（生物科技行业）第八章微生物遗传变异与菌种选育
习题及答案
第八章《微生物遗传与菌种选育》习题及参考答案
一、名词解释
1．点突变
2．感受态
3．基因工程
4．接合
5．F'菌株
6．诱变育种
7．营养缺陷型（auxotroph）
8．准性生殖
9．重组DNA技术
10．基因重组
11．基因突变（genemutation）和移码突变
12．转导和转化13．普遍性转导和局限性转导(specializedtransduction)14．接合和转染
15．条件致死突变型(conditionallethalmutant)
16．夹层培养法（sandwichplatingculture）
17．限量补充培养法（limitedsupplementalplating）
18．生长谱法（auxanography）
19．双重溶源菌（doublelysogen）：
20．溶源转变（lysogenicconversion）：
二、选择题
1.已知DNA的碱基序列为CATCATCAT，什么类型的突变可产生如下碱基序列的改变：CACCATCAT？（）
A.缺失
B.插入
C.颠换
D.转换
2.将细菌作为实验材料用于遗传学方面研究的优点是：（）
A.生长速度快
B.易得菌体
C.细菌中有多种代谢类型
D.所有以上特点
3.以下碱基序列中哪个最易受紫外线破坏？（）
A.AGGCAA
B.CTTTGA
C.GUAAAU
D.CGGAGA
4.在大肠杆菌（E.coli）的乳糖操纵子中，基因调节主要发生在（）水平上。
A.转化
B.转导
C.转录
D.翻译
5.转座子（）。
A.能从DNA分子的一个位点转移到另一个位点
B.是一种特殊类型的质粒
C.是一种碱基类似物
D.可引起嘌呤和嘧啶的化学修饰
6.F因子和λ噬菌体是：（）
A.与寄主的生活能力无关
B.对寄主致死
C.与染色体重组后才可复制
D.仅由感受态细胞携带
7.抗药性质粒（R因子）在医学上很重要是因为它们：（）
A.可引起某些细菌性疾病
B.携带对某些抗生素的特定抗性基因
C.将非致病细菌转变为致病菌
D.可以将真核细胞转变为癌细胞
8.F+ F-杂交时，以下哪个表述是错误的？（）
A.F-细胞转变为F+细胞
B.F+细胞转变为F-细胞
C.染色体基因不转移
D.细胞与细胞间的接触是必须的
9.以下突变中哪个很少有可能产生回复突复：（）
A.点突变
B.颠换
C.转换
D.染色体上三个碱基的缺失
10.准性生殖：（）
A.通过减数分裂导致基因重组
B.有可独立生活的异核体阶段
C.可导致高频率的基因重组
D.常见于子囊菌和担子菌中
三、填空题
1．DNA分子中一种嘧啶被另一种嘌呤取代称为______。
2.受体细胞从外界吸收供体菌的DNA片段（或质粒），引起基因型改变的过程称为______。
3.F+和F-杂交中，结果是供体菌成为_____，受体菌成为_____。
4.四种引起细菌基因重组的方式是_____、______、_____和____。
5.准性生殖包括___ 、_____、_____和______四个互相联系的阶段。
6.1944年_____等人证明了转化因子为DNA。
7.在基因工程中，质粒和噬菌体的作用常是作_______。
8.Lederberg的影印培养实验证明了_______。
9.当Griffith用活的粗糙型肺炎双球菌和加热灭活的光滑型肺炎双球菌混合注射小鼠时，从死亡的小鼠体内分离到了______，其原因是_____。
10.脉孢菌（Neurospora）子囊孢子出现第二次分裂分离现象是由于染色体______。
11.大肠杆菌乳糖操纵子上的调节基因编码产生______。
12．证明核酸是遗传物质的三个经典实验是____、___和_____；而证明基因突变自发性和不对应性的三个经典实验又是___、____和____。13．质粒根据分子结构可有___、_____和_____三种构型，而根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应，又可将其分为_____、____、___、_____、_____、___和_____等类型。
14．检测质粒常用的方法有_____、___和_____。15．不同碱基变化对遗传信息的改变可分为___、_____、_____和____四种类型，而常用的表型变化的突变型有____、____、__和____等。
16．基因自发突变具有的特性为____、____、____、____、___、____和____。17．紫外线照射能使DNA相邻碱基形成_____，从而导致DNA复制产生错误，用紫外线诱变微生物后应在_____条件下进行，以防止____现象的产生。18．细菌基因转移的三种方式为____、_____和______。19．原核生物的基因调控系统是由一个操纵子和它的_____所组成的，每一操纵子又包括____、____和_____。20．微生物菌种保藏的原理是在___、____、___、___和____等环境条件下，使其处于代谢不活泼状态。
四、是非题
1．营养缺陷型微生物在MM与CM培养基中均能生长。（）2．5－溴尿嘧啶是以碱基颠换的方式引起基因突变的。（）3．在制备酵母原生质体时，可用溶菌酶破壁。（）4．所谓转导子就是带有供体基因的缺陷噬菌体。（）
5．饰变是生物在环境条件改变时表现出来的一种表型变化，它是生物自发突变的结果。（）
6．准性生殖可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组而产生重组子。（）7．用青霉素浓缩放线菌营养缺陷型的原理是在基本培养基上，野生型因生长而致死，缺陷型因不生长而存活，从而达到浓缩目的。（）8．当基因发生突变时，由该基因指导合成的蛋白质中氨基酸的顺序必然发生改变。（）
五、问答题
1.什么叫转导？试比较普遍性转导与局限性转导的异同。
2.什么是基因重组，在原核微生物中哪些方式可引起基因重组。
3.举例说明DNA是遗传的物质基础。
4.简述真菌的准性生殖过程，并说明其意义。
5.某人将一细菌培养物用紫外线照射后立即涂在加有链霉素（Str）的培养基上，放在有光条件下培养，从中选择Str抗性菌株，结果没有选出Str抗性菌株，其失败原因何在？
6.给你下列菌株：菌株A.F+，基因型A+B+C+，菌株B.F-，基因型A-B-C-，
问题：（1）指出A与B接合后导致重组的可能基因型。
（2）当F+成为Hfr菌株后，两株菌接合后导致重组的可能基因型。
7．简述提高诱变育种的基本原则
8．简述用梯度平板法筛选抗药性突变株。
9．简述筛选有缺陷型突变株的四个基本环节。
10．简述原生质体融合过程。
11．简述酿酒酵母有性杂交操作要点。
12．简述准性生殖的过程。
13.试述转化、转导和接合的区别要点。
六、论述题
1．试从基因表达的水平解释大肠杆菌以葡萄糖和乳糖作为混合碳源生长时所表现出的二次生长现象（即分解代谢物阻遏现象）。
2．试述用Ames法检测致癌剂的理论依据和方法概要。
微生物遗传与菌种选育习题参考答案
一、名词解释
1．点突变：DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变，称为点突变。
2．感受态：受体菌最易接受到外源DNA片段并实现转化的生理状态。
3．基因工程：又称重组DNA技术，它是根据人们的需要在体外将供体生物控制某种遗传性状的一段生物大分子-----DNA切割后，同载体连接，然后导入受体生物细胞中进行复制、表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
4．接合：遗传物质通过细胞间的直接接触从一个细胞转入到另一细胞而表达的过程称为接合。
5．F'菌株：当Hfr菌株内的F因子不正常切割而脱离其染色体时，可形成游离的但携带
一小段染色体基因的F因子，含有这种F因子的菌株称为F'菌株。
6．诱变育种：使用各种物理或化学因子处理微生物细胞，提高突变率，从中挑选出少数符合育种目的的突变株。
7．营养缺陷型：由于基因突变引起菌株在一些营养物质（如氨基酸、维生素和碱基）的合成能力上出现缺陷，而必须在基本培养基中添加相应的物质才能正常生长的突变型。
野生型：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。
原养型：一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株。
8．准性生殖：是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。准性生殖常见于半知菌中。
9．重组DNA技术：是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物或新物种的一种崭新的育种技术。
10．基因重组：或称遗传重组，两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。
11．基因突变（genemutation）和移码突变：
基因突变（genemutation）：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，而导致的遗传变化就称基因突变。
移码突变：指诱变剂会使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。
12．转导和转化：
转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体
细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。
转化：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换与整合，从而获得部分新的遗传性状的现象。
13．普遍性转导和局限性转导普遍性转导（generaltransduction）：噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程。
局限性转导(specializedtransduction)：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。14．接合和转染接合：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。
转染：指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。
15．条件致死突变型(conditionallethalmutant)：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。
16．夹层培养法（sandwichplatingculture）：是一种用于筛选营养缺陷型菌株的培养方法。先在培养皿底部倒一层基本培养基，待凝固后，再倒一层混有诱变剂处理后菌液的基本培养基。经培养后，对在第2层中首先出现的菌落作一标记，然后在平板上再倒一层完全培养基。经培养后，在第二层中又会产生若干个小菌落，它们多数是营养缺陷型。
17．限量补充培养法（limitedsupplementalplating）；是一种筛选营养缺陷型菌株的培养方法。把诱变处理后的微生物细胞接种在含有微量蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就可生长出较大的菌落，而待选的营养缺陷型菌株则只形成微小菌落。
18．生长谱法（auxanography）：鉴别微生物营养需求的一种简便方法。在混有营养
缺陷型细胞悬液的基本培养基平板表面，点加少量不同的待测营养物，经过派培养后，视某营养物周围是否出现生长圈，可鉴定该菌株是何种营养缺陷型。
19．双重溶源菌（doublelysogen）：是同时感染有正常噬菌体和有缺陷噬菌体的溶源菌。当它受紫外线等因素诱导后，可同时复制出上述两种噬菌体。
20．溶源转变（lysogenicconversion）：因温和噬菌体感染其宿主，而使宿主细胞在发生溶源化时获得了除对同种噬菌体免疫性以外的新的遗传性状的现象，称为溶源转变。
二、选择题
1、D；
2、D；
3、B；
4、C；
5、A；
6、A；
7、B；
8、B；
9、D；10、B
三、填空题
1．颠换
2．转化
3．F＋，F＋
4．转化，转导，接合，原生质体融合
5．菌丝联结，异核体的形成，杂合二倍体的形成（或核配），体细胞交换和单倍体化6．艾弗里（O.T.Avery）
7．基因载体
8．基因突变与环境条件没有直接对应的关系
9．活的光滑型肺炎双球菌，发生了转化
10．发生了交换
11．阻遏蛋白
12.肺炎双球菌的转化实验，T2噬菌体感染实验，植物病毒的重建实验；
变量实验，涂布实验，影印实验
https://www.doczj.com/doc/4611631502.html,C型，OC型，L型；F质粒，抗性质粒，产细菌素的质粒，毒性质粒，代谢质粒，降解质粒，隐秘质粒
14.提取所有胞内DNA后电镜观察，超速离心，琼脂糖凝胶电泳
15.缺失，添加，易位，倒位；营养缺陷型，抗药性突变型，条件致死突变型，形态突变型
16.非对应性，稀有性，规律性，独立性，可诱变性，遗传性，可逆性
17.嘧啶二聚体，红光或暗处，光复活
18.接合，转导，转化
19.调节基因，结构基因，操纵基因，启动基因
20.干燥，避光，缺氧，缺乏营养物质，低温
四、是非题
1～5.×××××；6～8.√√×
五、问答题：
1．什么叫转导？试比较普遍性转导与局限性转导的异同。
答：转导是以噬菌体为媒介将供体细胞中的DNA片段转移到受体细胞中，使受体发生遗传变异的过程。相同点：均以噬菌体为媒介，导致遗传物质的转移。
不同点：
2．什么是基因重组，在原核微生物中哪些方式可引起基因重组。
答：把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传分子的重新组合后，形成新的遗传型个体的方式，称为基因重组。在原核生物中，可通过转化、转导、接合的方式进行基因重组。
3．举例说明DNA是遗传的物质基础。
列举三个经典实验之一即为正确。
例如Griffith转化实验（要加以说明）
4．简述真菌的准性生殖过程，并说明其意义。
答：菌丝连结→形成异核体→核融合形成杂合二倍体→体细胞交换和单倍体化。
意义：半知菌中基因重组的主要方式，为一些没有有性过程但有重要生产价值的半知菌的育种工作提供了重要手段。
5．某人将一细菌培养物用紫外线照射后立即涂在加有链霉素（Str）的培养基上，放在
有光条件下培养，从中选择Str抗性菌株，结果没有选出Str抗性菌株，其失败原因何在？
答：（1）紫外线诱变后见光培养，造成光修复，使得突变率大大下降，以至选不出Str 抗性菌株。
（2）紫外线的照射后可能根本没有产生抗Str的突变。
6．给你下列菌株：菌株A.F+，基因型A+B+C+，菌株B.F-，基因型A-B-C-，
问题：（1）指出A与B接合后导致重组的可能基因型。
（2）当F+成为Hfr菌株后，两株菌接合后导致重组的可能基因型。
答：（1）A与B接合后，供体细胞基因型仍为A+B+C+，仍是F+。受体细胞转变为F+，基因型仍为A-B-C-。
（2）当F+变成为Hfr时，A与B接合后，受体细胞的可能基因型种类较多，如A+B-C-，A-B+C-，A-B-C+等等。
7．简述提高诱变育种的基本原则
答：（1）选择简便有效的诱变剂（如紫外线，NTG等）
（2）挑选优良的出发菌株
（3）处理单细胞或单细胞悬液
（4）选用最适诱变剂量
（5）充分利用复合处理的协同效应
（6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标
（7）设计高效筛选方案
（8）创造新型高效筛选方法
8．简述用梯度平板法筛选抗药性突变株。
答：梯度平板法是定向筛选抗药性突变株的一哦种有效方法。操作要点为：
（1）制备具药物浓度梯度的平板；
（2）在平板上涂布用诱变剂处理后的微生物单细胞悬液；
（3）经培养后在某药物浓度区出现抗性菌落；
（4）挑选抗性菌落后妥为保存，以供利用。
9．简述筛选有缺陷型突变株的四个基本环节。
答；（1）诱变剂处理；
（2）淘汰野生型
（3）检出缺陷型：①抗生素法；青霉素可以淘汰野生型细菌；制枚9素可以淘汰野生型酵母菌或霉菌。②菌丝过滤法：可用于淘汰以菌丝状态生长的放线菌或霉菌的野生型菌株。
（4）鉴定缺陷型；可用僧长谱法鉴定。
10．简述原生质体融合过程。
答：（1）选择亲本：选择两株有特殊价值，并带有遗传标记的细胞作为亲本菌株。
（2）细胞脱壁：在等渗溶液中，用适当脱壁酶（溶菌酶用于原核微生物，蜗牛酶用于真菌）去除细胞壁。
（3）促进融合：适当离心，使原生质体聚集后，加入PEG（聚乙二醇）或用电脉冲等因素促融。
（4）胞壁再生用等渗溶液稀释融合细胞，把它们涂布在有助细胞壁再生和促进细胞分裂的基本培养基平板上，使其形成菌落。
（5）测稳定性：用影印平板法，把长在平板上的菌落影印在不同的选择性平板上，检验融合子遗传性状的稳定性。
（6）性能检测；测定融合子的生物学特性和生产性能。
11．简述酿酒酵母有性杂交操作要点。
答：（1）选择亲本：选择两株生产性状不同但互补优点的双倍体菌株做杂交亲本。
（2）促生子囊；分别接种在含乙酸钠或其他的产孢子培养基上，使其产生子囊。
（3）子囊破壁；用机械法（匀浆管中加硅藻土和石蜡油后研磨）或酶法（蜗牛消化酶0破碎子囊壁，使子囊孢子外出，然后离心收集。
（4）涂布孢子：将子囊孢子均匀涂布在平板培养基上，发芽后繁殖成菌落（单倍体）。
（5）有性杂交：把来自不同亲本，不同性别的单倍体细胞通过离心等方式使其相互密切接触，以提高杂交频率。
（6）选出良种：在有性杂交后的双倍体细胞中，选择优良的杂合子。
12．简述准性生殖的过程。
答：（1）菌丝联结：可发生在一些形态上无区别，但在遗传型上却有差别的不同种菌株的体细胞间；联结频率极低。
（2）形成异核体：菌丝联结后，两个不同性状的体细胞融合为一体，使细胞内同时存在两个细胞核，此即异核体。
（3）双核融合（核配）：细胞内的两个核可以发生低频率（10-7～10-5）融合，从而产生双倍体杂合子核，紫外线等里论化因素可提高核融合率。
（4）体细胞交换和单倍体化：由此可形成少数单倍体杂合子。某些理化因子还可提高其频率。
13.试述转化、转导和接合的区别要点。
答：区别见下表
六、论述题
1．试从基因表达的水平解释大肠杆菌以葡萄糖和乳糖作为混合碳源生长时所表现出的二次生长现象（即分解代谢物阻遏现象）。
答：葡萄糖的存在可降低cAMP的浓度，影响RNA聚合酶与乳糖操纵子中启动子的结合（因为cAMP是RNA聚合酶与启动子有效结合所必须的），使转录无法进行，乳糖操纵子中的结构基因得不到表达，从而产生了分解代谢物阻遏诱导酶（涉及乳糖利用的三个酶）合成的现象。产生第一次生长现象。
当葡萄糖被利用完后，cAMP浓度上升，cAMP-CAP复合物得以与乳糖操纵子中的启动子结合，RNA聚合酶才能与启动子的特定区域结合并准备执行转录功能，这时由于存在乳糖，使阻遏蛋白失活，转录得以进行，结构基因得到表达，合成利用乳糖的三个酶，即β-半乳糖苷酶，渗透酶，半乳糖苷转乙酰基酶。细胞开始利用乳糖，产生第二次生长现象。
2．试述用Ames法检测致癌剂的理论依据和方法概要。
答：（1）Ames试验是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变株来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的方法。其原理是：鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株在基本培养基的平板上不能生长，如发生回复突变变成原养型后则能生长。
（2）方法大致是在含有可疑化学致癌剂的试样中加入鼠肝匀浆液，经一段时间保温后，吸入滤纸片中，然后将滤纸片放置于基本培养基平板中央。经培养后，出现3种情况：①在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含致癌剂；②在纸片周围有一抑制圈，其外周有大量菌落，说明试样中有较高浓度致癌剂存在；③在纸片周围有大量菌落，说明试样中有适量致癌剂存在。
工业微生物菌种的选育、保藏与培养 自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。 菌种收集和筛选途径： （1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 （2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 （3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。 菌种筛选主要步骤： 调查研究及查阅充分的资料筛选 ↓↓ 设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓ 采样复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓ ↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓ ↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定 一、菌种的分离筛选 一）样品采集与预处理 总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样 土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。
微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
课程名称：工业微生物学 课程编码：04043100 英文名称：Industrial Microbiology 学时：54 学分：3 适用专业：生物工程，制药工程，食品科学与工程，生物技术，食品质量与安全 课程类别：必修 课程性质：学科基础课 先修课程：生物化学 教材：《微生物学》路福平等，中国轻工业出版社，2005 一、课程性质与任务 工业微生物学是为生物工程、制药工程、食品科学与工程、食品质量与安全和生物技术专业开设的一门重要技术基础课。通过本课程的学习，要求学生掌握微生物的基本知识，包括微生物的形态、结构、营养、生长、环境因素对微生物的影响、菌种选育、菌种保藏以及新陈代谢和遗传变异等；了解微生物在生物界中的地位、在自然界中的分布与作用、特别是在食品、发酵与制药工业中的实际应用等，为其它专业课的学习奠定良好基础。 虽然工业微生物学是我校生物工程，制药工程，食品科学与工程，食品质量与安全，生物技术专业重要的一门基础生物学课程，但因为学习时间有限，因而本课程不能详尽无遗地讲解微生物学的各个方面，在内容的选择和安排上要注意做到主次分明、概念清楚、由浅入深、理论联系实际，为提高教学质量与教学效果创造有利条件。 二、课程教学的基本要求 工业微生物学是生物工程、制药工程、食品科学与工程、食品质量与安全和生物技术专业的一门重要技术基础课，以阐述微生物的形态结构与功能、微生物的营养、环境因素对微生物生长的影响以及微生物的遗传育种为主，同时适当介绍微生物的生态学、微生物的分类以及传染与免疫等知识。考虑到学生已经在生物化学课中学过各种物质代谢的知识，所以在工业微生物学中不再讲解，只介绍微生物的产能方式如呼吸和发酵。通过本课程的学习，要求学生掌握微生物的基本知识，包括微生物的形态、结构、营养、生长、环境因素对微生物的影响、菌种选育、菌种保藏以及新陈代谢和遗传变异等；了解微生物在生物界中的地位，在自然界中的分布与作用，特别是在食品、发酵与制药工业中的实际应用等，为其它专业课的学习奠定良好基础。 为适应相应专业的发展，还要求比较系统地掌握发酵专业中有关微生物的形态、生理、培养、鉴别、检出、筛选、保藏等方面的知识；了解微生物对营养物质的需要和营养物质在生命活动中的功能，具有选择与配制培养基的能力；掌握灭菌的原理与方法；了解环境因素与微生物生命活动的关系、了解微生物的生长发育、呼吸与发酵之间的关系、了解微生物在自然界中的分布及微生物间的相互关系和寻找新菌种的途径。通过对遗传变异知识的学习使学生具有分离、筛选和培育微生物新菌种的能力。 三、课程内容及教学要求 第一章绪论
第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中， 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此， 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的 国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造 一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能 减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的 定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜
第五节菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 一、斜面冰箱保藏法 一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。保存期3月到6月。 二、沙土管保藏法
适合于产孢子或芽孢的微生物。 首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。一般沙80目，土80一100目。 其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。 保存期1年左右。 三、菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。 操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。 四、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。保存期约1年 五、真空冷冻干燥保藏法 是目前国内外较理想的常用方法。其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种M 都适用。所以，都已较普遍地应用。 基本操作：将M制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封。低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使M疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 诱变选育 诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 诱变育种的步骤与方法 （一）、工业育种的一般步骤（图） （二）、诱变育种方案设计 诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。 1、出发菌株的选择 工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。出发菌株
选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。 2、出发菌株的纯化 为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。 3、单孢子悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。 首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基
消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。
（生物科技行业）菌种保存和微生物常识
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查
培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。
1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。
1、工业微生物菌种开发的一般过程 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。土壤样品的含菌量最多。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 （1）采样 注意事项 1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的； （2）富集培养 目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。 例如控制培养基的营养成分的富集培养，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。 （3）分离筛选 经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 例如划线分离法，用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。 （4）产物鉴别 经典微生物分类鉴别 现代的分子生物学分类鉴别 2、分子生物学分类方法（微生物分类鉴定的经典和现代方法）
中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。 第一条组织及任务 在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心: 中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。 中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。 中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。 保藏管理中心的任务是: (一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应; (二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究; (三)组织学术交流和经验交流; (四)办理国内外菌种交换; (五)编制保管的菌种目录。 保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。其具体任务是: (一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应; (二)承担本专业有关疑难菌种鉴定; (三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用; (四)办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。 生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。 第二条菌种的分类 菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。 一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。如: 鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌(包括EL-tor弧菌); 天花病毒、黄热病毒(野毒株)、新疆出血热(克里米亚刚果出血热)病毒、东、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、拉沙热(Lassa)病毒、马堡(Marburg)病毒、埃波拉(Ebola)病毒、猴疱疹病毒(猴B病毒); 粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、杜波氏组织胞浆菌。 二类:实验室感染机会较多、感染后的症状较重及危及生命，发病后不易治疗及对人群危害较大的传染病菌种。如: 土拉弗郎西丝氏菌、布氏菌、炭疽芽胞菌、肉毒梭菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌; 狂犬病病毒(街毒)、森林脑炎病毒、流行性出血热病毒、国内尚未发现病人在国外引起脑脊髓炎及出血热的其它虫媒病毒、登革热病毒、甲、乙型肝炎病毒; 各种立克次体(包括斑疹伤寒、Q热); 鹦鹉热、鸟疫衣原体、淋巴肉芽肿衣原体;
目前使用的6种微生物菌种保藏方法 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： ? 1 培养基制备 ? ? 1.1 器皿准备 ? 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 ? ? 1.2 溶解培养基配料 ? 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 ? ? 1.3 调pH值 ? 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
? 1.4 加凝固剂 ? 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 ? ? 1.5 过滤分装 ? 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 ? ? 1.6 包扎标记 ? 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 ? ? 1.7 灭菌 ? 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 ? ? 1.8 斜面摆放
微生物工业菌种与培养基 菌种与种子扩大培养 菌种：实现从原料→目的产物的关键 生产效率、产品成本、产品质量 ※ ※ ★从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点； ★诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； ★基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开发的进程。
※从自然界中分离菌种的一般过程 采样预处理 →培养 →菌落的选择 →产品的鉴定 ※选择育种方法时综合考虑的因素 (1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系 (2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用 ★如，对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少， 则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术； ★如，对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。 ※一些常用工业微生物 ★抗生素生产有关的微生物 放线菌（链霉素真菌（青霉素、头孢等）四环素；红霉素等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源 ※氨基酸生产有关的微生物
★氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单； ★谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌； ★其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。 ※食品工业微生物包括：酿造业，酶制剂等 ★食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 ★α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌。 2、工业微生物(菌种)的要求 1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的产物----价值高 2）能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵，发酵周期短。----可操作性强 3）根据代谢调控要求选择高产菌株，如营养缺陷型菌株或调节突变型菌株 4）菌种抗噬菌体能力强，以防止感染噬菌体而造成“倒罐”现象的发生。 5）菌种纯粹，不易退化，可保证发酵生产和产品质量的稳