基因指纹技术的原理及其应用
Wyrnan等人首先在人基因文库的DNA随机片段中, 分离出高度多态的重复顺序区域, 此后, Ben等在人胰岛素基因附近, Higgs等在α--珠蛋白基因附近等发现有高度重复序列, 有人把这些分散在基因组的串联重复的短小序列称为小卫星DNA (Minisatellite DNA )。一个小卫星DNA重复单位长度一般从几个到几十个核苷酸, 重复单位数目从几个到几百个。不同的重复单位数目构成了小卫星D N A的高度多态性。Jeffreys等(1985a)用人的肌红蛋白基因内含子高变区重复序列的核心序列作为探针, 在不十分严格的洗脱条件下同 D N A 内切酶酶切的人基因组DNA的电泳图谱进行southern印迹杂交, 所产生的图谱在不同个体之间均存在明显差异性, 与人的指纹相似, 表现出高度的个体特异性. 这种特异性仍按孟德尔方式遗传,因而称为DNA指纹图谱。继小卫星D N A之后, 另一类更简单的短序列核苷酸串联重复亦被发现, 重复序列的核苷酸核苷酸数目可能是1个, 2 个或3个、4个, 其中最常见的双核苷酸, 即(A C )n和(T G )n (n 大约1 0---6 0 ) , 这被称为微卫星D N A (Mierosatellite DNA ) 。在人类基因组中存在5000 ---10000 个这类串联重复家族,因而列为最丰富时穿插重复D N A 家族之一, 它均匀地穿插在基因组中.Ali等( 1987) 用人工合成的寡核苷酸多聚体作探针, 也得到了人的DNA图普。Welsh 等(1990)和Williams等(1990)用任意寡核苷酸作引物对基因组进行PCR扩增, 扩增产物的电泳图谱也表现高度的变异性, 这就是随机放
大多态DNA分析(RAPD ) , 也算是一种DNA指纹分析。
基于RFLP基础上的D N A 指纹技术一都般包括以下几个步骤：先将被检测的生物样得到广泛应用。品中的D N A 提取出来, 电泳检测D N A 的质与量, 看D N A 是否降解。如果降解, 则用与探针配对使用的限制性内切酶酶切, 电泳, 再用Southern印迹法转移到尼龙膜上, 最后用放射性同位素标记的D N A 探针与转到尼龙膜上的D N A 杂交,X 射线使胶片曝光后, 即得到长度不同的D N A 片段的显影, 即是D N A指纹图谱。但是如果D N A 样品少, 且有降解, 则用PC R 技术扩增, 同样可得到D N A 指纹图谱。
一、D N A 指纹具有下述儿个特点:
第一, 不象传统的R FLP 一个探针只检测一个特异性位点的变异性, 而一个D N A 指纹探针一次就能同时检测十JL: 个, 甚至几十个位点的变异性, 因而D N A 指纹更能反映基因组的变异性。D N A 指纹中的谱带大部份来源于随机分布在基因组上的高变异位点, 同一图谱中呈紧密连锁遗传的带所占比例极少, 所以一个D N A指纹能同时提供10 多个独立的遗传标记。第二, 具有高度的变异性。由于D N A 指纹谱是由众多高变位点上的等位基因形成, 因而具有很高的变异性。Je ff r e y等对人的DNA指纹的研究表明, 大部分谱带都以杂合状态存在,平均杂合率大于70帕, 某些大片段的杂合率甚至高达10肠。据估算探针33.15产生的人的指纹, 两个随机个体具有相同D N A 指纹谱的概率仅为3 x l0-11。可见其具高度的个体特异性。只有同卵双生子女才会有完全相同的D N A 指纹谱。第三, 具有简单
的稳定的遗传性。Jeffrey通过家系分析表明, DNA指纹谱中几乎每一条带都能在其双亲之一的谱中找到, 而产生新带的概率仅在0.0 1 ~ 0 . 0 04之间。D NA 指纹的杂合带符合孟德尔遗传规律, 双亲的每条杂合带平均传递给50 肠的子代。第四,D N A 指纹谱还有体细胞稳定性,即从同一个体中不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的D N A指纹完全一致。
两个最早的D N A 指纹探针是Je ff r o y s 及其同事所发现的人源多核心小卫星探针3 3 . 6 和3.15 后研究发现,33. 6 和33.15 能广泛地适用于许多种类的动物和一些种类的植物D N A 指纹分析。
二、DNA指纹的应用
1. 法医学方面
由于D N A 指纹具有上述特点, 使其成为法医学上鉴别罪犯, 亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的工具。如我国公安部利用D N A指纹已侦破数百例疑难案件。同时也可用于亲子鉴定方面，由于D N A 指纹图具有高度的个体特异性, 它是通过比较孩子、母亲及被控父亲的D N A 指纹图, 达到亲子鉴定的目的。如果子代D N A 指纹图上的所有谱带均可在其双亲找到来源, 孩子与被控父亲的D N A 指纹图有共同谱带5 条以上, 可肯定亲子关系; 反之, 若子代D N A 指纹图上有三条以上谱带不能在其双亲找到来源则可否定亲子关系。
2 . 连锁分析
鉴于小卫星区域所具有的上述特点, 使它同一般的RFLP 相比较所体现的优越性, 使其在人类遗传学的各个研究领域具有较高
的应用价值。Jeffrey研究了一个由1个同胞组成的多发性神经纤维瘤病家系, 发现该家系几乎全部可辨认的片段都以杂合状态存在; 且仅传递给部份后代。通过该家系中所有父亲或母亲D N A 片段分离型的配对比较, 鉴别出了连锁基因对和等位基因对, 探针3 3 .6 在父母双方各检出了一个连锁基因对, 33.6和33.5 巧两个探针检出的D N A 片段没有一个是相同的, 而且二者的片段也不存在连锁关系。分析表明, 可辨认的小卫星位点散布在人基因组中的大部份区域上, 有一个来源子受累母亲的小卫星片段被证明同多发性神经纤维瘤病相连锁。
3 . 遗传病的早期诊断
用小卫星D N A 诊断遗传性疾病过程为: 在基因内或基因附近寻找小卫星D N A , 制备探针或引物, 经连锁分析确定最佳条件或Pc R直接扩增, 对致病基因具体情况不太清楚时, 可利用步移, 逐步克隆致病基因, 然后作序列分析, 由于小卫星DNA分布很广, 总能找到理想的标记。据计算, 20 种小卫星探针就可定位3 x l09b p 的人基因组, 探针与基因真实位点不超过4.0cM。Huntington病为常见的遗传病, 发现D4s95位点与基因密切连锁, 该位点内含一小卫星区, 现已将区域制为探针, 以此可进行家系诊断及致病基因的克隆研究.
4. 肿瘤的研究
肿瘤是多因素, 多阶段的变化过移, 涉及多个癌基因和肿瘤抑制基因。其病因复杂, 变化多样, 但归根结底还是在DNA的变化上。有些变化可用小卫星探针检测, 一般说来, 癌组织, 转移灶与正常组织或外周血细胞D N A指纹有差别, 常见的是某条带或儿条带的缺失,
某一条或某几条带密度降低, 或者癌组织中出现新的带。Y asukir 等用33. 6 和33.15 探针检查了患不同肿瘤病人正常组织, 外周血、癌组织的DNA指纹, 用33. 6探针, 正常组织和癌组织指纹69 肠有差异, 用3 3 .15 则为5 肠。在4 个转移癌病人中3 人的D N A 指纹与原发灶不同。T a k a d 等也发现在9 例转移瘤病人中有5 例出现新带, 说明癌细胞遗传上不稳定。
5. 人类基因定位
人类基因定位中最主要的工具是DNA标记, 而任何一个双态性标记, 对50%左右的连锁分析, 不能提供任何线索, 给基因定位带来很大困难。Nakamura等用已知的小卫星顺序作探针, 从人基因质粒文库中, 筛选出许多小卫星基因, 确定了7 个基因座位的等位基因数目、长度变异和杂合性比率。其中有1 个基因座位等位基因数目大于10 个, 杂合率85 ~91%, 然后用单位点探针与基因组DNA 杂交,及与D N A 指纹谱不同的单位点杂交图, 高度的杂合性使95%以上的个体都呈现出不同长度的两条带。这种基因座位的小卫星DNA标记在基因定位与基因作图中具有独特的优越性。
6、细胞系鉴定
据估计, 实验室中细胞系的污染机会占30%, 因此对细胞系的鉴定显得非常重要。目前鉴定细胞系的方法有同工酶分析, 细胞遗传学分析。前者所检查的基因座位少, 而后者可立刻检查到典型的变化, 但不稳定性使其信息有限。由于两个随机个体具有相同DNA指纹的概率为3 x10-11。因此可将D N A 指纹技术用于细胞系鉴定。多位点
的DNA 指纹探针可同时提供基因组上许多墓因座位的情祝和检查微小的或散在的遗传变化, 因而可对来自同一个体的细胞索进行分类和对突,变体进行识别。目前越来越多的火利用单位点探针在高严谨的条件下进行杂交, 在细胞系鉴定上很有用。最近有人结合PCR 进行DNA指纹分析,能对southern 杂交不能检测到的微小变化进行基因座位分析.目前这三种方法都在ECACC使用, 其中D N A 指纹分析可检查细胞的变化, 且能很快筛选。而细胞遗传分析只有在标记有染色体约情况下才能进行。
综合以上可以看出DNA指纹作为基因组中的高度多态遗传标记, 能够按照孟德尔方式等显性地遗传, 具有组织细胞稳定性, 又有高度的个体特异性, 含多态信息量很丰富, 是一种很有用的遗传标记。但是, 在实际应用中, D N A 指纹图谱中的谱带较多, 而且各条带的强弱不一, 不易判读, 对等位基因的判断也较为困难。目前, 多位点探针检测D N A 片段的范围通常在4至2 4 kb之间, 小于4k b 的基因组酶切片段可能很有意义. 但是不能判读.
指纹识别系统 1.1 指纹识别系统原理 指纹识别系统的组成原理。如图1-1所示。图中的学习模块负责采集用户指纹数据，对指纹图像进行预处理，提取这些指纹的特征，作为将来的比对模板存人数据库。而识别模块则负责采集和处理指纹图像，在提取特征后与数据库中的指纹模板进行比对，然后判断是否匹配．得出结论。整个系统的核心就是图像处理、特征提取以及指纹比对。 图1-1 1.2 指纹采集与指纹图像处理方法 目前，主要的指纹采集方法有两种：一种是光学采集器；另一种是用半导体传感器。光学采集器采集指纹是通过把手指沾上油墨后按在白纸上，然后用摄像机把图像转换为电信号。光学采集受外界干扰小、采集精度较高，但是数据量较大，因此处理时问较长。而对于半导体传感器来说，手指的温度、湿度对其测量结果有影响，但是数据量不大，处理比较方便。随着半导体技术的发展，半导体传感器的成本低、体积小、方便集成等优点逐步体现，它已逐步代替光学采集器。指纹鉴定过程的第一个阶段是指纹图像的采集阶段，也就是指纹模板的录A阶段。为了初步确定图像预处理方法，我们必须首先了解指纹传感器获得的图像的尺寸和质量。根据不同的指纹传感器，我们设计不同的方案进行图像采集，并将从各个图中提出特征点储存到数据库中，来产生“活模板”，为后面的指纹鉴定做准备。 指纹图像处理是整个指纹识别过程的核心。常见的指纹图像处理包括滤波增强、二值化、细化、提取特征点四个步骤。在采集指纹图像的过程中，由于采集环境，皮肤表面的性质，采集设备的差异等各种因素的影响，采集的图像会不同程度的受到各种噪声的干扰，从而影响了采集图像的质量。所以实际的指纹图像首先通过一个滤波增强来改善图像的质量，恢复
程序： #include
uchar code ri[]={"日"}; uchar code xinqi[]={"星期"}; uchar code mao=0x3a; unsigned char code text1[]={" 请按指纹"}; unsigned char code text2[]={" 请再次按指纹"}; unsigned char code text3[]={" 指纹采集成功"}; unsigned char code text4[]={"请按任意键继续"}; unsigned char code text5[]={" 指纹采集失败"}; unsigned char code text6[]={"输入删去的指纹号"}; unsigned char code text7[]={" 删指纹号成功"}; unsigned char code text8[]={"按键一：增加指纹"}; unsigned char code text9[]={"按键二：删去指纹"}; unsigned char code text10[]={" 请重新按指纹"}; unsigned char code text11[]={"清空指纹库成功"}; unsigned char code text12[]={" 没搜索到指纹"}; unsigned char code text13[]={"请先按键再刷指纹"}; unsigned char code text14[]={" 请重新操作"}; unsigned char code text15[]={" 删去失败"}; unsigned char code text16[]={" 接收包出错"}; unsigned char code text17[]={" 编号为："}; unsigned char code text18[]={"指纹已找到请进"}; unsigned char code text19[]={" 该指纹已存储"}; unsigned char code text20[]={" 请输入密码"}; unsigned char code text21[]={" 密码错误"}; unsigned char code text22[]={"按键三：更新密码"}; // @@@ unsigned char code text23[]={"请再次输入密码"}; unsigned char code text24[]={"两次输入的密码不"}; unsigned char code text25[]={"一致，请重新操作"}; unsigned char code text26[]={" 密码更新成功"}; 另外： void delay(uint tt) { uchar i; while(tt--) { for(i=0;i<125;i++); } } void initialize51() {
一、 A 型题 1. F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为 (A) 转导 (B) 转化 (C) 转座 (D) 转染 (E) 接合 2. 通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为 (A) 转化 (B) 转座 (C) 接合 (D) 转导 (E) 转染 3. 由插人序列和转座子介导的基因移位或重排称为 (A) 接合 (B) 转染 (C) 转导 (D) 转座 (E) 转化 4. 由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称
(A) 位点特异的重组 (B) 同源重组 (C) 随机重组 (D) 基本重组 (E) 人工重组 5. 发生在同源序列间的重组称为 (A) 非位点特异的重组 (B) 位点特异的重组 (C) 基本重组 (D) 人工重组 (E) 随机重组 6. 限制性核酸内切酶切割DNA后产生 (A) 5’磷酸基和3’羟基基团的末端 (B) 5’磷酸基和3’磷酸基团的末端 (C) 5’羟基和3’羟基基团的末端 (D) 3’磷酸基和5’羟基基团的末端 (E) 以上都不是 7. 可识别并切割特异DNA序列的称 (A) 非限制性核酸外切酶 (B) 限制性核酸内切酶 (C) 限制性核酸外切酶 (D) 非限制性核酸内切酶
(E) DNA酶（DNase） 8. 在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的是DNA (A) 解链酶 (B) 聚合酶 (C) 连接酶 (D) 内切酶 (E) 拓扑酶 9. 在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指 (A) 建立多克隆抗体 (B) 建立单克隆抗体 (C) 有性繁殖DNA (D) 无性繁殖DNA (E) 构建重组DNA分子 10. 在下述双链DNA序列（仅列出其中一条链序列）中不属于完全回纹结构的是 (A) GGAATTCC (B) TGAATTCA (C) AGAATTCT (D) CGTTAAGC (E) AGATATCT 11. 无性繁殖依赖DNA载体的最基本性质是 (A) 卡那霉素抗性 (B) 青霉素抗性
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2
第2课时基因工程的原理和技术 知识内容要求考情解读 基因工程的原 理和技术 b 1.简述基因工程的原理。 2.概述基因工程基本操作的几个步 骤。 一、基因工程的原理 1．基本原理 让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳定和高效地表达。 2．变异类型 基因工程属于可遗传变异中的基因重组。 归纳总结(1)在基因工程中，不同DNA链的断裂和连接产生DNA片段的交换和重新组合，形成了新的DNA分子，在这个操作中交换了DNA片段，故属于基因重组。 (2)基因工程中的基因重组不同于减数分裂过程中的基因重组。前者属于无性生殖中的重组，并发生在不同种生物间，打破了物种间的界线，可以定向地改造生物的遗传特性，此操作均在细胞外进行。 例1科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的内吞作用进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体上，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程属于( ) A．基因突变B．基因重组 C．基因互换D．染色体畸变 答案 B 解析基因突变是基因内部结构的改变；染色体畸变是以染色体作为研究对象，探讨染色体结构和数目的变化；基因工程是将外源基因导入受体细胞，得到人们所需要的产物，属于基因重组。 例2下列叙述符合基因工程基本原理的是( ) A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因 B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株 C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株 D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上 答案 B 解析基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基
第二章指纹识别的原理和方法 指纹识别的采集及其参数[15] 指纹具有惟一性（随身携带、难以复制、人人不同、指指相异）。根据指纹学理论，将两人指纹分别匹配上12个特征时的相同几率仅为1/1050。指纹还具有终身基本不变的相对稳定性。指纹在胎儿六个月时已完全形成，随着年龄的增长，尽管人的指纹在外形大小、纹线粗细上会有变化，局部纹线之间也可能出现新细线特征，但从总体上看，同一手指的指纹纹线类型、细节特征的总体布局等无明显变化。指纹的这些特点为身份鉴定提供了客观依据。 指纹识别过程可以分为4个步骤：采集指纹图像、提取特征、保存数据和比对。通过指纹读取设备读取到人体指纹的图像,取到指纹图像之后，要对原始图像进行初步的处理，使之更清晰。指纹辨识软件建立指纹的数字表示特征数据，软件从指纹上找到被称为“节点”（minutiae）的特征点，这些数据(通常称为模板)，保存为1K大小的记录。最后，通过计算机模糊比较的方法，把两个指纹的模板进行比较，计算出它们的相似程度，最终得到两个指纹的匹配结果。 2.2.1指纹图像的采集[16][17][18] 指纹采集模式主要分为“离线式”和“在线式”两种。所谓“离线式”就是指在指纹采集时，利用某些中间介质（如油墨和纸张）来获取指纹图像，在通过一定的技术手段将图像数字化输入计算机，它属于非实时采集。目前“离线式”采集方式在大多数场合已经消失。所谓“在线式”是通过与计算机联机的先进指纹传感器的专用指纹采集设备，将真实的人体指纹直接变成数字图像数据，实时传输给计算机。 基于指纹传感器的“在线式”实时采集设备以其操作简单、实时性强、采集效率高、图像质量好等优点，广泛应用于自动指纹识别领域。 指纹传感器是采集指纹的装置,是一切自动指纹识别系统的必备设备,从原理上,目前见到的指纹传感器分下面3类： (1)光学录入
指纹识别的原理和方法 一、概述 指纹识别的背景知识 我们手掌及其手指、脚、脚趾内侧表面的皮肤凸凹不平产生的纹路会形成各种各样的图案。这些纹路的存在增加了皮肤表面的摩擦力，使得我们能够用手来抓起重物。人们也注意到，包括指纹在内的这些皮肤的纹路在图案、断点和交叉点上各不相同，也就是说，是唯一的。依靠这种唯一性，我们就可以把一个人同他的指纹对应起来，通过对他的指纹和预先保存的指纹进行比较，就可以验证他的真实身份。这种依靠人体的身体特征来进行身份验证的技术称为生物识别技术，指纹识别是生物识别技术的一种。 目前，从实用的角度看，指纹识别技术是优于其他生物识别技术的身份鉴别方法。这是因为指纹各不相同、终生基本不变的特点已经得到公认。 最早的指纹识别系统应用与警方的犯罪嫌疑人的侦破，已经有30多年的历史，这为指纹身份识别的研究和实践打下了良好的技术基础。特别是现在的指纹识别系统已达到操作方便、准确可靠、价格适中的阶段，正快速的应用于民用市场。 指纹识别系统通过特殊的光电转换设备和计算机图像处理技术，对活体指纹进行采集、分析和比对，可以迅速、准确地鉴别出个人身份。 系统一般主要包括对指纹图像采集、指纹图像处理、特征提取、特征值的比对与匹配等过程。现代电子集成制造技术使得指纹图像读取和处理设备小型化，同时飞速发展的个人计算机运算速度提供了在微机甚至单片机上可以进行指纹比对运算的可能，而优秀的指纹处理和比对算法保证了识别结果的准确性。 指纹自动识别技术正在从科幻小说和好莱坞电影中走入我们实际生活中，就在今天，您不必随身携带那一串钥匙，只需手指一按，门就会打开；也不必记住那烦人的密码，利用指纹就可以提款、计算机登录等等。 指纹识别技术主要涉及四个功能：读取指纹图像、提取特征、保存数据和比对。 在一开始，通过指纹读取设备读取到人体指纹的图像，取到指纹图像之后，要对原始图像进行初步的处理，使之更清晰。 接下来，指纹辨识软件建立指纹的数字表示——特征数据，一种单方向的转换，可以从指纹转换成特征数据但不能从特征数据转换成为指纹，而两枚不同的指纹不会产生相同的特征数据。软件从指纹上找到被称为―节点‖（minutiae）的数据点，也就是那些指纹纹路的分叉、终止或打圈处的坐标位置，这些点同时具有七种以上的唯一性特征。因为通常手指上平均具有70个节点，所以这种方法会产生大约490个数据。 有的算法把节点和方向信息组合产生了更多的数据，这些方向信息表明了各个节点之间的关系，也有的算法还处理整幅指纹图像。总之，这些数据，通常称为模板，保存为1K大小的记录。无论它们是怎样组成的，至今仍然没一流种模板的标准，也没一流种公布的抽象算法，而是各个厂商自行其是。 最后，通过计算机模糊比较的方法，把两个指纹的模板进行比较，计算出它们的相似程度，最终得到两个指纹的匹配结果。 指纹识别的原理和方法 二. 取得指纹图象 1.取象设备原理 取像设备分成两类：光学、硅晶体传感器和其他。
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
Chapter I Introduction 1)什么是基因？基因有哪些主要特点？ 基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。 ①不同基因具有相同的物质基础.②基因是可以切割的。③基因是可以转移的。④多肽与基因之间存在 对应关系。⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。 2)翻译并解释下列名词 genetic engineering遗传工程 gene engineering基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。 gene manipulation基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。 recombinant DNA technique重组DNA技术 gene cloning基因克隆：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 molecular cloning分子克隆 3)什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p2 p4 4)简述基因工程研究的主要内容？p5 5)简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p3？ 6)基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 否，密码子简并性 7)举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。 医学:人胰岛素和疫苗 农业:抗虫BT农药 工业:工程酿酒酵母
Chapter ⅡThe tools of trade 1)什么是限制性核酸内切酶？简述其主要类型和特点？ 是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。类型特点p11 2)II型核酸内切酶的基本特点有哪些p12-14？简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些 p14？ 3)解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？ 4)什么是DNA连接酶p15？有哪几类p16？有何不同p16？ 5)什么叫同尾酶、同裂酶p12？在基因工程中有何应用价值？ 同裂酶：识别位点、切割位点均相同，来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Sma1和Xma1，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末 同尾酶：来源各异，识别序列各不相同，但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isocaudomer)产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。 6)什么是DNA聚合酶？根据DNA聚合酶使用的模板不同，可将其分为哪两类？各有什么活 性？p17-18 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3‘-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。 ①依赖于DNA的DNA聚合酶 ②依赖于RNA的DNA聚合酶 7)Taq DNA聚合酶：是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dna聚合酶，具有5-3聚 合酶活性和3-5外切酶活性，在分子中主要用于PCR。 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶， 8)Klenow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p17 9)名词解释：S1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、 甲基化酶
精品文档 《基因工程原理与技术》标准答案及评分标准 一、名词解释（本大题共5小题，每题2分，总计10分） 限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH 等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞 T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 克隆基因的表达：指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过 程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 a -互补：3 -半乳糖苷酶（B -gal）是大肠杆菌lacZ基因的产物，当培养基中的一种色素元（X-gal ）被3 -gal切割后，即产生兰色。大肠杆菌的3一半乳糖苷酶由1021个氨基酸构成，只有在四聚体状态下才有活性。大肠杆菌lacZ基因由于a区域缺失，只能编码一种在氨基端截短的多肽，形成无活性的不完全酶，称为a受体；如果载体的lacZ 基因在相反方向缺失，产生在羧基端截短的多肽，这种部分3 -半乳乳糖苷酶也无活性。 但是这种蛋白质可作为a供体。受体一旦接受了供体（在体内或体外），即可恢复3 -半乳糖苷酶的活性，这种现象称为a互补. 由载体产生的a供体能够与寄主细胞产生 的无活性的a受体互作形成一种八聚体，从而恢复3 -半乳糖苷酶的活性。如果培养基 中含有X-gal的诱导物IPTG时，凡是包含有3 -半乳糖苷酶活性的细胞将转变为蓝色，反之不含有这种酶活性的细胞将保持白色。 、填空题（本大题共7小题，每空1分，总计20 分） 1、质粒按自我转移的能力可分为—接合型—质粒和—非接合型—质粒；按复制类型可分为松 弛性质粒和严紧型质粒。 2、为了防止DNA的自身环化，可用碱性磷酸酶除去双链DNA 5'—端的磷酸基团 。 3、人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为_0匸—时吸附DNA在温度为_42乜__ 时摄人 DNA 4、仅克隆基因（DNA片段）用途而言，最简单的质粒载体也必需包括三个组成部分： 复制区：含有复制起点__、选择标记：主要是抗性基因 ________ 、__克隆位点：便于外源_ DNA的插入_。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 5、Southern blotting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基 因的转录表达需要通过—northern_杂交或_ RT-PCR_来揭示；而外源基因_____ 翻 译—水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是 —蛋白质____ 。 6、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位有—细胞质_、_ —周质_、一细胞外 _。 7、Vir区基因的激活信号有三类，它们是—酚类化合物_、_中性糖和酸性糖_、— _ pH 值_。 简答题（本大题共7 小题，总计50 分） 1欢迎下载
指纹识别技术的基本原理 指纹其实是比较复杂的。与人工处理不同，许多生物识别技术公司并不直接存储指纹的图象。多年来在各个公司及其研究机构产生了许多数字化的算法（美国有关法律认为，指纹图象属于个人隐私，因此不能直接存储指纹图象）。但指纹识别算法最终都归结为在指纹图象上找到并比对指纹的特征。 指纹的特征 我们定义了指纹的两类特征来进行指纹的验证：总体特征和局部特征。总体特征是指那些用人眼直接就可以观察到的特征，包括： 环型（loop）, 弓型（arch）, 螺旋型（whorl）。其他的指纹图案都基于这三种基本图案。仅仅依靠图案类型来分辨指纹是远远不够的，这只是一个粗略的分类，但通过分类使得在大数据库中搜寻指纹更为方便 1、模式区（Pattern Area） 模式区是指指纹上包括了总体特征的区域，即从模式区就能够分辨出指纹是属于那一种类型的。有的指纹识别算法只使用模式区的数据。Aetex 的指纹识别算法使用了所取得的完整指纹而不仅仅是模式区进行分析和识别。
2、核心点（Core Point） 核心点位于指纹纹路的渐进中心，它用于读取指纹和比对指纹时的参考点。 3、三角点（Delta） 三角点位于从核心点开始的第一个分叉点或者断点、或者两条纹路会聚处、孤立点、折转处，或者指向这些奇异点。三角点提供了指纹纹路的计数和跟踪的开始之处。 4、式样线（Type Lines） 式样线是在指包围模式区的纹路线开始平行的地方所出现的交叉纹路，式样线通常很短就中断了，但它的外侧线开始连续延伸。 5、纹数（Ridge Count） 指模式区内指纹纹路的数量。在计算指纹的纹数时，一般先在连接核心点和三角点，这条连线与指纹纹路相交的数量即可认为是指纹的纹数。局部特征局部特征是指指纹上的节点。两枚指纹经常会具有相同的总体特征，但它们的局部特征——节点，却不可能完全相同。 6、节点（Minutia Points） 指纹纹路并不是连续的，平滑笔直的，而是经常出现中断、分叉或打折。这些断点、分叉点和转折点就称为“节点”。就是这些节点提供了指纹唯一性的确认信息。 指纹上的节点有四种不同特性：
指纹识别原理及其应用 1 指纹识别的原理和方法 1.1 指纹的特征与分类 指纹识别学是一门古老的学科，它是基于人体指纹特征的相对稳定与唯一这一统计学结果发展起来的。实际应用中，根据需求的不同，可以将人体的指纹特征分为：永久性特征、非永久性特征和生命特征[5]。 永久性特征包括细节特征（中心点、三角点、端点、叉点、桥接点等）和辅助特征（纹型、纹密度、纹曲率等元素），在人的一生中永不会改变，在手指前端的典型区域中最为明显，分布也最均匀[1]。细节特征是实现指纹精确比对的基础，而纹形特征、纹理特征等则是指纹分类及检索的重要依据。人类指纹的纹形特征根据其形态的不同通常可以分为“弓型、箕型、斗型”三大类型，以及“孤形、帐形、正箕形、反箕形、环形、螺形、囊形、双箕形和杂形”等9种形态[1]。纹理特征则是由平均纹密度、纹密度分布、平均纹曲率、纹曲率分布等纹理参数构成。纹理特征多用于计算机指纹识别算法的多维分类及检索。 非永久性特征由孤立点、短线、褶皱、疤痕以及由此造成的断点、叉点等元素构成的指纹特征，这类指纹有可能产生、愈合、发展甚至消失[1]。 指纹的生命特征与被测对象的生命存在与否密切相关。但它与人体生命现象的关系和规律仍有待进一步认识。目前它已经成为现代民用指纹识别应用中越来越受关注的热点之一。 1.2 指纹识别的原理和方法 指纹识别技术主要涉及四个功能：读取指纹图像、提取特征、保存数据和比对。通过指纹读取设备读取到人体指纹的图像，然后要对原始图像进行初步的处理，使之更清晰，再通过指纹辨识软件建立指纹的特征数据。软件从指纹上找到被称为“节点”（minutiae）的数据点，即指纹纹路的分叉、终止或打圈处的坐标位置，这些点同时具有七种以上的唯一性
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-
官网：https://www.doczj.com/doc/457225000.html, 指纹锁指纹识别技术的基本原理介绍 指纹锁的识别灵敏度是指纹锁产品性能和用户体验的重要指标之一，但现实生活中指纹锁识别指纹时总容易受到外接因素的影响。比如手指多汗，或指纹采集窗太潮湿会导致指纹锁识别失灵，这究竟是什么原因呢，英迪隆智能指纹锁为你简单解答一下。 指纹是人的手指正面皮肤上有规律排列却又不尽相同的纹线。指纹中的中断、分叉或转折而形成的点就是细节特征点，而这些细节特征点，就提供了指纹唯一性的确认信息。而指纹识别传感器就是通过记录指纹纹路的方向，并将其数字化，形成一个独一无二的钥匙，并以解锁。 目前指纹锁采集指纹的方式主要有两种，光学式和电容式。光学指纹头通过计算光线在指纹的沟和脊与采集窗的不同距离而获取指纹信息，当手指有汗渍或采集窗有水分，就会影响光线的传递与距离，导致所获取的指纹信息与原来储存的信息有误，因此指纹锁识别失灵。 而电容式指纹锁虽然比光学指纹锁更先进，但也存在受潮后识别失灵的情况。说起电容式指纹锁，其原理大家应该可以联想一下电容屏的工作原理，都是利用人体的电流感应进行工作的。 电容式指纹锁指纹识别传感器周边均镀上了狭长的电极，当手指按到指纹采集窗时，由于人体是一个电场，用户指纹纹路和传感器表面会形成一个耦合电容，对于高频电流来说，电容是直接导体，于是手指就会从接触点吸走一个很小的电流。这个电流分从周边的电极中流出，并且流经周边电极的电流与指纹到周边的距离成正比，控制器通过对电流比例的精确计算，得出触摸纹路相关数据。 简单来说就是用户的指纹摁到哪儿，哪儿就“通电”“漏电”了，传感器就有了反应了。所以，当手指有汗或者采集窗有水渍时，由于水是导电的，用户使用指纹识别时，电流就会被影响，所以上面的计算就不准了，自然识别失灵了。 因此，当指纹锁用户在首次录入指纹时，最好保持手指与指纹采集窗的干燥与干净，好录入正确干净的指纹;当用户使用指纹解锁时，擦干手指和采集窗就可以避免指纹锁失灵的情况。
指纹识别原理及模组工艺 概述 指纹识别的背景知识 我们手掌及其手指、脚、脚趾侧表面的皮肤凸凹不平产生的纹路会形成各种各样的图案。这些纹路的存在增加了皮肤表面的摩擦力，使得我们能够用手来抓起重物。人们也注意到，包括指纹在的这些皮肤的纹路在图案、断点和交叉点上各不相同，也就是说，是唯一的。依靠这种唯一性，我们就可以把一个人同他的指纹对应起来，通过对他的指纹和预先保存的指纹进行比较，就可以验证他的真实身份。这种依靠人体的身体特征来进行身份验证的技术称为生物识别技术，指纹识别是生物识别技术的一种。 目前，从实用的角度看，指纹识别技术是优于其他生物识别技术的身份鉴别方法。这是因为指纹各不相同、终生基本不变的特点已经得到公认。 最早的指纹识别系统应用与警方的犯罪嫌疑人的侦破，已经有30多年的历史，这为指纹身份识别的研究和实践打下了良好的技术基础。特别是现在的指纹识别系统已达到操作方便、准确可靠、价格适中的阶段，正快速的应用于民用市场。 指纹识别系统通过特殊的光电转换设备和计算机图像处理技术，对活体指纹进行采集、分析和比对，可以迅速、准确地鉴别出个人身份。 系统一般主要包括对指纹图像采集、指纹图像处理、特征提取、特征值的比对与匹配等过程。现代电子集成制造技术使得指纹图像读取和处理设备小型化，同时飞速发展的个人计算机运算速度提供了在微机甚至单片机上可以进行指纹比对运算的可能，而优秀的指纹处理和比对算法保证了识别结果的准确性。指纹自动识别技术正在从科幻小说和好莱坞电影中走入我们实际生活中，就在今天，您不必随身携带那一串钥匙，只需手指一按，门就会打开；也不必记住那烦人的密码，利用指纹就可以提款、计算机登录等等。指纹识别技术主要涉及四个功能：读取指纹图像、提取特征、保存数据和比对。 在一开始，通过指纹读取设备读取到人体指纹的图像，取到指纹图像之后，要对原始图像进行初步的处理，使之更清晰。 接下来，指纹辨识软件建立指纹的数字表示——特征数据，一种单方向的转换，可以从指纹转换成特征数据但不能从特征数据转换成为指纹，而两枚不同的指纹不会产生相同的特征数据。软件从指纹上找到被称为“节点”（minutiae）的数据点，也就是那些指纹纹路的分叉、终止或打圈处的坐标位置，这些点同时具有七种以上的唯一性特征。因为通常手指上平均具有70个节点，所以这种方法会产生大约490个数据。有的算法把节点和方向信息组合产生了更多的数据，这些方向信息表明了各个节点之间的关系，也有的算法还处理整幅指纹图像。总之，这些数据，通常称为模板，保存为1K大小的记录。无论它们是怎样组成的，至今仍然没有一种模板的标准，也没有一种公布的抽象算法，而是各个厂商自行其是。 文案
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti 质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T— DNA 是质粒上一段10—30kb的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA 转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB， pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在VirD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程；(4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染；(5)共培养及脱菌处理；(6)愈伤组织筛选、分化与植株再生；(7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测；(7)转基因T1代的目标性状鉴定。 农杆菌介导法具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、基因沉默现象少、转育周期