油中细菌总数的测定 1、实验准备 （1）酱油 （2）1ml与10ml吸管将吸管洗净烘干，塞入少量脱脂棉，卷好防潮纸进行干热灭菌（160℃、2小时）或加压灭菌。（121℃、30分钟） （3）平皿将平皿分为10个一卷，用防潮纸包好，同上述吸管一起进行灭菌。（4）备一瓶90ml和三管9ml的生理盐水，配以松紧适度的棉塞，用防潮纸将口部包好，同上述材料一起进行加压蒸汽灭菌，但需使灭菌后仍能保持原有毫升数（也可应用生理盐水灭菌后直接吸取的办法）。 （5）培养基蛋白胨牛肉膏氯化钠琼脂培养基。将培养基用碱液调至PH7.2-7.4,装入灭菌的试管中约15ml,进行加压灭菌后，保温45℃备用。 2、样品稀释与培养 （1）用10ml无菌吸管将酱油样品注入90ml无菌生理盐水内，充分摇匀，作成1：10的稀释液。应严格无菌操作。 （2）用1ml无菌吸管，吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml无菌生理盐水的试管内，振荡试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 （3）另取1ml无菌吸管，按上项操作顺序做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，即换用一支灭菌吸管，配成1：1000和1：10000的稀释液。 （4）再取三支1ml无菌吸管（或使用该稀释度的吸管），分别吸取1：10、1：100和1：1000的稀释液各1ml于平皿内，每个稀释度做两个平皿。 （5）立即将15ml已冷却至45℃的培养基注入平皿内，并转动平皿，使其混合均匀。 （6）待琼脂凝固后，用纸包好，反转平皿，置于37℃恒温箱内培养24小时后取出，计算平皿内细菌菌落数目，成以稀释倍数，即得每毫升样品所含菌落总数。 4、菌落计数方法 （1）从温箱中取出平皿，用蜡笔将皿底分为若干等分区域（若菌落稀少，也可不分） （2）以左手拇指、无名指、小指持握平皿，斜置自然光下，皿底以食指、中指衬托显出昏暗背景以利菌落观察，右手持蜡笔式钢笔计点菌落数，每数一区，于边上标记计数，再用放大镜检查，有无遗漏。合计各区菌落数即为一皿的菌落总
食品微生物之檢驗方法－肉毒桿菌之檢驗 101年5月16日署授食字第1011901882號公告第一部份：肉毒桿菌及其毒素之檢驗 1. 適用範圍：本方法適用於食品中肉毒桿菌及其毒素之檢驗。 2. 實驗室生物安全措施： 2.1. 生物危害標幟應懸掛於實驗室入口處，並管制人員進入，以及將該實驗區之人數維持至最低需求。 2.2. 備有治療用肉毒桿菌抗毒素之醫療院所緊急連絡電話號碼應張貼在明顯處。 2.3. 實驗操作應在生物安全操作櫃進行。 2.4. 應有洗眼用噴水器及腳踏或自動式洗手設備。 2.5. 絕不可以用口吸取任何檢體，應以機械式吸管輔助器操作。 2.6. 工作前、後應以1%次氯酸溶液擦拭工作檯。 2.7. 實驗後，工作人員應將所使用過之器材及廢棄物，立即滅菌處理。 3. 檢驗方法：檢體經前處理後，經增菌，續以選擇性培養基培養，配合肉毒桿菌毒素檢測與型別鑑定之方法。 3.1. 工作環境：工作平檯須寬敞、潔淨、光線良好，操作平檯光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵 及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 3.2. 器具及材料： 3.2.1. 生物安全操作櫃（Biological safety cabinet, BSC）：第二等級（class II）（含）以上者。 3.2.2. 高壓滅菌釜。 3.2.3. 乾熱滅菌器。 3.2. 4. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。 3.2.5. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1℃以內者。 3.2.6. 天平：可稱量到2000 g 者，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g 者，靈敏度為5 mg。 3.2.7. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 3.2.8. 加熱板（Hot plate）。
一、定义 通过一定的实验方法测定食品中的微生物，特别是致病微生物的数量、种类、性质，从而判断食品的卫生质量，保证消费者的身体健康。 二、食品微生物检验的内容 卫生指标菌检验 菌落总数测定 细菌检验 大肠菌群数测定 致病菌检验 霉菌、酵母菌数测定 真菌检验 产毒霉菌检验 霉菌毒素测定 三、食品微生物检验的特点 1、具有法规性 2、检验的范围广 3、杂菌含量多，要检验的菌少。 （1）需要增菌（2）抑制杂菌 4、检验结果具有数量界限 5、需要采样后尽快检验，快出结果 四、意义： 检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成经济损失。 五、食品卫生细菌常规检验项目 卫生指标菌 菌落总数测定 大肠菌群测定 沙门氏菌检验 u 致病菌 志贺氏菌检验 金黄色葡萄球菌检验 溶血性链球菌检验 六、细菌污染食品的途径 1、食品加工原料的污染 2、产、储、运、销过程中的细菌污染 3、从业人员的污染 4、食品加工过程中的污染 第一章 食品微生物检验中的生理生化实验 设计生化实验的原则：在实验中加入某些化学物质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入<的化学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。 一、过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理 1、2H 2O 2 过氧化氢酶 2H 2O+O 2 阳性 2、过氧化物酶： RH 2+H 2O 2 过氧化物酶 R+2H 2O 阳性：细菌变为黑褐色； 阴性： 不变色。 阳性 阴性 二、细胞色素氧化酶实验原理 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。 三、氰化钾实验 阳性： 不抑菌，变混浊 阴性：抑菌 无 蓝 四、硝酸盐还原实验原理 KNO 3 还原酶 KNO 2KNO 2 +对氨基苯磺酸+ a -萘胺 红色化合物（立刻或数分钟内）红色 无色 五、糖发酵实验 分解糖产酸，PH 值下降，使 培养基的 酸碱指示剂发生变化。 阳性：产酸产气 六、氧化发酵实验（O/F 实验 有些微生物分解葡萄糖 必须有氧参加，此种细菌菌称为氧化型； 阳 阴 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。 灭菌琼脂（厌氧） 七、甲基红实验（MR 实验）和V-P 实验 1、MR 实验原理：一些细菌分解葡萄糖产 生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH 值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应 2、V-P 实验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（实验结果同MR 实验） 阴 八 、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验） 一些微生物可以以铵盐作为唯一 的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳 源，在柠檬酸盐培养基上生长，分 解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基 变成碱性，酸碱指示剂变色 九、丙二酸钠实验 一些微生物可以以丙二酸钠 作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 十、马尿酸盐实验 一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。 十一、明胶液化实验 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。 十二、苯丙氨酸脱氨酶实验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶， 可以脱氨 生成苯丙酮酸， 其与FeCl 3反应产生绿色 。 十三、氨基酸脱羧酶实验 一些细菌可以产生氨基酸 脱羧酶使氨基酸脱酸，产生胺类物质，使培养基
《食品微生物检验技术》期末考试卷 考试方式：闭卷 一、名词解释： 1. 细菌：是一类细胞细而短（细胞直径约 0.5卩m, 长度约0.5?5卩m ）、结构简单、细 胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。 2. 菌落：固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子 细胞集团，这就是菌落（colony ）。 3. 放线菌：是一类呈菌丝状生长、主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。 4. 菌丝体：许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 5. 生长因子：通常是指那些微生物生长所必需而且需要量很小的，但微生物自身不能合成 的，必须在培养基中加入的有机营养物。 6. 培养基：根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积 累代谢产物的营养基质称为培养基。 7. 消毒：是指利用某些理化方法杀死物体表面或内部所有对人体或动植物有害的病原菌, 而对被消毒的对象基本无害的措施。 8. 菌株：又称品系（在病毒中则称毒株或株） ，表示任何由一个独立分离的单细胞（或 单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。 9. 诱变育种：是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高, 再从中筛选出少数符合育种目的的突变株。 10. 干酪：是在乳中（也可用脱脂奶油或稀奶油）加入适量的乳酸菌发酵剂和凝乳酶， 使蛋白质（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，将凝块压成块状而制成的产品。 适用班级： 班级 ______________ 学号 _____________ 姓名 ________________
11. 食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程 12. 发酵乳制品：是指良好的原料乳经过杀菌作用接种特定的微生物（主要是乳酸菌）进行发酵，产生具有特殊风味的食品，称为发酵乳制品。 13. 栅栏技术：已知的防腐方法根据其防腐原理归结为高温处理，低温冷藏或冻结，降低水分活性，酸化，降低氧化还原值和添加防腐剂等几种，即可归结为少数几个因子。把这些起控制作用的因子，称作栅栏因子。栅栏因子共同防腐作用的内在统一，称作栅栏技术。 14. 食物中毒：是指人体因食用了含有害微生物、微生物毒素或化学性有害物质的食物而出现的非传染性的中毒。 15. 双歧因子：一种能促进双歧杆菌生长，不被人体吸收利用的天然或人工合成的物质。 二、填空题： 1. 原核微生物中常见的类群有细菌、放线菌、蓝细菌、支原体___________ 、螺旋 体 _______ 、衣原体、立克次体等。 2. 肽聚糖是原核微生物细胞壁所特有的成分，是由N- ___________________ 乙酰葡萄糖胺（NAG）、N- _乙酰胞壁酸____________ （NAM ）和短肽聚合而成的网状结构的大分子化 合物。 3. 放线菌的菌丝由于形态与功能不同分成三类：—基内____ 菌丝、气生菌丝、孢 子丝。 4. 在自然界中霉菌主要是形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖，无性孢子有孢子囊孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子和芽孢子。有性孢子常见的有卵孢子、—接 合孢子 _________ 、子囊孢子和担孢子。 5. 微生物生长所需的营养物质应该包含组成细胞的各种化学元素。营养物质按照它们在 机体中的生理作用不同，可分成碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六 大类。 6. 配制培养基的基本原则： ____ 根据不同微生物对营养的要求 _________ 、根据营养物质的浓度及配比、—适当的pH __________ 、培养基中原料的选择。 7. 高压蒸汽灭菌法一般采用0.1 MPa 的压力、121 摄氏度处理
习题库 项目一食品中的微生物及其检验 一、名词解释 1、微生物： 2、食品微生物检验： 3、食品变质： 4、腐败： 5、酸败： 6、菌落总数： 7、大肠菌群： 8、MPN： 二、填空题 1、食品中的微生物的主要来源是、和。 2、引起食品腐败变质的原因主要有、、和 等方面，其中，最普遍、最主要的因素是。 3、分解蛋白质的微生物以为主，其次是和。 4、分解糖类的微生物以为主，其次是和。 5、分解脂肪的微生物以为主，其次是和。 6、国家食品卫生标准一般包括三个方面的内容：、 和。 7、微生物指标一般分为、和三项。 8、食品微生物检验包括和两个方面。 三、选择题 1、下列描述的微生物特征中，不是所有微生物共同特征的是（） A.个体微小 B.分布广泛 C.种类繁多 D.可无致病性 E.只能在活细胞内生长繁殖 2、土壤中，数量和种类最多的微生物是（）
A、细菌 B、霉菌 C、酵母菌 D、放线菌 3、我国城市饮用水卫生标准规定（） A、每1000ml水中大肠杆菌＜3个 B、每1000ml水中大肠杆菌＜30个 C、每100ml水中大肠杆菌＜3个 D、每100ml水中大肠杆菌＜30个 E、每500ml水中大肠杆菌＜3个 4、我国城市饮用水卫生标准规定（ E ） A、每ml水中细菌总数＜1000个 B、每ml水中细菌总数＜10个 C、每100ml水中细菌总数＜10个 D、每500ml水中细菌总数＜10个 E、每ml水中细菌总数＜100个 四、判断题 1、菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。（） 2、MPN是指可能产气的数量。（） 3、食品中病原微生物的检验，可以检验出少量的病原微生物（） 五、问答题 1、食品微生物检验的特点有哪些？ 2、食品微生物检验的任务是什么？ 3、食品微生物检验的内容主要包括哪些方面？每一个方面的检验项目是什么？ 4、食品质量的评价指标有哪些？并具体解释之。 5、食品微生物检验的意义是什么？ 6、食品中细菌总数检验的意义是什么？ 7、食品中大肠菌群检验的意义是什么？ 项目二食品微生物检验的基本条件与设备 一、名词解释 1、分辨力：
农产品质量检测专业及绿色食品生产与经营专业2015级《食品微生物检测技术》课 程期末考试卷（A卷） 是，观察真菌采取的制片方法是。 4．微生物生长需要的营养要素有、、、、生长因子和能源。 5．根据细菌的生长曲线，可将细菌的生长分为、、、四个时期，作为研究材料应取的细菌最合适。 6．一般培养基的制备主要程序可分为：称量、、调节pH、过滤、、加塞包扎、和无菌检查等步骤。 7．无菌室的熏蒸消毒，主要采用熏蒸消毒法，测定无菌室无菌程度一般采用法。
三、单项选择题（总分20分，每题1分，将答案写在下面） 1——5 ： 6——10： 11——15： 16——20： 1.紫外线的杀菌机理可能是（） A.紫外线的高热作用 B.紫外线的辐射作用 C.紫外线凝固细菌蛋白质 D.紫外线干扰细菌DNA复制与转录 2.革兰氏染色的关键操作步骤是（） A.结晶紫染色 B.碘液固定 C.酒精脱色 D.复染 ） C.用65％的酒精棉球擦容器口周围 D.用酒精灯烤容器口周围 9.某微生物在有氧和无氧时均可以生长并可以利用氧，它属于（）。 A.微好氧菌 B. 好氧菌 C. 厌氧菌 D. 兼性厌氧菌 10.一般培养基高压蒸汽灭菌的条件是：（） A.121℃/15-30min B.115℃/15-30min C.130℃/15-30min D.65℃/15-30min 11.采用湿热高压蒸汽灭菌，（）是影响灭菌质量的关键。
A.灭菌时间 B. 压力表的指针 C.视锅内装量 D. 排除冷空气 12.根据食品卫生要求，或对样品污染程度的估计，一般选择2—3个适宜稀释度做10倍递增稀释液，每个稀释度作( )平皿， A.4个 B.3个 C.2个 D.1个 13.依据GB/T 4789.2-2010，菌落数测定结果1:100（第一稀释度）菌落数分别为204,213； 1:1000（第二稀释度）菌落数分别为19,18。结果菌落总数报告为（）。 A.2.0×104 B.2.1×104 C.1.9×104 D.4.0×104 14.霉菌及酵母菌的培养温度是( )。 直径 20.在微生物检测中最常见的是细胞生物，其中最多的是（）。 A.病毒 B.真菌 C.霉菌 D.细菌 四、判断题（下列叙述中，对于正确的在括号里标“√”，错误的标“×”每小题1分，总分10分，共10题。将答案写在下面:） 1——5： 6——10： 1.进行微生物检验采集的食品样品，在送检过程中应越快越好，一般不应超过24h。（） 2.病原微生物分离鉴定工作可以在普通微生物检测实验室中进行。（）
第三章大肠菌群测定 一、大肠菌群检验 (一)检验方法 (二)培养基 (三)检验时应注意事 二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。 一、大肠茵群检验 (一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
食品微生物检测方法 范围 本标准规定了食品微生物检测方法 1 菌落总数 1.1 培养基和试剂 ⑴、营养琼脂培养基：按GB/T4789.28-2003中4.7规定 成分: 蛋白胨10克、牛肉膏3克、氯化钠5克、琼脂15～20克、蒸馏水1000ml 制法：将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入琼脂,加热煮沸,使用权琼脂溶化.分装烧讧,121℃高压灭菌15分钟. 注:此培养基可供一般细菌培养之用,注平板或制成斜面.如用于菌落计数,琼脂量为 1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%. ⑵磷酸盐缓冲液:按GB/T4789.28-2003中3.22规定. 成分：磷酸二氢钾34克、1mol/l氢氧化钠溶液175ml、蒸馏水825ml 、PH7.2 制法: 先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000 ml. 稀释液: 取储存液1.25 ml ,用蒸馏水稀释至1000 ml,或每管10ml,121℃高压灭菌15分钟. ⑶明胶磷酸盐缓冲液 成分:明胶2克、磷酸氢二钠4克、蒸馏水1000ml、PH6.2 制法:加热溶解,校正PH,121℃高压灭菌15分钟. ⑷0.85%灭菌生理盐水 ⑸75%乙醇 1.2 设备和材料 ⑴冰箱：0~4℃ ⑵恒温培养箱36℃±1℃ ⑶恒温水浴锅46±1℃ ⑷均质器或灭菌乳钵 ⑸架盘药物天平：0~500克，精确至0.5克. ⑹菌落计数器. ⑺大镜4× ⑻灭菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)
⑼灭菌锥形瓶:500ml ⑽灭菌玻璃珠:直径约5mm ⑾灭菌培养皿直径约90mm ⑿灭菌试管16mm×160mm ⒀灭菌刀、剪子、镊子等。 1.3 检验程序（菌落总数的检验程序见图1） 1.4 操作步骤 ⑴检样稀释及培养 a. 以无菌操作将检样25克(ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min～10000r/min的速度处理1min,做成1：10的均匀稀释液。 b. 用1ml的灭菌吸管吸取1：10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。
食品有害微生物快速检验方法 摘要食品有害微生物检验在食品卫生检验中具有十分重要的作用。综述食品有害微生物快速检验方法，涉及分子生物学技术、抗原抗体免疫检测技术、载体仪器技术、代谢学技术、生物传感器、色谱技术等方面内容，介绍各种检测方法的原理、应用、结果判断等，可为食品有害微生物的准确检测提供参考和指导。 关键词食品；有害微生物；快速检验方法 中图分类号TS207.4 文献标识码A 文章编号1007-5739（2012）14-0284-02目前，食品有害微生物的污染对食品的影响而造成的疾病仍是主要的问题。常规检测准确灵敏，但缺点是操作时间长，检测步骤较繁琐。因此，针对食品中的有害微生物检测，建立快速、准确的检测体系对确保食品安全极其重要，也是当前各国学者研究的重点[1]。随着现代科技的不断发展，以及人们对食品安全、公共卫生的重视，将会逐步完善和建立各种简便、快捷的新型微生物快速检测技术。 1 分子生物学技术 （1）PCR技术。即聚合酶链反应技术，采用体外酶促（耐热DNA聚合酶）反复作用，通过变性—延伸—复性的循环操作，迅速将DNA模板扩增数百万倍，再用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果来识别细菌[2]。当前，主要有3种技术应用到微生物检测中[3]：一是嵌套多聚酶链反应技术，产生扩增的DNA片段上含有第2轮PCR引物的结合位点，在此片段上应用第1套引物，片段中第1轮反应产物被等分转入第2轮PCR引物，PCR受微生物的干扰由扩增靶DNA来消除；二是随机扩增多态DNA分析多聚酶链反应技术（RAPD—PCR），即使用任意引物，得到一群长短不一的DNA片段混合物；三是采用一套