熵值法 1.算法简介 熵值法是一种客观赋权法,其根据各项指标观测值所提供的信息的大小来确定指标权重。设有m 个待评方案，n 项评价指标，形成原始指标数据矩阵n m ij x X ?=)(，对于某项指标j x ，指标值ij X 的差距越大，则该指标在综合评价中所起的作用越大；如果某项指标的指标值全部相等，则该指标在综合评价中不起作用。 在信息论中，熵是对不确定性的一种度量。信息量越大，不确定性就越小，熵也就越小；信息量越小，不确定性就越大，熵也越大.根据熵的特性，我们可以通过计算熵值来判断一个方案的随机性及无序程度，也可以用熵值来判断某个指标的离散程度，指标的离散程度越大，该指标对综合评价的影响越大！因此，可根据各项指标的变异程度，利用信息熵这个工具，计算出各个指标的权重，为多指标综合评价提供依据！ 2.算法实现过程 2.1 数据矩阵 m n nm n m X X X X A ?????? ??=ΛM M M Λ1111其中ij X 为第i 个方案第j 个指标的数值 2.2 数据的非负数化处理 由于熵值法计算采用的是各个方案某一指标占同一指标值总和的比值，因此不存在量纲的影响，不需要进行标准化处理，若数据中有负数，就需要对数据进行非负化处理！此外，为了避免求熵值时对数的无意义，需要进行数据平移： 对于越大越好的指标： m j n i X X X X X X X X X X X nj j j nj j j nj j j ij ij ,,2,1;,,2,1,1),,,min(),,,max() ,,,min(212121'ΛΛΛΛΛ==+--=对于越小越好的指标： m j n i X X X X X X X X X X X nj j j nj j j ij nj j j ij ,,2,1;,,2,1,1),,,min(),,,max(),,,max(212121'ΛΛΛΛΛ==+--=为了方便起见，仍记非负化处理后的数据为ij X
PCR 扩增反应的操作 第一节PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA ）的扩增反应，是模拟体内DNA 复制过程，在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板，4 种dNTP 为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，引物沿5'→ 3'方向延伸，形成新的DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成（见图）。 1．模板DNA 的变性 模板DNA加热到90~95 C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA 中G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而A-T 间只有两个氢键相连，所以G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起 始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65C时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复 合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1?2min。 3．引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72 C条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40?60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2?4min, —次PCR 经过30?40次循环，约2?3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y =（1 + X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数
Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不
PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，
熵值法 1 基本原理 在信息论中，熵是对不确定性的一种度量。信息量越大，不确定性就越小，熵也就越小；信息量越小，不确定性越大，熵也越大。根据熵的特性，我们可以通过计算熵值来判断一个事件的随机性及无序程度，也可以用熵值来判断某个指标的离散程度，指标的离散程度越大，该指标对综合评价的影响越大。 2、熵值法步骤 ⑴选取n 个国家，m 个指标，则ij x 为第i 个国家的第j 个指标的数值。（i=1,2…,n; j=1,2,…,m ） (2) 指标的标准化处理:异质指标同质化 由于各项指标的计量单位并不统一,因此在用它们计算综合指标前,我们先要对它们进行标准化处理,即把指标的绝对值转化为相对值,并令ij ij x x =，从而解决各项不同质指标值的 同质化问题。而且,由于正向指标和负向指标数值代表的含义不同(正向指标数值越高越好,负向指标数值越低越好) ,因此,对于高低指标我们用不同的算法进行数据 标准化处理。其具体方法如下: 正向指标: 12' 1212m in (,,...,)100m ax (,,...,)m in (,,...,)ij j j n j ij j j n j j j n j x x x x x x x x x x x ??-=???-???? 负向指标: 12'1212m ax (,,...,)100m ax (,,...,)m in (,,...,)j j n j ij ij j j n j j j n j x x x x x x x x x x x ??-=?? ?-???? 则'ij x 为第i 个国家的第j 个指标的数值。（i=1,2…,n; j=1,2,…,m ）。为了方便起见，仍记数 据'ij ij x x =。 （3）计算第j 项指标下第i 个国家占该指标的比重： 1,(1,2...,,1,2...,)ij ij n ij i X p i n j m X ====∑ （4）计算第j 项指标的熵值。 1 ln ()n j ij ij i e k p p ==-∑，其中，0k >，1/ln ()k n =，0j e ≥ （5）计算第j 项指标的差异系数。对第j 项指标，指标值的差异越大，对方案评价的左右就越大，熵值就越小，定义差异系数： 1j j e e g m E -=-，式中1m e j j E e ==∑，01i g ≤≤，1 1m j j g ==∑ （6）：求权值：
提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 （一）反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶：在Mn2存在下，允许高温反转录 RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 （二）合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) ：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有
QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR
PCR 扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发 展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记 跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计 算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR 从定性到定量质的跨越，具有里程碑 意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检 测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领 域研究中。本文对实时荧光定量PCR 的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过 荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定： PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号标准偏差的10 倍。(2)Ct 值：C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已 经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA 拷贝数。只有在荧光产
AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总DNA 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 3. 美国MJ公司PCR仪,
4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品 DNA提取试剂盒； EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒； Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer; 琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? ? cm 2. 其他实验需要物品 微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。 四、实验流程 1、总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品 EcoR1 1ul
原理与实验步骤 一、知识背景： 、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 、技术( )：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 、逆转录酶和 逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性： 、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。 、水解活性：水解杂合体中的。 、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。 、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。 、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。 、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。 、耗材：
一、亲和层析基本知识 亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专 一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一 种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如 抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的 这种特异亲和能力又叫亲和力。 亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为 配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认 为是激素的配体。 其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 二、固相载体的选择 对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。 三、配体的选择 亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
PCR扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。(2)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产生进入指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在P CR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含
熵值法的原理及实例讲解 熵值法 1.算法简介熵值法是一种客观赋权法,其根据各项指标观测值所提供的信息的大小来确定指标权重。设有m个待评方案，n项评价指标，形成原始指标数据矩阵X?(xij)m?n，对于某项指标xj，指标值Xij的差距越大，则该指标在综合评价中所起的作用越大；如果某项指标的指标值全部相等，则该指标在综合评价中不起作用。在信息论中，熵是对不确定性的一种度量。信息量越大，不确定性就越小，熵也就越小；信息量越小，不确定性就越大，熵也越大.根据熵的特性，我们可以通过计算熵值来判断一个方案的随机性及无序程度，也可以用熵值来判断某个指标的离散程度，指标的离散程度越大，该指标对综合评价的影响越大！因此，可根据各项指标的变异程度，利用信息熵这个工具，计算出各
个指标的权重，为多指标综合评价提供依据！ 2.算法实现过程数据矩阵?X11?X1m??????其中Xij为第i个方案第j个指标的数值A????X??n1?Xnm?n? 数据的非负数化处理于熵值法计算采用的是各个方案某一指标占同一指标值总和的比值，因此不存在量纲的影响，不需要进行标准化处理，若数据中有负数，就需要对数据进行非负化处理！此外，为了避免求熵值时对数的无意义，需要进行数据平移：对于越大越好的指标：’Xij?Xij?min(X1j,X2j,?,Xn j)max(X1j,X2j,?,Xnj)?min(X1j,X2j,?,Xnj) ?1,i?1,2,?,n;j?1,2,?,m对于越小越好的指标：’Xij?max(X1j,X2j,?,Xnj)?Xijm ax(X1j,X2j,?,Xnj)?min(X1j,X2j,?,Xnj)?1,i ?1,2,?,n;j?1,2,?,m为了方便起见，仍记非负化处理后的数据为Xij 计算第j 项指标下第i个方案占该指标的比重Pij?Xij?Xi?1n(j?1,2,?m) 计算第j项指标的熵值ej??k*?Pijlog(Pij),其中
凯氏定氮仪原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成(NH4)2SO4 反应式为： 2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤： (一)消化
1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂，浓硫酸，30%过氧化氢。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。 2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。 (二)蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。 1、仪器的洗涤 仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。 仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道
19.熵值法确定权重 一、基本原理 在信息论中，熵是对不确定性的一种度量。信息量越大，不确定性就越小，熵也就越小；信息量越小，不确定性越大，熵也越大。 根据熵的特性，可以通过计算熵值来判断一个事件的随机性及无序程度，也可以用熵值来判断某个指标的离散程度，指标的离散程度越大，该指标对综合评价的影响（权重）越大，其熵值越小。 二、熵值法步骤 1. 选取n个国家，m个指标，则x j为第i个国家的第j个指标的数值（i=1, 2…，n; j=1,2,…,m）; 2. 指标的归一化处理：异质指标同质化 由于各项指标的计量单位并不统一，因此在用它们计算综合指标前，先要对它们进行标准化处理，即把指标的绝对值转化为相对值，并令X j X j ,从而解决各项不同质指标值的同质化问题。而且，由于正向指标和负向指标数值代表的含义不同（正向指标数值越高越好，负向指标数值越低越好），因此，对于高低指标我们用不同的算法进行数据标准化处理。其具体方法如下： 正向指标： X ij min ｛勺公2）,...,人）｝ X ij max｛X ij,X2j,...,X nj｝ min ｛勺公？」，…，x j
负向指标:
max{X ij,X2j,...,X nj} X j X j max{X jj,X2j,...,X nj} m in {勺必），…，x^} 则X j为第i个国家的第j个指标的数值(i=1,2…，n; j=1,2,…,m) 为了方便起见，归一化后的数据X j仍记为X j； 3?计算第j项指标下第i个国家占该指标的比重： X ij P j —, i 1,2..., n, j 1,2..., m X ij i 1 4. 计算第j项指标的熵值： n e j k P ij ln( p j) i 1 其中，k=1/ln(n)>0.满足e j >0; 5. 计算信息熵冗余度： d j 1 e j; 6. 计算各项指标的权值： d j W j —, j 1,2,...,m d j j 1 7. 计算各国家的综合得分： m s W j p ij, i 1,2,...n j 1 三、Matlab实现 按上述算法步骤，编写Matlab函数：shang.m function [s,w]=sha ng(x) %函数shang(), 实现用熵值法求各指标(列)的权重及各数据行的得分
半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
3 实验原理 3.1人工抗原的制备原理（以奥沙普秦为例） 奥沙普秦为小分子物质（分子质量小于500），本身不具有诱导产生抗体的能力，必须设法先将奥沙普秦与载体蛋白质偶联制备出相应的人工完全抗原，这是半抗原免疫分析的关键所在。合成人工抗原的机理为：水溶性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的羟基与奥沙普秦的羧基在脂溶性缩合剂二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下，脱水缩合形成活泼酯化奥沙普秦中间化合物，然后载体蛋白在某一PH值下，一般是大于其等电点，是蛋白质中的氨基暴露出来，从而成为提供伯胺的底物，然后亲核进攻活性中间产物活泼酯化奥沙普秦，从而达到小分子化学物偶联到载体蛋白的目的。 3.2 ELISA技术的原理 ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中．酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。 目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。 3.3 ELISA竞争抑制法的原理 包被好的抗原与加入的抗原（标准抗原）形成竞争，如果抗体石特异性抗体，它就会与游离的标准抗原结合，而不与板上的检测
流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起 来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的 研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断， 对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术 是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 （一）原理一 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 （二）操作步骤 制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用 于本法） 用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5X 106?IX 107/ ml 取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb（5?50卩I） 的小玻璃管或塑料离心管，再加50卩I 1 : 20（用DPBS （或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇 J 4 C 30mi n 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpmx 5mi n J] 加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光 显微镜下观察，视细胞浓度加入100?500 ^1固定液） FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 （标本在试管中可保存5?7天） （三）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液（见附录）。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。