《细胞生物学研究方法与技术》课程简介
（医学遗传学与细胞生物学教研室）
本课程重点介绍一些细胞生物学实验研究中的基本方法与技能。通过理论课和实验课的学习，使学生们能够掌握这些常用方法和技术的原理和主要操作过程，并结合本专业的需要能灵活地运用在科研工作上。
课程主要内容：
一、理论课（19学时）
主要讲授显微镜技术（各种显微镜的主要原理和用途）；细胞化学技术（细胞化学方法，放射自显影技术）；细胞及其组分的分级分离技术（差速离心、移动区带离心法、密度梯度离心的原理应用及实验方法）；细胞培养技术（细胞培养的基本知识、方法及检测指标）；显微摄影技术（显微摄影的原理及方法、近拍技术、暗房技术）；细胞融合技术（细胞杂交技术、单克隆抗体技术）；细胞增殖周期与检测（细胞周期的过程、特点及检测技术）；细胞凋亡技术（细胞凋亡特征、常用检测方法及凋亡基因表达的检测技术）；胚胎干细胞技术。
二、实验课（31学时）
细胞培养（18学时），显微摄影（13学时）.
细胞培养实验包括培养器皿的清洗、包装与消毒；原代培养、传代培养、细胞计数及细胞活力检测。通过实验，使同学们能真正掌握细胞培养的无菌基本操作技术、细胞的常规观察以及原代和传代的培养方法。
显微摄影包括光学显微镜下的玻片标本摄影；倒置显微镜下的培养细胞摄影；图片翻拍摄影、近拍摄影；底片冲洗；摄影用药的配制；暗房技术。通过实验使同学们能掌握显微摄影的各种拍摄方法及冲印技术，为今后的科研实验打好基础。
细胞生物学教案 （来自https://www.doczj.com/doc/4512978547.html,）目录 前言 第一章绪论 第二章细胞结构概观 第三章研究方法 第四章细胞膜 第五章物质运输与信号传递 第六章基质与内膜 第七章线粒体与叶绿体 第八章核与染色体 第九章核糖体 第十章细胞骨架 第十一章细胞增殖及调控 第十二章细胞分化 第十三章细胞衰老与凋亡
前言 依照高等师范院校生物学教学计划，我们开设细胞生物学。 一、学科本身的重要性 要最终阐明生命现象，必须在细胞水平上。细胞是生命有机体最基本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上阐明各种生命现象。世界著名生物学家Wilson（德国人）曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找”。 二、学科发展特点 细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学发展的前沿，又是生命科学赖以发展的基础。 三、欲达到的目的 通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构发展的需求，也是为考研做准备。 本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。 参考资料 1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年（第四版）；1980年（第七版）《细胞和分子生物学》 2 Avers，“Molecular Cell Biology”， 1986年 3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell”，1989年 4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年（第一版）；1990年（第二版）“Molecular Cell Biology”5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版 6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社 7 翟中和，细胞生物学基础，1987年，北京大学出版社 8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；2000年由科学出版社再版 9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，北京师范大学出版社 10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，2000年再版 11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》， 12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起（1—3卷），北师大出版社 13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社 14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社 15徐承水，《细胞超微结构研究》2000，中国国际教育出版社 学术期刊、杂志 国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol. 国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等
第2章探索生命 第1节生物学研究的基本方法 一、教材分析 生物学是一门自然科学，研究的是一些科学事实。在各种科学事实间建立合理的联系，寻找事实产生的原因，提出解释事实的各种假说和理论。生物科学的发展就是人类不断研究的过程，研究过程要用到不同的方法，要让学生不断学会研究方法很重要，所以，通过这节课的学习，让学生初步学会简单的生物学研究方法，提高学生的能力，为以后学习生物学打好基础，也为社会进步带来新的希望。 二、教学目标 知识与技能目标：能说出实验法的基本步骤。 过程与方法目标：通过提出假设和设计实验方案，尝试科学探究的一般方法；通过材料获取和处理信息，培养学生收集材料的能力和分析处理信息的能力。 情感态度与价值观目标：在讨论中，体验用实验法进行科学探究的过程，逐渐形成严谨、实事求是的科学态度；在小组活动中，学会交流与表达，学会与他人合作。 三、教学重难点 教学重点:实验法研究的一般步骤 教学难点：在教师的指导下，以小组为单位，学生自己进行分析、处理、归纳信息，设计实验方案。 教法：通过媒体展示，提高课堂容量、拓宽学生知识面，同时采用观察、思考、阅读、探究方法等相结合。 教具：多媒体课件 四、教学过程 内容设计意图 导入教师 活动我们现在学的生物教材是属于生物学，生物学是一门不断研究 的学科，也是一门自然科学，既然是一门自然学科，那么在研 究的过程中就要遵循自然规律，要遵循自然规律进行研究，就 应该首先掌握研究的基本方法，引入课题 激发学生的兴趣引入主题 一、 生物学研究的基本方法教师 活动 提问：同生们平时在生活中遇到问题是怎么解决的， 用到哪些方法？ 联系生活实际激发学生的求知 欲 学生 活动 思考、结合生活实际回答问题培养学生的语言表达能力 教师 活动 多媒体展示：科学家们的研究的基本方法：观察、 调查、分类、实验等，引出实验法最重要 整体感知，培养学生的观察能 力 二、过度 思考 既然实验法是最重要的，那么实验法研究的基本步骤是什么 呢？ 设置悬念引入思考 教师 活动 引出：本节课要以“实验法研究的示例：响尾蛇是如何跟踪它 放走的猎物”为例来了解实验法研究的基本步骤 多媒体展示：不同种响尾蛇的图片和有关响尾蛇的文字介绍 感知认识 学生 活动 认真观察、阅读信息，加强对响尾蛇的了解 感知认识，拓展学生的视野教师 活动 展示图片：播放响尾蛇捕捉老鼠的视频，并对视频内容作解释 直观形象，激发学生兴趣 学生 活动 认真观察、迅速获取信息培养学生的观察能力和获取信 息的能力 教师 活动 提问学生：通过观察录像，叫学生说出自己感兴趣的问题 引导学生发现问题 学生 活动 学生主动起来说出自己感兴趣的问题落实学生自主学习，培养学生 的创新能力 教师对学生提出的问题作出客观评价，指出在众多问题中，本节课统一学生的思想，引导学生共 - 1 -
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
生物学的基本研究方法 一、基础知识： （1）、_________和_______是科学探究基本方法。也是我们学习生物学的基本方法。 (2)、实践可以给研究者提供现象、数据等资料，是检验_______、形成科学理论的实践基础。 实验的一般规程是：1. ________________________ 2、_____________________________ 3、________________________ 4、________________________________ 5、_________________________________________ (3)正确使用显微镜的步骤是：1. ________________________ 2、_____________________________ 3、________________________4、_________________________5、____________________________ 在显微镜下观察到的物像是________像。 （4）科学探究的基本过程是;1. _____________ 2、_____________3、______________ 4、________________________ 5、___________________ 6、__________________________ 实验中单一变量原则：变量是______________________，在一个实验中，除了要研究的变量以外，其余的变量都应__________，并控制在__________状态。 （5）什么叫对照实验？_________________________________________ _________________________________________ _________________________________________ （6）收集资料和分析资料有什么好处？ _________________________________________ _________________________________________ （7）测量 在测量中如何提高数据的可靠性？_________________________________________ （8）调查：调查是科学探究的常用方法。 完成一项调查需要做好哪几个方面工作？________________________________ ________________________________________________________________ （9）综合起来科学探究的方法概括起来有： 1、2、3、 4 二、探究训练 1、使用显微镜对光的程序是（） ①选遮光器上较大的光圈对准通光孔②转动转换器，使低倍物镜对准通光孔，③左眼注视目 镜，右眼睁开④转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内 A、①→②→③→④ B、②→①→③→④ C、③→④→②→① D、③→②→①→④ 2、小明在用显微镜进行观察时看到了一个小黑点，移动载玻片和物镜，小黑点不动，由此可判断小 黑点可能在( ) A 目镜上 B 物镜上 C 载玻片上 D 反光镜上 3、当显微镜的目镜为10X、物镜为10X时，在视野直径范围内看到一行相连的8个细胞。若目镜 不变，物镜换成40X时，则在视野中可看到这行细胞中的（） A．2个B．4个C．16个D．32个 4、小强在显微镜下观察到了洋葱表皮细胞后，兴奋地向同学描述，并把显微镜轻轻挪动给同组同学，
第二章细胞生物学研究方法 第三节细胞分离技术 一、离心技术 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10~25Kr/min的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500Kg。 （一）、差速离心（differential centrifugation） 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器（图2-22）。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。 由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。 差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 图2-22 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 （二）、密度梯度离心（density gradient centrifugation） 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分
离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 图2-23 ?A等速度沉降，B等密度沉降 1、速度沉降 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 2、等密度沉降 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。再者，这种方法所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。大细胞比小细胞更易受高离心力的损伤，而且停留在等密度介质
细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。
第二章细胞生物学研究方法 (the research method in the cell biology) 教学目的 1、了解主要工具和常用方法，侧重掌握基本原理和基本应用； 2、认识工具和方法与学科发展的相关性。 教学内容 本章从以下5个方面介绍了细胞生物学的研究方法: 1．显微成像技术 2．细胞化学技术 3．细胞分选技术 4．细胞工程技术 5．分离技术 6．分子生物学方法 计划学时及安排 本章计划3学时。 教学重点和难点 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,方法上的突破,对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用，这是学习本章应确立的基本思想。 1．显微成像包括直接成像和间接成像。显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。在光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒置显微镜。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具, 透射和扫描电镜的是两类主要的电子显微镜, 对其基本结构、工作原理和样品制备方法则是学习的重点。 2．细胞化学技术介绍了酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技术, 其中流式细胞分选技术是细胞生物学和现代生物技术中的重要技术, 应重点掌握。 3．细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内
生物科学研究方法 ?科学研究方法： 1、假说——演绎法 ①提出假设 ②演绎就是推理 ③实验验证假设和推理 ④得出结论 2、同位素示踪法：同位素示踪法是利用放射性核素或稀有稳定核素作为示踪剂对研 究对象进行标记的微量分析方法 3、科学的研究方法包括：归纳法、类比推理法、实验法和演绎法。 ①归纳法：是从个别性知识，引出一般性知识的推理，是由已知真的前提，引出可能 真的结论。它把特性或关系归结到基于对特殊的代表（token ）的有限观察的类型；或公 式表达基于对反复再现的现象的模式（pattern ）的有限观察的规律。 ②类比推理法：类比推理这是科学研究中常用的方法之一。类比推理是根据两个或两 类对象有部分属性相同，从而推出它们的其他属性也相同的推理。简称类推、类比。它是 以关于两个事物某些属性相同的判断为前提，推出两个事物的其他属性相同的结论的推理。 ③实验法：通过试验的论证得出所需数据，进行分析后得出结论。分为：化学物质的 检测方法；实验结果的显示方法；实验条件的控制方法；实验中控制温度的方法 ④演绎法：从普遍性结论或一般性事理推导出个别性结论的论证方法。演绎法得出的 结论正确与否，有待于实践检验。它只能从逻辑上保证其结论的有效性，而不能从内容上 确保其结论的真理性。也可以从逻辑思维，逆向思维和想象思维延伸到其结论该以反证明。 4、实验必须遵守的原则： ①设置对照原则：空白对照；条件对照；相互对照；自身对照。 ②单一变量原则； ③平行重复原则 5、实验的特性：对照，统一性质。提出问题；设计方案；讨论结果；分析问题。分 为科学实验；验证性实验；对照实验等。 ?知识拓展：
一、章（节、目）授课计划第页
二、课时教学内容第 技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技 术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的 方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有: 核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 （2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的 比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是 100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决 定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的 d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d′/d 二、显微镜的分类 现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学
第2章第2节生物学研究的基本方法 教学目的 1、说出实验法研究的一般步骤； 2、尝试设计简单的实验并控制实验条件； 1、根据实验数据建立一个表格并分析数据。 教学重点 实验法研究的的一般步骤 课时安排 2课时。 教学方法 观、思、读、探相结合 板书设计 第2节生物学研究的基本方法 一、生物学研究的基本方法 观察法、调查法、分类法、文献法、实验法 二、实验法的一般步骤 1、实验法示例——响尾蛇是如何追寻它放走的猎物的 2、活动“讨论实验法基本程序” 发现并提出问题——收集与问题相关的信息——作出假设——设计实验方案——实施实验并计录——分析实验现象——得出结论 三、用实验法研究影响生物分布的环境因素——活动“探究影响分布鼠妇的环境因素”教学过程 第一课时以实验法研究的示例“响尾蛇是如何追寻它放走的猎物的”为核心，探究实验法基本程序的。 复习提问：①上节课我们学习哪四位具有代表性的科学家？②他们的研究成果是什么？③他们的研究方法是什么？ (回答：略。)
导入：他们的研究方法有观察法、调查法、分类法、文献法、实验法。这就是生物学研究的基本方法，而其中实验法是现代生物学研究的重要方法。那么实验法包括哪些内容呢？ 阅读书P27——28，看看科学家们对提出的问题是如何分析，进行实验的，在阅读过程中注意思考这么几个问题：①这个实验要解决什么问题？②科学家们做出了什么样的假设？ ③这个假设是根据什么做出的或者说在作假设前科学家都做了哪些工作？④实验中人为控制的条件是什么？⑤为什么要强调多次重复以上的实验？（同学们边回答教师边讲解，加深同学们的认识。） 结合影片，师生共同完成下表； 响尾蛇是如何追寻它放走的猎物的 着事先设 ：将一只没有被响尾蛇袭击过的死老鼠，沿着事先设定的弯曲路径， 进行实验，观察到响尾蛇的头缓慢地左右移动，同时它的舌迅速
第三章 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜 的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微 小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍 数 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二）主要电镜制样技术介绍
第二章细胞生物学研究方法 一、名词解释 1、resolution：分辨力是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小距离的能力。能够区分的两点间的距离越小，表示分辨力越高。 2、显微结构：通过光学显微镜所观察到的样品的各种结构，如细胞的大小、外部形态以及细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体等内部构成都属于显微结构。 3、超微结构：也称亚显微结构。指在电子显微镜下所观察到的细胞结构，如细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体、核糖体、微管、微丝等细胞器的微细结构。 4、细胞培养：指活细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞、模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。 5、原代培养：指从机体组织中取材后接种到培养基中所进行的细胞培养，即直接取材于机体的细胞培养。所形成的细胞称原代细胞，它是在体外培养任何一种体细胞所必须经历的阶段和传代培养的基础。 6、传代培养：指当原代培养的细胞在培养瓶中生长、增殖到一定密度后，一分为二或以其他比例分装或转移到2个以上的培养瓶中所进行的再培养。 7、细胞融合：又称为细胞杂交，指细胞彼此接触时，2个或2个以上的细胞合并成为一个细胞的现象。 8、cell line ：原代培养首次传代成功后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力，能持续生存的细胞系，则称为连续细胞系或无限细胞系。 二、选择题 【A1型题】 1、A； 2、B； 3、B； 4、A； 5、C； 6、D； 7、A； 8、D； 9、C；10、D；11、C；12、A；13、A；14、B； 15、C；16、A；17、E；18、A；19、C；20、D；21、C；22、E；23、A；24、D；25、B；26、E 【A2型题】 1、E； 2、D； 3、C； 4、D； 5、A； 6、B； 7、C； 8、D； 9、D；10、A 【X型题】 1、ACE； 2、CDE； 3、AE； 4、CE； 5、ABCD； 6、ABC； 7、ABCED； 8、ACD； 9、ABCD 三、填空题 1、普通显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜 2、照明系统光学放大系统机械装置系统 3、电子照明系统电磁透镜成像系统真空系统记录系统电源系统 4、物镜和照明系统的位置颠倒 5、扫描电子显微镜透射电子显微镜 6、0.1μm 0.1mm 3nm 7、差速离心法密度梯度离心法 8、0.2μm R=0.61λ／N.A. N.A.=n·sinα／2 9、细胞化学法荧光细胞化学和免疫荧光镜检术放射自显影技术细胞显微分光光度测定技术流式细胞计量术细胞组分的分级分离法 10、冰冻蚀刻 11、原代培养传代培养 12、单层生长形态变成多态性具有接触抑制现象 13、体外环境不能与体内的条件完全等同 四、判断题 1、√； 2、×； 3、√； 4、×； 5、√； 6、×； 7、√； 8、√； 9、√；10、×；11、√；12、×；13、×；14、×
一、章（节、目）授课计划第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
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二、课时教学内容第页 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大 的作用。没有 显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。 第一节细胞形态结构的观察方法 一、有关显微镜的一些概念 （1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）． 其中λ为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
α=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。 例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： GAGGAGAGGAFFFFAFAF
一、显 微成像技术 （一）普通光学显微镜 ?1.构成： ?①照明系统 ?②光学放大系统 ?③机械装置 ?2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。 ?3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 ?光学显微镜的分辨力R=0.61λ/N．A． ?其中λ为入射光线波长； ?N．A．为镜口率＝ｎs i nα/2； ?n=介质折射率； ?α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。 2、常用的光学显微镜 ?（1）普通双筒显微镜有较强的立体感。 ?（2）荧光显微镜：研究细胞内物质的吸收、运输、 及化学物质的分布及定位以紫外为光源。 ?（3）相差显微镜，观察无色、透明、活细胞中的 结构（未经染色的活细胞）产生明暗差异 ?（4）暗视野显微镜：观察未经染色的活体或胶体 粒子适合观察细胞核、线粒体、细菌、霉菌等。 ?（5）倒置显微镜培养细胞观察03年选择题 倒置显微镜i n v e r s e m i c r o s c o p e ?物镜与照明系统颠倒； ?用于观察培养的活细 胞，通常具有相差或 D I C物镜，有的还具有 荧光装置。 ?学习重点： ?1.光学显微技术中要掌握几种常用显微镜成像的基本原理,包括 普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微 镜、倒置显微镜。掌握电子显微镜的原理和样品制备方 法，以及和光学显微镜的差别． ?２.掌握酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、细胞分选技 术的原理 ?３.了解细胞培养和细胞融合、细胞生物反应器、染色体转 移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养 ?4.离心分离技术 ?这一章每年都有真题出现，大部分以填空，选择和判断的 题型出现，总体看来，题目难度在下降，但是实际应用的能力 越来越看重，07、08年就近30分的考题第二章：细胞生物学研究方法
一．学习目标：（重难点） 1.初步认识生物 2.区别生物和非生物 3.说出生物特征 能力目标：通过积极主动参与讨论培养学生观察、区别能力和发散思维能力。 情感目标：、通过“生物的生命现象”的讨论，培养学生热爱大自然和关爱生物的良好品质。 二．预习导学：（学一学） 阅读课本相关内容，小组合作填空： 1、显微镜的反光镜有平面和凹面，光线强时用 _____ 面镜，光线弱时用 _____ 面镜。 2、遮光器的上面有大小不等的圆孔，叫做，光线弱的时候用。 3、显微镜的物镜分高倍镜和低倍镜，从外观来看，短而粗的是，长而细的是。初中阶段，一般只需要使用。 4、转动时，可以大幅度升降镜筒；转动时，镜筒升降幅度较小，可以使物像更清晰。 5、物象的放大倍数= 乘以。 三．预习收获和障碍： 科学观察可以直接用__________，也可以借助_______、__________等仪器，或利用__________等工具，有时还需要_________________。 四．合作交流议一议： （一）预习交流（处理预习中的问题） 1．写出显微镜的各结构名称（图②）： ①___________ ②___________ ③___________ ④___________ ⑤___________⑥___________ ⑦___________ ⑧___________ ⑨___________ ⑩___________⑾___________ ⑿___________ ⒀___________ 2．写出下列实验器材的名称（图①）： 图①图② （二）课堂研讨（展示才能说一说，先练后展） 仔细观察教师的演示实验，说出下列实验器材的正确用 法： 1、试管夹夹试管时应从试管底部往上套，夹在试管的 _______。 2、酒精灯的灯焰分为外焰、内焰、焰心，___________ 温度最高。灯帽拿下应正放在桌上，熄灭酒精灯时用_______。 3、试管和烧杯，可直接加热的是___________，需垫上 石棉网的是___________。 4、给试管内液体加热时：液体的体积不能超过试管容积 的___________；加热时，试管应倾斜（与桌面成45），加热 过程中应不时___________移动试管，管口不能对着______。 五．反思提升（想一想） 下列关于科学观察的说法，不正确的是（） A．科学观察是科学探究的一种基本方法 B．科学观察必须借助有关用具才能进行 C．观察时要全面、细致和事实就是，并及时记录下来 D．观察时要积极思考，多问几个为什么 六．课堂检测（小试牛刀做一做） 1、显微镜的物镜是40x，要观察放大600倍的物像，应 选用的目镜是（） A．20× B.15× C．10× D.5× 2、用显微镜观察洋葱表皮细胞装片的同一部位，下列哪 种目镜和物镜的组合，在视野中所看到的细胞数目最多（） A．目镜10×；物镜10× B.目镜10×；物镜40× C．目镜15×；物镜10× D.目镜5×；物镜40× 3、在光线条件比较差的实验室内使用显微镜时，应 该（） A. 调大光圈，用平面反光镜 B．调大光圈，用凹面反光镜 C．调小光圈，用平面反光镜 D．调小光圈，用凹面反光镜 4、使用普通光学显微镜时，转动下列哪个结构，能较大 范围地升降镜筒（） A．转换器 B．遮光器 C．粗准焦螺旋 D．细准焦螺旋 5、图②是显微镜结构图，请据图回答： （1）用来调节光线强弱的结构是［］和［］。 （2）转动时，镜筒升降幅度很小的结构是［］。 （3）接近玻片标本的镜头是［］。 （4）光线经过反光镜反射后进入镜筒，我们能通过目镜 观察到物像。光线经过显微镜的［］、［］、 ［］、［］、［］这几个部件。 自我评价：教师评价：日期：陇县城关镇中学“导学案”设计稿 七年级班姓名：科目：生物课题：《生物学研究的基本方法》课型：主备人：雷满仓审核：组名：
第二节《生物学研究的基本方法》教案（北师大版初 一上） (2) 〖教学目标〗 1.知识： 能讲出实验法的差不多步骤。 2.能力： 〔1〕通过提出假设和设计实验方案，尝试科学探究的一样方法。 〔2〕通过阅读材料猎取和处理信息。 3.情感态度与价值观： 〔1〕在讨论中，体验用实验法进行科学探究的过程，逐步形成严谨、实事求是的科学态度； 〔2〕在小组活动中，学会交流与表达，学会与他人合作。 〖设计思路〗 〔一〕课堂教学设计关键点 1.创设咨询题情境； 2.学生通过观看提出感爱好的咨询题； 3.利用已有知识对咨询题做出讲明〔假设〕； 4.通过阅读〝阅读资料〞，对前面的讲明〔假设〕进行分析，最终确定一个〔或两个〕假设； 5.小组讨论实验方案，证实假设； 6.总结归纳〝实验法〞的差不多过程。 〔二〕课堂教学设计讲明
本节教学的课题是：生物学研究的差不多方法――实验法。在前一节课学生差不多通过阅读、讨论明白了生物学是一门探究的科学，同时也初步了解了林奈、达尔文、哈维等学者在研究生物学过程中所用的方法。本节课是要通过一个具体实例――探究〝响尾蛇通过什么追踪中毒的猎物〞，让学生了解并总结出生物学最常用的方法――实验法实施的差不多过程。此方法将为以后开展探究性学习活动奠定基础。 整个教学过程中，通过观看录像、阅读材料、讨论设计实验等活动充分发挥学生学习的主体性，不仅让学生获得〝实验法〞的知识，也锤炼学生的观看、思维、表达、处理信息、协作等能力。具体设计过程如下： 为引起学生的学习爱好，课一开始便为学生创设一个咨询题情境――节选三小段蛇与鼠的片段，分不讲述皮尔斯蛇在狭长的洞穴里追踪老鼠；响尾蛇〔一种毒蛇〕面对近在咫尺的老鼠只是不停地伸缩舌头；加彭蛇〔一种毒蛇〕张开大嘴咬住老鼠，又让中毒的老鼠逃脱。 在学生为三只小老鼠的命运感到担忧的时候，好奇心也定会油然而生，自然就过渡到了下个教学环节――由学生提出感爱好的咨询题。在确信学生咨询题多样化的基础上，确定或提出〔如学生没有提出，教师可引导提出〕本节课要研究的咨询题：响尾蛇通过什么来追踪中毒的猎物？ 许多学生有着丰富的课外知识，这时他们头脑中差不多在对咨询题作出讲明了，不妨让大伙儿一起交流，请学生把可能的讲明都讲出来。那么到底哪个学生的讲明更合理呢？答案由学生自己查找――先阅读教师事先整理出的〝响尾蛇〞资料〔里面要紧介绍了响尾蛇的各种感受〕，再小组讨论，汇报结果。 在交流的基础上，确定一个或两个学生认为合理的假设，教师应指出科学是讲求证据的，以上假设只是同学们的推理，继而引出〝如何样才能证明假设是否成立呢？〞过渡到下一个环节――学生分组讨论设计实验方案。教师现在引导学生结合前面做过的〝探究温度对霉菌的阻碍〞实验进行设计，应尽可能多地参与各组讨论并提出建议。 接着由学生汇报实验设计，在交流的过程中，不断修改完善，教师在充分确信学生设计的基础上，将课本中研究者的实验过程和看到的现象介绍给学生，引导学生发觉研究者与自己设计的不同，认识到实验设计和实施过程中应该注意的咨询题：如设置对比实验；对比组和实验组的实验条件只能有唯独不同；实验应重复多次以减少误差等。 最后回忆一节课所做的工作，由学生对整个学习过程进行归纳总结，得出实验法的差不多过程。即：通过观看发觉并提出咨询题；收集与咨询题相关的资料；做出假设；设计实验；实施实验，记录实验现象；分析实验结果，得出结论。 〖学校及学生状况分析〗
2.细胞生物学研究方法 生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验得以发现和发展的。方法上的突破，对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。 2.1显微成像技术 最早的光学显微镜是1590年Z.J a n s s en和他的侄子H.J a n s s e n共同研制的。其后，R o b e r t H o o k e和An t o n i e v a n L e e u we n h o e k对光学显微镜的分辨本领进行了极大的改进，由此发现了细胞。 20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命，使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞(图2-1)。 图2-1光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构 2.1.1光学和电子显微镜成像原理
不管是何种显微镜，镜像的形成都需要三个基本要素:①照明系统，②被观察的样品，③聚焦和成像的透镜系统(图2-2)。 图2-2光学和电子显微镜的基本结构 在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。 照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素，因为波长决定能被检测样品的最小极限。波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到的物体极限就越大(图2-3)。
图2-3波的移动、波长和干扰
●光学和电子显微镜成像的光学原理是相同的，其中最重要的是光子和电子都具有波的行为。当光子和电子穿过透镜到达聚焦点时，由于波的干涉(i n t e r fe r e n c e)性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是通过透镜波的干涉累加或消除，即衍射(d i ffr a c t i o n)的结果。 ●焦距与角孔径 焦距(fo c a l l e n g t h)是透镜的中心平面到焦点的距离(图2-4)，而角孔径(a n g u l a r a p e r t u r e)是光从样品进入显微镜的物镜半角α(图2-5)，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，最好的光学显微镜的角孔径大约是700。 图2-4透镜的焦距
新人教高中生物科学研究方法汇总 1 模型方法（生物1§3－3（在必修生物①、第三章、第三节，以下同））人们为了某种特定目的而对认识对象所作的一种简化的概括性描述。这种描述可以是定性的，也可以是定量的。有的借助于具体的形势或其他形象化的手段，有的则通过抽象的形式来表达。 1.1 常用模型类型： 1.1.1物理模型：（生物1§3－3）以实物或图画直观地表达所认识对象的特征。最常见的莫过于我们教材上的生物结构图、示意图了，还有一些人工构建的实体模型。如：制作DNA双螺旋结构模型；真核生物细胞的三维结构模型等。需要注意的是：科学性、准确性应该是第一位的，其次才是模型的美观与否；生物照片包括实物照片、显微照片等不是物理模型。 1.1.2概念模型：以抽象文字或化学方程式等形式来表达一个实体的功能，如光合作用的概念和反应式；或以分枝状或圆圈来说明生物知识之间的关系。如每章自我检测题的画概念图部分。 1.1.3数学模型：（生物3§4－2）数学模型是用来描述一个系统或它的性质的数学形式。常见两种：①曲线图：如种群增长的“J”型曲线和“S”型曲线，DNA、RNA、染色体的数目变化的坐标曲线。优点：形象、直观。②数学公式：如“J”型增长模型，t年后，种群数量为：Nt＝№λt 。优点：比较准确。 1.2 优点：将复杂的内容简单化，将抽象的内容具体化，培养学生的直觉、形象思维。 2 类比－推理（生物2§2－2） 2.1例如:19世纪美国遗传学家萨顿以蝗虫作为研究对象，将看不见的基因与看得见的染色体行为进行类比，根据其惊人的一致性，提出了基因位于染色体上的著名假说。但其正确与否，还需要做进一步验正。如在萨顿之后美国生物学家摩尔根用果蝇做实验材料，将控制白眼性状的基因与X染色体联系起来，用实验证明了萨顿假说的正确性。